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Transcript
REPUBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA
UNIVERSIDAD DEL ZULIA
FACULTAD DE MEDICINA
DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS
MAESTRÍA EN GENÉTICA: MENCIÓN GENÉTICA MÉDICA
“El Polimorfismo C677T del Gen de la Metiltetrahidrofolato
Reductasa como factor de riesgo para Síndrome Down”
INFORME FINAL DE INVESTIGACIÓN COMO REQUISITO PARA OPTAR AL TITULO
DE MAGISTER SCIENTIARUM EN GENÉTICA, MENCIÓN GENÉTICA MÉDICA
AUTORA: MC. ZORAIDA BEATRIZ BUTRÓN VERGEL.
TUTORES:
DRA. SANDRA GONZALEZ FERRER
MSC. WILLIAM ZABALA FERNÁNDEZ.
Maracaibo, Febrero 2005
El Polimorfismo C677T del Gen de la Metilentetrahidrofolato Reductasa como factor de riesgo
para Síndrome Down
Autor: MC. Zoraida Beatriz Butrón Vergel.
____________________________
C.I. 9311752
Dirección
Telf.
Móvil: 0416-2708251
[email protected]
Tutores:
Dra. Sandra González Ferrer
_____________________________
MSC. William Zabala Fernández
_____________________________
VEREDICTO
Nosotros, los abajo firmantes, miembros principales del jurado designados por el Consejo
Técnico de la División de Estudios para graduados de la Facultad de Medicina, Universidad del
Zulia, en su sesión Nº____________ de fecha ___________________, para evaluar el trabajo de
grado: “El Polimorfismo C677T del Gen de la Metilentetrahidrofolato Reductasa como factor de
riesgo para Síndrome Down” que la MC. Zoraida Beatriz Butrón Vergel, C.I. 9311752 presenta
para optar al título de MAGÍSTER SCIENTIARUM EN GENÉTICA MENCIÓN GENÉTICA
MÉDICA, y reunidos el día _____________________en la Unidad de Genética Médica de la
Facultad de Medicina de LUZ, para su discusión con la autora y visto que cumple con los
requisitos exigidos en el reglamente para la presentación de trabajo en la Universidad del Zulia,
le impartimos su APROBACIÓN.
Maracaibo,
_____________________
Coordinadora
_____________________
Miembro
C.I.
_____________________
Miembro
C.I.
INDICE GENERAL
Pág.
Resumen………………………………………………………………………
vii
viii
Abstract……………………………………………………………………….
Introducción………………………………………………………………….
1
Objetivos………………………………………………………………………
9
Pacientes, Material y Métodos…………………………………………….
11
Resultados……………………………………………………………………
17
Discusión……………………………………………………………………..
19
Conclusiones y Recomendaciones………………………….…………
25
Bibliografía………………..………………………………………………….
36
.
INDICE DE TABLAS
Pag.
Tabla Nº I…………………………………………………………………….
26
Tabla Nº II.…………………………………………………………………….
27
Tabla Nº III…………………………………………………………………….
27
Tabla Nº IV…………………………………………………………………….
28
Tabla Nº V…………………………………………………………………….
28
Tabla Nº VI…………………………………………………………………….
29
Tabla Nº VII..……………………………………………………………………
29
Tabla Nº VIII.……………………………………………………………………
30
Tabla Nº IX..……………………………………………………………………
31
Tabla Nº X..……………………………………………………………………
31
.
INDICE DE GRÁFICOS
Anexo Nº 1…………………………………………………………………
32
Anexo Nº 2………………………………………………………………….
33
Anexo Nº 3…………………………………………………………………
34
Anexo Nº 4………………………………………………………………….
35
Butrón Vergel Zoraida Beatriz. El Polimorfismo 677C>T del Gen de la Metiltetrahidrofolato
Reductasa como factor de riesgo para Síndrome Down. Trabajo de Grado como requisito para
optar al título de Magíster Scientiarum en Genética. Mención Genética Médica. Universidad del
Zulia. Facultad de Medicina. División de Estudios para Graduados. Maestría en Genética:
mención Genética Médica. Maracaibo, Republica Bolivariana de Venezuela. 2005. 40p.
