Download Functions, catalytic mechanism and regulation of Echinococcus

Functions,
catalytic
mechanism
and
regulation of Echinococcus granulosus
Thioredoxin-Glutathione Reductase
Funciones,
mecanismo
catalítico
y
regulación de la Tiorredoxina-Glutatión
Reductasa de Echinococcus granulosus
Lic. Mariana Bonilla
Tesis de doctorado en Ciencias Biológicas
PEDECIBA
Orientador: Dr. Gustavo Salinas - Co-orientadora: Dra. Ana Denicola
Cátedra de Inmunología, Facultad de Química y Facultad de Ciencias
Universidad de la República
Diciembre de 2011
A Mateo
RESUMEN
Varios procesos celulares esenciales dependen de la homeostasis del estado redox intracelular. En la mayoría de los
organismos dos sistemas redox enzimáticos basados en tioles, el sistema de la tiorredoxina (Trx) y el sistema del
glutatión (GSSG, forma oxidada; GSH, forma reducida), desempeñan un papel central en mantener un suministro
adecuado de equivalentes de reducción a procesos celulares claves y a las defensas antioxidantes. Los platelmintos
parásitos, que constituyen un importante problema de salud en los países en desarrollo, tienen un arreglo único y
simplificado de estas rutas. En contraste con sus hospedadores y con sus contrapartes de vida libre, estos organismos
carecen de tiorredoxina reductasa (TR) y glutatión reductasa (GR) convencionales. En su lugar, poseen sistemas TrxGSH ligados: una sola enzima, conocida como tiorredoxina-glutatión reductasa (TGR), es responsable de la reducción de
Trx y GSSG. Esta enzima es una fusión natural de un dominio glutarredoxina (Grx) a dominios TR que poseen un centro
redox C-terminal que contiene selenocisteína (Sec). Se ha probado que la TGR es esencial para estos parásitos y se la ha
validado como un nuevo blanco de drogas para las infecciones causadas por platelmintos.
En esta tesis hemos profundizado en la caracterización de los sistemas Trx-GSH ligados en Echinococcus
granulosus (un platelminto parásito y agente causal de la echinococcosis quística), centrándonos en las funciones,
mecanismo catalítico y regulación de la TGR de E. granulosus (EgTGR). Uno de los hallazgos principales de este trabajo
fue la demostración de que la EgTGR posee actividad deglutationilasa independiente de GSH (puede catalizar la
reducción de disulfuros mixtos glutatión-péptido usando un dador de electrones distinto del GSH), lo cual confiere una
ventaja a este singular arreglo redox. Además, establecemos claramente un rol esencial del residuo de Sec en todas las
actividades de la enzima, y determinamos que mientras que la actividad TR de la EgTGR sólo depende de sus dominios
TR, sus actividades deglutationilasa y GR son mediadas por su dominio Grx a través de un mecanismo monotiólico, en
el cual el intermediario glutationilado de la enzima es resuelto por el centro redox C-terminal de los dominios TR. Otros
autores han descrito un fenómeno inusual y aún no bien comprendido de la TGR: el GSSG dispara un comportamiento
histerético (inhibición temporal) en la actividad GR de la TGR, que es más pronunciado a altas concentraciones de GSSG
y bajas concentraciones de TGR, y es reducido por el GSH de modo dependiente de la concentración. Encontramos que
las EgTrxs también reducen la histéresis y probamos que, como para la actividad GR, la actividad deglutationilasa de la
TGR se encuentra inhibida a altas concentraciones de GSSG. Basados en las correlaciones entre la
glutationilación/deglutationilación de residuos de cisteína (Cys) y la histéresis, en el hecho de que la histéresis está
drásticamente reducida en una mutante que carece de la Cys de resolución en el centro redox del dominio Grx, y en la
participación de la enzima en su propia reactivación, proponemos que la glutationilación/deglutationilación de la Cys
resolutiva del centro redox del dominio Grx es un proceso crucial en el fenómeno observado, regulando la actividad del
dominio Grx. Es importante señalar, a su vez, que demostramos que la actividad TR de la TGR se preserva a altas
concentraciones de GSSG y que las EgTrxs pueden llevar a cabo la reducción de GSSG y la deglutationilación bajo estas
condiciones. Por tanto, existen vías de rescate tanto para la reducción de GSSG como para la deglutationilación a través
de los dominios TR de la TGR y las Trxs. Finalmente, otro hallazgo central de este trabajo fue la demostración de que
existen sistemas Trx-GSH ligados funcionales en los compartimentos citosólico y mitocondrial en este parásito.
