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Polimorfismo c677t del gen de la enzima metilentetrahidrofolato reductasa
(mthfr) y niveles de homocisteina en pacientes con sindrome coronario agudo
Metilenetetrahydrofolate reductase (mthfr) c677t
polymorphism and homocystein levels in patients with coronary syndrome
Nelsy Loango1,2 Daisy Johana Lozano3, José Henry Osorio4, Patricia Landazuri2
Recibido: Octubre 29 de 2008
Aceptado: Diciembre 1 de 2008
RESUMEN
Objetivo: Evaluar los niveles de homocisteína total (HcyT) y folato plasmáticos así, como su relación con el polimorfismo
C677T de la methylenotetrahidrofolato reductasa (MTHFR) en sujetos colombianos con enfermedad cardiovascular y en
sujetos control.
Métodos: HcyT, folato y el polimorfismo C677T de la MTHFR fueron evaluados en 50 hombres saludables tomados como
controles (edad 35-60 años), y 50 pacientes de la misma edad con un primer evento coronario. Se estudió la frecuencia
alélica y genotípica del polimorfismo C677T usando PCR y análisis de polimorfismos de longitud de fragmentos de
restricción.
Resultados: la frecuencia del genotipo TT fue 10,2% en el grupo de pacientes y 22% en el grupo control. No se encontró
diferencia significante en la frecuencia del genotipo TT entre los grupos de estudio. Los individuos homocigotos para el
alelo T tuvieron niveles de homocisteína significantemente más altos en presencia de bajos niveles de folato,
comparados con los individuos con el alelo homocigoto C.
Conclusión: la prevalencia del polimorfismo C677T no difiere entre los individuos con enfermedad cardiovascular (ECV) y
aquellos sin la presencia de la enfermedad. Sin embargo, elevados niveles de HcyT están asociados con el genotipo
homocigoto TT.
Palabras clave: Homocisteína, MTHFR, folato, enfermedad coronaria.
ABSTRACT
Objective: To evaluate the plasma homocysteine (tHcy) and folate levels as well as the methylenetetrahydrofolate
reductase (MTHFR) C677T mutation in Colombian subjects with cardiovascular disease (CAD) and control subjects.
Methods: Fasting total homocysteine and the MTHFR C677T mutation were evaluated in 50 healthy control males (age
35-60 years), and 50 age matched male patients with myocardial infarction. The prevalence of the C677T was studied
using PCR and restriction fragment length polymorphism analysis.
Results: The frequency of the TT genotype was 10.2% in the patient group compared with 22 % in the healthy controls.
There was no significant difference in the occurrence of the TT genotype between the studied groups. Individuals
homozygous for the 677T allele had significantly increased fasting tHcy, particularly in the presence of low folate,
compared with individuals homozygous for the wild-type allele.
Conclusion: The prevalence of the C677T polymorphisms did not differ among individuals with CAD, or those without
documented vascular disease. However, elevated plasma tHcy level is associated with homozygous TT individuals.
Key word: Homocysteine, MTHFR, folate coronary heart disease
INTRODUCCION.
L
a homocisteína (Hcy) es un aminoácido
derivado de la desmetilación de la metionina
proveniente de la dieta y los pacientes con
defectos hereditarios del metabolismo de la
1
2
3
4
metionina pueden desarrollar hiperhomocisteinémia (HHcy) y aterotrombosis prematura. Los
mecanismos por los cuales ocurren estas
enfermedades no son claros e incluyen la toxicidad
endotelial, la oxidación acelerada del colesterol y
reducción de la vasodilatación mediada por flujo
(1,2)
Facultad de Ciencias Básicas, Programa de Biología. Universidad del Quindío.
Grupo de Investigación en Enfermedades Cardiovasculares y Metabólicas. Laboratorio de Bioquímica y Genética. Facultad de Ciencias de la Salud.
Universidad del Quindío.
Facultad de Educación, Programa de Licenciatura en Biología. Universidad del Quindío.