RESUMEN
El síndrome Down (SD) es una enfermedad genética compleja que se atribuye a la presencia de
tres copias del cromosoma 21, se presenta con una frecuencia de 1:600 a 1:800 nacidos vivos y se
caracteriza por presentar retardo mental y un fenotipo característico. En el 95% de los casos el
cromosoma extra proviene de la madre cono consecuencia de una segregación cromosómica
anormal durante la meiosis. Excepto por la edad materna avanzada, los factores de riesgo
maternos para la no disyunción meiótica aún no están bien establecidos. Estudios preliminares
sugieren que el metabolismo anormal del folato puede estar implicado en el proceso de la
inestabilidad cromosómica y la consecuente no disyunción, al verse afectada la metilación del
ADN. En este sentido, se ha propuesto que el polimorfismo 677C>T en el gen de la
Metiltetrahidrofolato Reductasa (MTHFR), enzima participante en el metabolismo del folato,
puede ser un factor de riesgo que predisponga a la no disyunción meiótica y síndrome Down en
madres jóvenes. En el presente trabajo la frecuencia del polimorfismo 677C>T fue evaluado en
50 madres de niños con síndrome Down y en 50 madres control con el objetivo de establecer la
posible relación entre el mismo y el aumento de riesgo para tener descendencia con SD. Entre la
frecuencia de los genotipos no existen diferencias entre los dos grupos de madres estudiadas, lo
que permite concluir que estos resultados no apoyan la asociación entre el polimorfismo 677C>T
en el gen MTHFR y el riesgo de tener niños con síndrome Down.
Palabras claves: Polimorfismo MTHFR 677C>T. Síndrome de Down. Polimorfismo.
Metiltetrahidrofolatoreductasa.
[email protected]
Butrón Vergel Zoraida Beatriz.. Metylenetetrahydrofolate Reductase polymorphism as maternal
risk for Down Syndrome. Final report of investigation as a requirement to apply to the grade of
Magíster Scientiarum in Genetics. Mention Medical Genetic. Universidad del Zulia. Facultad de
Medicina. División de Estudios para Graduados. Maestría en Genética: mención Genética
Médica. Maracaibo, Republica Bolivariana de Venezuela. 2005. 40 p.
ABSTRACT
Down syndrome (DS) is a complex genetic disorder attributed to the presence of three copies of
chromosome 21. DS occurs with an estimated frecuency of 1 in 600 to 1 in 800 live births. The
extra chromosome derives from the mother in 95% of cases and is due to abnormal chromosome
segregation during meiosis. Except for advance age at conception, maternal risk factors for
meiotic nondisjunction are not well established. A preliminary study suggested that abnormal
folate metabolism is associated with chromosomal instability and abnormal segregation. The
677C>T polymorphism in the methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene may be
maternal risk factors for Down syndrome. In order to confirm this association, we studied the
presence of the 677C>T in 50 mothers of Down syndrome children and 50 controls. Frequencies
of MTHFR 677C>T genotypes demonstrated no difference between the case and control groups.
The date presented in this study fail to support the relationship between MTHFR 677C>T
polymorphism and risk of having a child with DS.
Key words: MTHFR 677>T
Metylenetetrahydrofolate
Key words: MTHFR
Metylenetetrahydrofolate
[email protected]
677>T
polimorphism.
polimorphism.
Down
Down
Syndrome.
Polimorfism.
Syndrome.
Polimorfism.
Introducción.
El síndrome Down es una enfermedad genética compleja producto de la presencia de tres
copias del cromosoma 21; se presenta con una frecuencia de 1:600 a 1:800 nacidos vivos (1,2) y
se caracteriza por presentar retardo mental y un fenotipo que incluye pliegue epicántico,
hendiduras palpebrales oblicuas hacia arriba, puente nasal aplanado, orejas pequeñas de baja
implantación, lengua protruída, clinodactilia del meñique, surco transverso en la palma de la
mano y diastasis entre primer y segundo ortejo, entre otras.