Globalmente, estos resultados sugieren que la TGR es no sólo una enzima esencial en el metabolismo de estos
parásitos, sino también un dispositivo enzimático muy sofisticado sujeto a, e involucrado en, la regulación metabólica.
ABSTRACT
Essential cellular processes depend on the homeostasis of the intracellular redox state. In most organisms two major
thiol-based redox enzymatic systems, the thioredoxin (Trx) system and the glutathione (GSSG, oxidized form; GSH,
reduced form) system, serve a central role in maintaining an adequate supply of reducing equivalents to key cellular
processes and antioxidant defenses. Platyhelminth parasites, which constitute a major health problem in developing
countries, have a unique and simplified array of these routes. In contrast to their hosts and to their free-living
counterparts, these parasites lack conventional thioredoxin reductase (TR) and glutathione reductase (GR). Instead,
they have linked Trx-GSH systems: a single enzyme, known as thioredoxin-glutathione reductase (TGR), is responsible
for Trx and GSSG reduction. This enzyme is a natural fusion of a glutaredoxin (Grx) domain to TR domains having a Cterminal redox center that contains selenocysteine (Sec). TGR has been shown to be essential for these parasites and it
has been validated as a novel drug target for platyhelminth infections.
This thesis has provided insights on the characterization of the linked Trx-GSH systems in Echinococcus
granulosus (a platyhelminth parasite and the causative agent of cystic echinococcosis), focusing on the functions,
catalytic mechanism and regulation of E. granulosus TGR (EgTGR). A major finding of this work was the demonstration
that EgTGR possesses GSH-independent deglutathionylase activity (it can catalyze the reduction of glutathione-peptide
mixed disulfides using an electron donor different from GSH), which confers an advantage to this peculiar redox array.
Furthermore, we clearly establish an essential role for the Sec residue at the C-terminal redox center in all enzyme
activities, and determine that while the TR activity of EgTGR only depends on its TR domains, its deglutathionylase and
GR activities are mediated by its Grx domain by a monothiolic mechanism, in which the glutathionylated enzyme
intermediate is resolved by the C-terminal redox center of the TR domains. Other authors have described an unusual
and yet not completely understood phenomenon of TGR: GSSG triggers a hysteretic behavior (time-dependent
inhibition) on the GR activity of TGR, which is more pronounced at high GSSG and low TGR concentrations, and relieved
by GSH in a concentration-dependent manner. We found that EgTrxs also relieved hysteresis and demonstrate that, as
for the GR activity, the deglutathionylase activity of TGR is inhibited at high GSSG concentrations. Based on the
correlations between glutathionylation/deglutathionylation of cysteine (Cys) residues and hysteresis, on the fact that
hysteresis is drastically reduced in a mutant lacking the resolving Cys at the Grx domain´s redox center, and on the
involvement of the enzyme in its own reactivation, we propose that glutathionylation/deglutathionylation of the
resolving Cys in the Grx domain’s redox center is a crucial proccess in the the observed phenomenon, regulating the
activity of the Grx domain. Importantly, we demonstrate that TGR’s TR activity is preserved at high GSSG
concentrations and that EgTrxs can support GSSG reduction and deglutathionylation under these conditions. Therefore,
rescue pathways for both GSSG reduction and deglutathionylation are provided through the TR domains of TGR and
Trxs. Finally, another central finding of this work was the demonstration that functional Trx-GSH systems exist in the
cytosolic and mitochondrial compartments in this parasite. Overall, these results suggest that TGR is not only an
essential enzyme in the parasites’ metabolism, but also a very sophisticated enzymatic device subject to, and involved
in, metabolic regulation.