Grupo de Investigación Biosalud. Laboratorio de Patología Molecular. Departamento de Ciencias Básicas de la Salud. Universidad de Caldas
Correspondencia: Nelsy Loango. Universidad del Quindío, Facultad de Ciencias Básicas. Carrera 15 Calle 12 Norte. e-mail:
[email protected]
rev. invest. univ. quindio (18): 231-236. Armenia - Colombia
- 232 - Polimorfismo C677t del gen de la enzima mthfr
Recientes estudios epidemiológicos (3) muestran
que los niveles plasmáticos moderados de
homocisteína son de alta prevalencia en la
población en general y se asocian con un incremento
de riesgo de enfermedad cardiovascular fatal y no
fatal, independiente de otros factores de riesgo
clásicos. Varios estudios retrospectivos y de casos y
controles muestran asociación positiva entre los
niveles de homocisteína y la aparición de
enfermedad ateroesclerótica; en promedio
individuos con niveles por encima de 15 umol/litro
tiene un riesgo relativo de 1.5 a 2 veces mayor de
sufrir aterotrombosis que los individuos
normales(4-8)
La enzima metilenotetrahidrofolato reductasa
(MTHFR) convierte el 5,10-metileno
tetrahidrofolato a 5-metiltetrahidrofolato,
requerido para la conversión de homocisteína a
metionina. Existe un polimorfismo común de esta
enzima en humanos, cuya variación genética
presenta la sustitución de C por T en la base 677 del
gen (C677T) el cual cambia el aminoácido alanina
por valina en posición 222 de la enzima (A222V). La
mayoría de los estudios muestran que los individuos
con genotipo TT de este polimorfismo tienen
reducida actividad enzimática y altos niveles de
homocisteína, (9-14) aunque discrepan de si este
aumento confiere o no un riesgo cardiovascular
(15,16). La elucidación de alguna relación entre el
polimorfismo C677T y el riesgo cardiovascular
podría ser informativo con respecto a la hipótesis
que las concentraciones de homocisteína
desempeñan un papel causal en la ocurrencia de las
ECV.
Dado que en nuestro medio no se tiene
conocimiento sobre el comportamiento de estos
nuevos marcadores de enfermedad cardiovascular,
este trabajo pretendió establecer la relación que
existe entre niveles de homocisteína, ácido fólico,
polimorfismo C677T del gen de la MTHFR y el riesgo
cardiovascular.
METODOLOGIA.
Diseño del estudio.
En el estudio participaron 49 pacientes con
síndrome coronario agudo, llamados casos (28
hombres y 21 mujeres), y 50 individuos llamados
controles (25 hombres y 25 mujeres) con similar
edad e índice de masa corporal (IMC). El tamaño de
la muestra fue condicionada al número de casos que
ingresaron de manera consecutiva al hospital
Universitario San Juan de Dios de Armenia en un
periodo de 9 meses (Febrero-Octubre), con angina
estable o inestable, o con síntomas agudos de
infarto del miocardio con o sin signos
electrocardiográficos del segmento ST elevado.
Fueron excluidos pacientes con historia de
enfermedad coronaria aguda resultado del uso de
drogas tales como carbamazepina, anfetaminas, o
consumo de cocaína. Adicionalmente también
fueron excluidos pacientes con falla renal aguda,
diabetes mellitus, hipotiroidismo o falla cardíaca
crónica.
Los controles fueron pacientes
ambulatorios, sin diagnóstico de síndrome
coronario agudo con los mismos criterios de
exclusión de los casos. Todos los individuos firmaron
un consentimiento informado y llenaron una
encuesta con datos básicos. El proyecto fue
aprobado por el Comité de Bioética de la
Universidad del Quindío.
Toma de muestras
Las muestras sanguíneas en los casos fueron
obtenidas entre 8 y 12 horas después de la
presentación de los síntomas y antes del inicio de
cualquier terapia trombolítica o anticoagulante y
transferidas a tubos, uno sin anticoagulante (para
homocisteína) y otro con EDTA (para ADN). El suero
fue obtenido inmediatamente por centrifugación a
4°C por 15 minutos a 3000 rpm. Se almacenó a 20°C
para análisis posteriores. En los controles las
muestras fueron obtenidas después de un ayuno de
12 horas
Polimorfismo C677T del gen MTHFR
Para determinar el polimorfismo C677T, se realizó
una extracción de ADN de sangre total, con el Kit
Wizard Genomic DNA Purification. (Promega),
posteriormente se realizó una reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) con una mezcla de 300nm de
oligonucleótidos (Directo: C677T–F-5'TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3'.