Los afectados
especialmente
frecuentemente presentan malformaciones congénitas mayores,
gastrointestinales como la
atresia o estenosis duodenal, ano imperforado o
megacolon (3,4) y también cardíacas (30-40%), como el canal auriculoventricular. Asimismo se
reporta su asociación a defectos del sistema inmune y endocrino, sordera usualmente de tipo
conductivo (20%), riesgo 10 a 20 veces mayor que la población normal de presentar leucemia o
reacciones leucemoides (4) e igualmente, predisposición a
desarrollar la enfermedad de
Alzheimer en edades más tempranas que en la población general, probablemente debido a la
sobreexpresión del gen Precursor de la Proteína Amiloide (APP) que se encuentra en el
cromosoma 21 (5)
Desde el punto de vista citogenético, cerca del 95% de las personas con Síndrome Down
tienen tres copias del cromosoma 21 (trisomía 21 libre) producto de la no disyunción de los
cromosomas durante la meiosis, es decir, falla en la separación y movimiento hacia los polos de
cromosomas homólogos, dando como resultando gametos aneuploides bien sea trisómicos o
monosómicos (6).
Estudios con marcadores de ADN han permitido conocer el origen parental del
cromosoma trisómico y reportan que en cerca del 90% de los casos, el cromosoma adicional
proviene de la madre y de éstos, entre el 67 y 73% es producto de la no disyunción en la Meiosis
I materna (7,8), la cual se ha asociado a edad promedio de la madre de 32 años contra una edad
promedio de 27 años en la población general. Los errores en meiosis II explican del 18 al 20% de
Introducción
todos los casos de trisomía 21 y están también asociados a una edad materna promedio de 31,4
años. En las raras familias (10%) en las cuales la no disyunción es paterna, la mayoría de los
errores ocurren en meiosis II, siendo en esos casos las edades promedio materna y paterna
similares a la edad promedio reproductiva en las sociedades occidentales (5)
Por otra parte, alrededor del 4% de los afectados tienen la copia extra translocada a otro
cromosoma acrocéntrico del mismo grupo (translocación homóloga) o de otro grupo
(translocación heteróloga), siendo las más frecuentes las translocaciones 14/21 y 21/21(9). Las
trisomías por translocación 14/21 de novo se originan en las células maternas con una edad
promedio de 29,2 años, en cambio, la mayoría de las translocaciones 21/21 son realmente
isocromosomas (dup21q) y que se originan con igual frecuencia en ambos progenitores. En las
escasas translocaciones robertsonianas el cromosoma extra es de origen materno; en el 1% de los
pacientes la alteración cromosómica forma parte de un mosaico, debido a una no disyunción post
cigótica, con líneas celulares con 46 cromosomas y líneas celulares con la trisomía 21 en
cualquiera de sus formas (9).
Dada la alta frecuencia de la trisomía 21 libre debida a no disyunción, se han planteado
diferentes hipótesis para tratar de explicar esta alteración. Una de ellas plantea que al aumentar la
edad materna hay disminución de la frecuencia de recombinación durante la meiosis, que
conduce a la formación de bivalentes aquiasmáticos o a la formación de escasos quiasmas,
ocasionando que el intercambio entre cromosomas homólogos o cromátidas hermanas sea menos
eficiente disminuyendo la probabilidad de que los cinetocoros se orienten hacia los polos
opuestos (10,11).
Asimismo, se ha reportado que factores como las radiaciones, agentes químicos como la
colchicina, econazole, hidroquinona e insecticidas organofosforados, entre otros, son capaces de
inducir aberraciones cromosómicas numéricas y estructurales en el ser humano, encontrándose
Introducción
que en personas expuestas a alguno de estos agentes hay una mayor predisposición a que ocurra
la no disyunción.(12)
Otra hipótesis plantea la existencia de un número determinado de folículos en maduración
en el estado pre-ovulatorio en cada ciclo menstrual, y que éstos van disminuyendo a medida que
aumenta la edad materna; si el folículo seleccionado involucra un oocito muy maduro hay mayor
probabilidad de que ocurra la no disyunción (13).