LIST OF ABBREVIATIONS
cEgTrx
DTNB
DTT
EgTGR
EgTGRWT, EgTGRGCUG
EgTGRGC*
EgTGRGCCG
EgTGRC31S
EgTGRC34S
EgTGRGUCG
EgTRGCUG, Grx-less EgTGR
FhTGR
GFP
GLO
GPx
GR
Grx
GSH
GSSG
GST
H2O2
HED
iNOS
mEgTrx
Msr
.NO
NTDs
.O2
ONOO
PAMPS
PCS
PDI
Prx
Pr-S-S-G
Pr-S-S-Pr
p-S-S-G
RNS
ROS
RR
RSOH
RSO2
RSO3
RSeOH
RSeO2
RSeO3
Sec, U
SECIS
SmTGR
SOD
TcTGR
TGR
TR
Trx
cytosolic thioredoxin isoform from Echinococcus granulosus
5,5-dithiobis(2-dinitrobenzoic acid)
dithiothreitol
Echinococcus granulosus TGR
wild-type Echinococcus granulosus TGR
TGR mutant truncated at the Sec residue of the C-terminal redox center
TGR mutant carrying a Sec596 to Cys mutation
TGR mutant carrying a Cys31 to Ser mutation
TGR mutant carrying a Cys31 to Ser mutation
TGR mutant carrying a Cys595to Sec and a Sec596 to Cys mutation
TGR mutant lacking the Grx domain
Fasciola hepatica TGR
green fluorescent protein
glyoxalase
glutathione peroxidase
glutathione reductase
glutaredoxin
reduced glutathione
oxidized glutathione
glutathione S-tranferase
hydrogen peroxide
2-hydroxyethyl disulfide
inducible nitric oxide synthase
mitochondrial thioredoxin isoform from Echinococcus granulosus
methionine sulfoxide reductase
nitric oxide radical
neglected tropical diseases
superoxide radical anion
peroxynitrite anion
pathogen associated molecular patterns
phytochelatin synthase
protein disulfide isomerase
peroxiredoxin
glutathione-protien mixed disulfide
protein disulfide
glutathione-peptide mixed disulfide
reactive nitrogen species
reactive oxygen species
ribonucleotide reductase
sulfenic acid
sulfinic acid
sulfonic acid
selenenic acid
seleninic acid
selenonic acid
selenocysteine
selenocysteine insertion sequence
Schistosoma mansoni TGR
superoxide dismutase
Taenia crassiceps TGR
thioredoxin-glutathione reductase
thioredoxin reductase
thioredoxin
TABLE OF CONTENTS
1. INTRODUCTION
1
1.1 PLATYHELMINTH PARASITES:
MODEL ORGANISMS TO STUDY THE SYSTEMS INVOLVED IN REDOX HOMEOSTASIS
1.2 INFECTIONS BY PLATYHELMINTH PARASITES:
AN ENORMOUS BURDEN TO DEVELOPING COUNTRIES
1.3 OXIDANT SPECIES AND ANTIOXIDANT DEFENSES IN PARASTIC PLATYHELMINTHS:
A FIRST VIEW
1.4 THE THIOREDOXIN AND GLUTATHIONE SYSTEMS
1. 5 LINKED THIOREDOXIN-GLUTATHIONE SYSTEMS IN PARASITIC PLATYHELMINTHS
1.6 THE PRIMARY STRUCTURE OF THIOREDOXIN -GLUTATHIONE REDUCTASE:
TGR IS A SELENOENZYME
1. 7 WHY DO SELENOPROTEINS USE SELENOCYSTEINE INSTEAD OF CYSTEINE?