Reverso:C677T-R-5'-AGGACGGTGCGG-TGAGAGTG3'), Taq polimerasa 1U, dNTPs 0,1mM, Cloruro de
magnesio 1,5mM, Buffer 1X (20mM Tris HCl; pH 8,4;
50 mM KCl) para un volumen final de 25μl. La
amplificación del ADN se hizo en un termociclador
MJ Research PTC-100 con los siguientes ciclos:
Desnaturalización inicial 94ºC durante 1 minuto,
seguida por 30 ciclos, de desnaturalización 94ºC x 1
minuto, alineamiento 63ºC x 1 minuto, extensión
72ºC x 2 minutos y un ciclo de extensión final a 72ºC
x 10 minutos.
rev. invest. univ. quindio (18): 231-236. Armenia - Colombia
Loango, N. et al. - 233 Los productos amplificados fueron separados por
electroforesis en un gel de agarosa al 2% y
visualizados bajo luz ultravioleta con Bromuro de
Etidio al 0,025% la observación de una banda de
225pb indicó la amplificación positiva. Finalmente
se realizó una digestión enzimática con la enzima de
restricción HinfI. Los productos digeridos se
visualizaron en un gel de agarosa al 2,5%, teñido con
Bromuro de Etidio. Los parámetros de digestión
esperados fueron: Homocigoto nativo (CC): 203pb,
Heterocigoto (CT): 203+180pb, Homocigoto
mutado (TT): 180pb.
Homocisteína sérica
Los niveles en suero de la homocisteína fueron
determinados usando la técnica de inmunoensayo
competitivo con el kit INMULITE - HOMOCISTEINA.
Análisis de los resultados.
Las frecuencias de los alelos y genotipos se
estimaron por conteo directo de los mismos. Se
realizó el test de Chi cuadrado para verificar si las
frecuencias observadas de los genotipos guardaban
concordancia con las esperadas bajo la hipótesis de
Hardy-Weinberg. Para comparar niveles de
homocisteína entre genotipos en los grupos se
realizó la prueba t de Student y para la comparación
de los genotipos entre grupos de estudio se utilizó
análisis de varianza de una vía (ANOVA). Todos los
datos son presentados como la media ± la
desviación estándar. El nivel de significancia se
estableció a P < 0,05. El análisis estadístico se hizo
con el programa SPSS (versión 14,0).
RESULTADOS
Características básicas de los sujetos de estudio
La distribución de la población fue homogénea por
edad y por sexo. La tabla 1 muestra las
características básicas de la población. Los datos
indican que en las variables edad, peso, índice de
masa corporal, no se encontraron diferencias
significativas entre los dos grupos. Las
concentraciones de homocisteína son más altas en
casos que en controles, con diferencia significativa.
Similar a lo encontrado para la presión diastólica
(p<0,05). Al relacionar los niveles de homocisteína
con los niveles de ácido fólico en casos y en
controles, se encontró que el coeficiente de
correlación de Pearson (r=-0,320 y r=-0,246
respectivamente) resultó estadísticamente
significativo (p= 0,013 y p= 0,046 respectivamente).