Otra teoría es la de la microcirculación comprometida, en ella se plantea que por efecto de
un desbalance hormonal, hay disminución de la microcirculación perifolicular reduciendo el flujo
sanguíneo a esta área, que trae como consecuencia hipoxia dentro del folículo, aumento del ácido
láctico y del CO2, con el consiguiente descenso del pH intracelular del oocito, desorganización
del huso cromático, desplazamiento anormal de los cromosomas dentro de la célula y
predisposición a la no disyunción. (14). Esta hipótesis podría explicar la baja incidencia de
trisomías en mujeres en edad intermedia así como el aumento de la frecuencia en los extremos de
la vida reproductiva, que son las edades donde se ven con mayor frecuencia
alteraciones
hormonales.
A partir de la década de los noventa, se ha propuesto la asociación entre la
hipometilación del Ácido Desoxiribonucleico (ADN) y la
inestabilidad cromosómica. La
5metiltetrahidrofolato, forma metilada del folatoEl folato es necesario para proveer de grupos
metilo a cientos de procesos bioquímicos que incluyen la metilación del ADN modulando la
expresión de genes y la integridad genómica. La deficiencia del folato puede alterar la estabilidad
del ADN por dos vías principales: en primer lugar, el 5,10- metilenetetrahidrofolato se encarga de
donar grupos metilo al uracilo para su conversión en timina que es utilizada para la síntesis y
reparación del ADN; si el nivel de folato está disminuido, ocurre un desbalance en el pool de
precursores de ADN y el uracilo va a ser incorporado erróneamente en el ADN activando los
sistemas de reparación, lo que puede acarrear rupturas en la doble hélice y por ende daño
cromosómico.(15-19)
Introducción
La enzima Metiltetrahidrofolato Reductasa (MTHFR) cataliza la síntesis de 5metiltetrahidrofolato, que es el donador del grupo metilo para la reacción de remetilación de
homocisteína en metionina por acción de la enzima metionina sintetasa reductasa (MTRR) esta
enzima agrega un grupo metilo a la homocisteína en presencia de vitamina B-12 (cofactor) y
utilizando como co-sustrato al 5-metiltetrahidrofolato (5-metil-THF) para sintetizar metionina,
que es el precursor de la síntesis de S-adenosilmetionina (SAM). La producción del 5-metil-THF
requiere de un abastecimiento adecuado de folato reducido y la función apropiada de la MTHFR.
Por lo tanto, si hay enzimas funcionando inapropiadamente o los cofactores no se presentan en
cantidades adecuadas, se incrementan las concentraciones de homocisteína (Anexo Nº 1).(20,21).
El gen MTHFR está localizado en 1p36.3, cercano al gen CLCN6, su región promotora no
contiene caja TATA pero contiene islas CpG, contiene 11 exones y 10 intrones. Codifica para
una proteína de 656 aminoácidos con un peso molecular de 150 kD. (5).
En 1995, Frosst y colaboradores (22) describieron la mutación más común del gen
MTHFR en el exón 4; una sustitución de la citosina por la timina en la base 677, la mutación
677C>T, que origina una sustitución de valina por alanina en la enzima. Este cambio conduce a
alteraciones en la función enzimática que se reflejan en una menor estabilidad de la proteína
durante la incubación in vitro de los linfocitos de sujetos afectados cuando son expuestos a una
temperatura de 46º C, como producto de esta transición la actividad enzimática en los
homocigotos T/T es de 30% y de 65% en los heterocigotos C/T, esto con respecto a los sujetos
homocigotos C/C.