1.8 TGR IS AN ESSENTIAL ENZYME IN THE METABOLISM OF PLATYHELMINTH PARASITES
1.9 TGR AS A DRUG TARGET
1. 10 EXISTING EVIDENCE ON TGR FUNCTIONS AND MECHANISM
1. 11 OPEN QUESTIONS ON TGR FUNCTIONS AND MECHANISM
2. AIMS OF THIS THESIS
GENERAL AIM
SPECIFIC AIMS
1
1
3
7
7
10
10
15
17
19
22
25
25
25
RESULTS AND DISCUSSION
26
3. PAPER I
26
4. PAPER II
26
5. HYSTERESIS REVISITED
27
5.1
5.2
5.3
5.4
5.5
5.6
5.7
5.8
5.9
27
29
31
34
37
377
39
411
42
HYSTERETIC BEHAVIOR IN ENZYMES
THE FIRST INDICATIONS OF HYSTERESIS IN EGTGR
EGTGR HYSTERETIC BEHAVIOR OCCURS AT HIGH GSSG CONCENTRATIONS
EGTGR HYSTERETIC BEHAVIOR IS OBSERVED AT LOW ENZYME CONCENTRATIONS
GSH CAN ABOLISH EGTGR HYSTERETIC BEHAVIOR
TRXS CAN ALSO ABOLISH HYSTERESIS IN EGTGR
EGTGR HYSTERESIS PERSISTS AFTER GSSG REMOVAL
THE TR ACTIVITY OF TGR IS NOT AFFECTED BY PRETREATMENT OF THE ENZYME WITH GSSG
HYSTERESIS CORRELATES TO GLUTATHIONYLATION/DEGLUTATHIONYLATION OF CYSTEINE RESIDUES
5.10 FIRST DRAFT FOR A MECHANISM BEHIND HYSTERESIS
5.11 EGTGR HYSTERESIS IS DRASTICALLY ATTENUATED BY THE MUTATION OF THE RESOLVING CYSTEINE
(CYS34) IN THE GRX DOMAIN’S REDOX CENTER
5.12 ADDITIONAL SURPRISES
5.13 WHAT CAN BE LEARNT FROM THE DEPENDENCE OF THE HYSTERETIC BEHAVIOR ON PH?
5.14 REFORMULATING OUR MODEL FOR HYSTERESIS IN EGTGR
EXPERIMENTAL PROCEDURES
466
49
49
54
57
6. GENERAL DISCUSSION AND CONCLUSIONS
59
6.1 THE EXISTENCE OF FUNCTIONAL LINKED SYSTEMS IN MITOCHONDRIA AND CYTOSOL
6.2 FURTHER CHARACTERIZATION OF TGR FUNCTIONS AND MECHANISM
6.2 A. THE DEGLUTATHIONYLASE ACTIVITY OF TGR
6.2 B THE ROLE OF TGR DOMAINS AND OF THE SEC RESIDUE IN TGR FUNCTIONS
6.2 C THE MECHANISM FOR THE GRX DOMAIN DEPENDENT ACTIVITIES
6.3 TGR HYSTERESIS
6.3 A FURTHER CHARACTERIZATION AND INVESTIGATIONS ON THE MECHANISM
6.3 B WOULD HYSTERESIS EVER OCCUR IN VIVO?
6.3 C WOULD HYSTERESIS BE PHYSIOLOGICALLY RELEVANT?
6.3 D ALTERNATIVE PATHWAYS FOR GSSG REDUCTION AND DEGLUTATHIONYLATION
6.3 E WHAT WOULD THE PHYSIOLOGICAL CONSEQUENCES OF HYSTERESIS BE?
6. DISCUSION GENERAL Y CONCLUSIONES (VERSIÓN EN ESPAÑOL)
44
59
60
60
63
65
68
68
70
71
72
73
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6.1 LA EXISTENCIA DE SISTEMAS LIGADOS FUNCIONALES EN LA MITOCONDRIA Y EN EL CITOSOL
6.2 CARACTERIZACIÓN ADICIONAL DE LAS FUNCIONES Y MECANISMO DE LA TGR
6.2 A. LA ACTIVIDAD DEGLUTATIONILASA DE LA TGR
6.2 B EL ROL DE LOS DOMINIOS Y DEL RESIDUO DE SEC DE LA TGR EN SUS FUNCIONES
6.2 C EL MECANISMO PARA LAS ACTIVIDADES DEPENDIENTES DEL DOMINIO GRX
6.3 LA HISTÉRESIS DE LA TGR
6.3 A CARACTERIZACIÓN EN PROFUNDIDAD Y ESTUDIO DEL MECANISMO
6.3 B ¿OCURRIRÁ LA HISTÉRESIS IN VIVO BAJO ALGUNA CIRCUNSTANCIA?
6.3 C ¿TENDRÁ LA HISTÉRESIS RELEVANCIA FISIOLÓGICA?
6.3 D VÍAS ALTERNATIVAS PARA LA REDUCCIÓN DE GSSG Y LA DEGLUTATIONILACIÓN
6.3 E ¿CUÁLES SERÍAN LAS CONSECUENCIAS FISIOLÓGICAS DE LA HISTÉRESIS?
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83
86
86
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91
92
REFERENCES
96
ACKNOWLEDGMENTS/AGRADECIMENTOS
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