Tabla 1. Características básales de los pacientes con
enfermedad coronaria y los controles
Casos
Controles
Variable
n = 49
n = 50
Sexo M/F
28/21
25/25
Edad (Años)
52,1 ± 7,0
49,6 ± 9,8
IMC
25,1 ± 4,6
25,5 ± 4,6
Homocisteína
12,3 ± 6,1
9,7 ± 2,4
Acido Fólico
10,6 ± 3,4
12,6 ± 3,6
Presión Sistólica
129,1 ± 26,3
120,7± 21,4
Presión Diastólica
79,4 ± 15,8
71,1 ± 14,9
IMC: Índice de masa corporal. *significativo
P
0,150
0,653
0,006*
0,172
0,082
0,009*
Frecuencia del polimorfismo C677T
Las frecuencias alélicas y genotípicas se muestran en la
tabla 2. La población no se encuentra en equilibrio de
Hardy Weinberg (chi cuadrado =31,2). En la tabla se
observa que el 50,5% de la población tenía genotipo CC y
el 67,3% alelo C. Esta mayor frecuencia también se
presentó en los genotipos de los pacientes casos (46,6%)
y en los controles (54,0%) comparadas con las
frecuencias de los otros genotipos TT (16,2% casos) y CT
(10,2% controles) y con el alelo T. No se evidenciaron
diferencias significativas en los genotipos y alelos entre
los grupos. El alelo mutado TT es el menos frecuente en la
población de acuerdo con lo esperado.
Tabla 2. Frecuencias alélicas y genotípicas para el
polimorfismo C677T del gen de la MTHFR en pacientes
con enfermedad coronaria y en individuos controles
Frecuencia
Población (%)
Casos
n=49 (%)
Controles
n=50 (%)
Genotípica
CC
CT
TT
50 (50,5)
33 (33,3)
16 (16,2)
23 (46,9)
21 (42,9)
5 (10,2)
27 (54,0)
12 (24,0)
11 (22,0)
P=0,081
Alélica
C
T
133 (67,2)
65 (32,8)
67 (68,4)
31 (31,6)
66 (66,0)
34 (34,0)
Relación del genotipo C677T de la MTHFR con la
concentración de homocisteína y ácido fólico
La gráfica 1a muestra los niveles de homocisteína en
cada uno de los genotipos en casos y controles. Los
genotipos CC y CT en los casos presentaron niveles
de homocisteína más altos (7,2% y 35,2%
respectivamente) que sus controles, con diferencias
significativas. En los casos el genotipo TT muestra
niveles de homocisteína 55.8% más altos que los
controles, sin embargo, la diferencia no fue
significativa (p=0,081). Dado el bajo número de
individuos en los grupos no se tuvieron en cuanta
las diferencias de sexo.
To m a n d o c o m o n i v e l d i s c r i m i n a n t e d e
homocisteína alta un nivel mayor de 12mmol/L, se
rev. invest. univ. quindio (18): 231-236. Armenia - Colombia
- 234 - Polimorfismo C677t del gen de la enzima mthfr
encontró que los pacientes con el alelo T tienen en
promedio niveles mayores de homocisteína
plasmática que los controles.
La gráfica 1b muestra los niveles de ácido fólico en
cada uno de los genotipos distribuidos por casos y
controles. Los individuos casos presentaron
menores niveles de ácido fólico en los tres genotipos
comparados con los controles (p<0,01). En el
genotipo TT de los casos la concentración de ácido
fólico fue 21,2% más baja que el genotipo CC y 13,6%
más baja que el genotipo CT, la diferencia fue
significativa (p<0,01).
a.
30
*
Casos*
Controles
25
20
Homocisteina
(˜ mol/L) 15
*
10
5
0
CC
CT
TT
Polimorfismo C677T
b.
16
Casos
14
Controles
12
‡
10
Acido Folico
8
(ng/ml)
6
variante TT está asociada con niveles altos de
homocisteína (22,23), y que esto es
particularmente cierto para individuos con bajos
niveles de folato como lo muestra la gráfica 1,
resultados similares a los descritos por Hanson y
colaboradores (19). En un trabajo previo de nuestro
grupo en pacientes con un primer evento coronario
se demostró que la ECV se asoció positivamente con
niveles altos de homocisteína (8), sin embargo, en el
presente trabajo, contrario a lo esperado, la ECV no
se asoció con una mayor frecuencia de la mutación
TT. Tal discrepancia podría ser debida a la
complejidad de la enfermedad y al metabolismo de
la homocisteína, del folato mismo y otros factores,
como es sugerido por Klerk y colaboradores (24).