La frecuencia del alelo T tiene una distribución mundial, pero esta varía
considerablemente entre las diferentes poblaciones. Botto y Yang (23) reportaron en un metaanálisis que la frecuencia alélica para esta variante entre blancos en Canadá, Estados Unidos,
Brasil y Australia, oscila entre 34 y 37% mientras que en los blancos de origen hispano de
California y en colombianos es de 42%.
Introducción
De manera semejante, Davalos y colaboradores (24) analizan el polimorfismo en
diferentes grupos nativos de Méjico encontrando una frecuencia alélica de 44% entre mestizos,
56% entre los Huichol, 36% en los Tarahumara y 57% entre los Purepecha, lo que indica que la
frecuencia es mayor comparada con otros grupos.
Con respecto a la población negroide, los mismos autores reportaron un 7% en la
frecuencia del alelo T sin identificar homocigotos T/T,. De igual forma, la frecuencia de
homocigotos entre individuos negroides que viven fuera de África, como Brasil y Estados
Unidos, es igualmente baja reportándose entre 1 y 2%, lo que sugiere que este polimorfismo es
menos común en esta población que en otros grupos étnicos (23).
En lo que respecta a Venezuela, en el año 2001, Vizcaino y colaboradores (25) estudiaron
80 indios Yukpas y reportaron que en ellos la frecuencia de homocigotos mutantes fue de 15%,
la de heterocigotos 53,7% y la de homocigotos sin la mutación 31,3%. Ocando y colaboradores
(26) estudiaron la frecuencia del polimorfismo 677C>T en 1007 individuos sanos mayores de 50
años residentes de la ciudad de Maracaibo, siendo la frecuencia del alelo C de 67% mientras que
la del alelo T fue de 33%.
Sobre la base de que las alteraciones del metabolismo del folato producen hipometilación
del ADN y anormal segregación cromosómica, James y colaboradores en el año 1999 (27),
plantean que el alelo T del polimorfismo 677C>T en el gen de la MTHFR puede ser un factor de
riesgo de no disyunción en el síndrome Down en madres jóvenes. Ellos estudiaron 57 madres de
niños con síndrome Down (trisomía libre) y 50 madres con hijos sanos (madres control),
provenientes de 16 estados norteamericanos y de Canadá, encontrando un significativo
incremento de los niveles de homocisteína en plasma en las madres de niños con síndrome Down;
así mismo, las madres con la transición 677C>T tienen 2.6 veces mayor riesgo de tener hijos con
síndrome Down que las madres sin la sustitución
Introducción
En el año 2000, Hobbs y colaboradores (28) realizan un estudio similar analizando los
polimorfismos 677C>T en el gen MTHFR y el 66A>G en el gen Metionina Sintetasa Reductasa
(MTRR). En esta investigación, la muestra consistió de 157 madres de niños con síndrome Down
y 144 madres control, provenientes de tres estados norteamericanos. Los resultados fueron
similares a la observación preliminar encontrando mayor prevalencia del polimorfismo 677C>T
en madres de niños con síndrome Down (OR 1.91; intervalo de confianza IC 95%) y en las
homocigotas A66G (OR 2.57). La combinación de ambos polimorfismos se relacionó con un
riesgo 4.8 veces mayor.
Por otra parte Al-Gazali y colaboradores en el año 2001 (29), analizan el polimorfismo
677C>T en el gen de la MTHFR en un niño portador de síndrome Down con defecto de cierre del
tubo neural y en la madre. El análisis molecular reporta que ambos eran homocigotos T/T para
dicho polimorfismo. El nivel de homocisteína en plasma de la madre fue elevado, la metionina
estuvo disminuida al igual que
el nivel de S-adenosilmetionina, con una significativa
hipometilación del ADN en linfocitos. En el niño se encontró disminución de la homocisteína,
metionina y S-adenosilmetionina asociado a hipometilación del ADN en linfocitos, además, el
afectado mostró niveles elevados de cistationina producto de la sobreexpresión del gen cistationin
B sintetasa que se localiza en el cromosoma 21.
Los hallazgos sugieren que la alteración en el metabolismo del folato en la madre como
consecuencia del genotipo T/T para el polimorfismo 677C>T del gen MTHFR, pudo promover la
inestabilidad cromosómica y la no disyunción meiótica dando como resultado la trisomía 21. Los
autores concluyen que la presencia en el mismo niño de la trisomía 21 y el defecto de cierre del
tubo neural, apoya la necesidad de extender la suplementación con folato al período
periconcepcional para lograr efectos preventivos en ambas alteraciones.
Introducción
En el año 2002, Brunelli-Neves Grillo y colaboradores en Brasil (30) analizaron los
polimorfismos 677C>T y 1298A>C del gen MTHFR en una muestra constituida por 36 madres
de niños con síndrome Down (trisomía 21 libre) y 200 adultos de la población general como
controles. La comparación entre los diferentes alelos de la muestra reporta diferencias
estadísticamente significativas
(p = 0.02) siendo esta diferencia causada por una mayor
proporción de alelos mutantes en la muestra de madres con hijos afectados por el síndrome
Down. Con estos datos preliminares los autores concluyen que la variación alélica en estos
polimorfismos del gen MTHFR, se catalogan como un factor de riesgo importante para síndrome
Down, y ratifican la importancia de la administración de ácido fólico antes de la concepción para
disminuir la incidencia de defectos de cierre de tubo neural y de síndrome Down.
En este mismo sentido, O´Leary y colaboradores en el año 2002 (31) analizaron la prevalencia de
los polimorfismos 66A>G en el gen MTRR y 677C>T en el gen MTHFR en 48 madres de niños
con síndrome Down y 192 madres control. Las variantes genotípicas AG y GG en el gen MTRR
fue significativamente mayor en madres de niños con síndrome Down comparado con el grupo
control (p = 0.0028). La del alelo 677C>T en el gen MTHFR no fue significativa en madres de
niños con síndrome Down al compararla con los controles (p = 0.74); sin embargo, las madres
con el genotipo CT o TT para el gen MTHFR y el genotipo GG en el gen MTRR tuvieron 2.98
veces mayor riesgo de tener hijos con síndrome Down. (p = 0.02). Los niveles de homocisteína
plasmática fueron normales en presencia del alelo G y aumentados cuando el alelo T en el gen
MTHFR está presente. Los autores concluyen que las madres que presentan tales variantes
genotípicas en el gen MTRR y MTHFR tienen mayor riesgo de tener hijos con síndrome Down.
Sin embargo, otras investigaciones en diferentes poblaciones no confirman la asociación
entre mayor riesgo de síndrome Down en madres con al menos un alelo T en el gen MTHFR. Tal
es el caso de Petersen y colaboradores que en el año 2001 (32), analizaron el polimorfismo
MTHFR 677C>T en 177 madres de niños con síndrome Down (trisomía libre) en Dinamarca, y
determinaron el origen de la no disyunción con marcadores de ADN microsatélite. La frecuencia
Introducción
del alelo mutante T en madres de niños con síndrome Down fue 27.7% y su estado homocigoto
se asoció con leve hiperhomocisteinemia. En este trabajo no se demostraron diferencias
estadísticamente significativas entre las frecuencias alélicas de madres y padres; madres de
afectados y controles, ni tampoco entre madres con errores en Meiosis I y II.
En el año 2002 Chadefaux-Vekemans y colaboradores (33) en Francia, no encontraron
diferencias en lo que respecta a las frecuencias genotípicas para el polimorfismo 677C>T entre
85 madres portadoras de fetos con trisomía libre del cromosoma 21 y el grupo control. En el
mismo año, Stuppia y colaboradores (34) estudian la presencia del alelo T en 64 madres de niños
con síndrome Down y en 112 controles en una muestra de la población italiana, sin confirmar la
asociación de esta variante con el riesgo aumentado de síndrome Down en madres portadoras de
este alelo.