Nuestro grupo de pacientes mostró que tienen
niveles de folato relativamente bajos comparado
con sus controles en las tres variantes genotípicas
posiblemente, estas circunstancias y otras no
evaluadas aquí podrían pesar más que el propio
genotipo TT dando como resultado una falta de
asociación a pesar de los niveles elevados de
homocisteína en este genotipo. Adicionalmente a
estos argumentos, no podrían ignorarse los efectos
de los procesos estadísticos; por ejemplo, la
estratificación por sexo y edad podrían disminuir los
efectos de estas variables de confusión, sin
embargo, al mismo tiempo el tamaño de la muestra
que de por sí, ya es reducida disminuiría más, lo que
haría que los efectos influyentes como es el caso de
la variante TT sean más difícilmente detectados.
4
2
0
CC
CT
TT
Polimorfismo C677T
Gráfica 1: Distribución de los niveles de homocisteína y
ácido fólico por casos y controles según el genotipo C677T
DISCUSIÓN
Se ha demostrado que un aumento moderado en los
niveles plasmáticos de homocisteína es un factor de
riesgo para enfermedad cardiovascular (16,17), pero
existe controversia sobre si la variante homocigota
del polimorfismo C677T de la MTHFR predispone a
los individuaos a ECV. Al respecto nuestro estudio
confirma algunos resultados de estudios previos en
varios grupos étnicos que describen que la variante
homocigoto TT del polimorfismo no esta asociada
con ECV (18-21), nuestro trabajo también confirma
los resultados de otros estudios que muestran que la
Por otro lado, en este estudio a diferencia de otros
estudios colombianos, la frecuencia del genotipo TT
en pacientes fue baja 10,2% y 22% para controles,
comparada con los estudios de Camacho y
colaboradores (25) y Bermúdez, y colaboradores
(26) que registraron una frecuencia de 28% y 25,2%
respectivamente. Nuestros resultados son
semejantes a los descritos para una población
egipcia donde el TT fue de 12% en ECV y 8% en
controles, tampoco estos autores encontraron
relación entre ECV y el genotipo TT (18). Resultados
similares a los nuestros y a los egipcios fueron
Hallados por Hanson y colaboradores (19) en una
población de Estados Unidos, en donde la
frecuencia del genotipo TT fue de 10,9% para los
pacientes con ECV y de 12,5% para los controles sin
diferencias significativas. En Colombia Cardona y
colaboradores (27) encontraron una frecuencia del
genotipo TT de 12,9% similar a la descrita en
nuestro estudio, pero en mujeres con pérdidas
gestacionales recurrentes. Las diferencias en las
rev. invest. univ. quindio (18): 231-236. Armenia - Colombia
Loango, N. et al. - 235 frecuencias mostradas aquí en nuestro estudio y en
los estudios mencionados comparadas con las de
Bermúdez y colaboradores (26) y Camacho y
colaboradores (27), podría deberse a diferencias
individuales, como la presencia o ausencia de
enfermedad. La penetrancia de un gen puede ser
dependiente de ciertos antecedentes permisivos a
nivel de las poblaciones y del individuo, de su
historia personal, familiar y del estilo de vida, al
respecto es importante mencionar que los estudios
colombianos descritos se hicieron en población
aparentemente sana y hasta donde se conoce este
trabajo es el primero en Colombia en pacientes con
un primer evento coronario y no hay patrones de
comparación, pero al comparar las frecuencias del
polimorfismo TT de los controles del presente
trabajo con las de otras poblaciones colombianas
descritas son semejantes, lo que nos permite sugerir
que la ECV podría estar modificando la frecuencia
del polimorfismo TT. Sin embargo, el desarrollo de
una enfermedad como la ECV podría necesitar de la
interacción epistática de más de un gen
predisponente, por lo cual el examen de otros
factores genéticos permisivos podría ser útil en
identificar subpoblaciones susceptibles a ECV.
En conclusión, este estudio encontró que los
individuos con enfermedad coronaria tenían niveles
de homocisteína mas altos que sus controles en
cualquiera de los tres genotipos y que las diferencias
fueron estadísticamente significativas para los
genotipos con el alelo T. Igualmente este estudio
mostró muy bajos niveles de folato asociados al
genotipo TT, pero no encontró relación entre este
genotipo y la enfermedad coronaria.
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