Finalmente, Boduroglu y colaboradores en el año 2004, analizan los polimorfismo
677C>T y 1298A>C en 152 madres de niños con síndrome Down y 91 controles en Turquía, no
encontrando relación entre el alelo mutante T y el aumento de riesgo de tener niños con síndrome
Down (35).
Los resultados conflictivos obtenidos en los diferentes estudios que relacionan el
polimorfismo 677C>T con el aumento del riesgo de tener hijos con síndrome Down, y su
presencia muy variable en diferentes países, justifica la necesidad de realizar nuevas
investigaciones en otras poblaciones, con la finalidad de establecer si realmente existe esa
relación ya que de ser correctas las aseveraciones reportadas inicialmente por James y
colaboradores, la ejecución de planes destinados a estimular la ingesta de ácido fólico para
mantener niveles adecuados del mismo, lograría disminuir la incidencia de síndrome Down en la
comunidad.
Objetivos
General:
Determinar la relación entre el polimorfismo 677C>T en el gen de la
Metilenetetrahidrofolato Reductasa y el riesgo aumentado de tener hijos con síndrome
Down.
Específicos:
Determinar las frecuencias alélicas y genotípicas en el polimorfismo
677C>T en el gen MTHFR en madres de niños sanos y en madres de niños con
síndrome Down.
Demostrar el Equilibrio de Hardy Weinberg para el polimorfismo
677C>T en el gen MTHFR en la muestra control de madres de niños sanos.
Establecer la relación entre la presencia del alelo T en el
polimorfismo 677C>T en el gen de la Metilenetetrahidrofolato Reductasa y el
incremento de riesgo de tener niños con síndrome Down.
Hipótesis
La
presencia
del
polimorfismo
677C>T
en
el
gen
de
la
Metilenetetrahidrofolato Reductasa es un factor relacionado con el aumento de riesgo
en madres menores de 39 años de tener hijos con Síndrome Down.
Pacientes y Métodos
Población y muestra:
Se trató de una investigación de tipo explicativa de diseño no experimental. La población
objeto de estudio estuvo constituida por las madres de niños con síndrome Down, que asisten a la
Unidad de Genética Médica de LUZ, Centro de Desarrollo Infantil Nº 16 y Hospital de
Especialidades Pediátricas de la ciudad de Maracaibo. De esa población se seleccionó una
muestra intencional que cumplió con los siguientes criterios de inclusión: edad materna menor de
39 años para el momento de la concepción y al menos un hijo con síndrome Down por trisomía
libre confirmada por estudio citogenético. En todas ellas se investigó la ingesta de ácido fólico
periconcepcional.
Como grupo control se estudiaron 50 madres, con edad y condición socioeconómica
similar, residentes en la misma área geográfica y sin antecedentes de embarazos con alteraciones
cromosómicas, abortos, mortinatos ni enfermedades cardiovasculares.
Todas las madres participantes firmaron un formato de consentimiento informado el cual
se obtuvo directamente de cada persona, luego de una breve explicación sobre los beneficios y
riesgos de la investigación, en un lenguaje de fácil comprensión tanto de forma oral como por
escrito, ofreciéndoles un tiempo adecuado para su evaluación y decisión o no de aceptación.
El proyecto de esta investigación fue aprobado por el Comité Académico de la Maestría
de Genética Médica de la Unidad de Genética Médica de LUZ.
Pacientes y métodos
Métodos.
El estudio molecular del polimorfismo 677C>T en el gen MTHFR se realizó analizando el
ADN extraído de una muestra sangre periférica, mediante la técnica de Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) y digestión con enzima de restricción desarrollando el
siguiente esquema de trabajo:
Extracción del ADN.
Las muestras de sangre fueron tomadas por venopunción usando EDTA
como anticoagulante, el ADN fue extraído utilizando la técnica de extracción combinada
de fenol/sevag e inorgánica estandarizada en el Laboratorio de Genética Molecular de la
Unidad de Genética Médica de LUZ, como se explica a continuación:
Se tomó 5 ml de sangre periférica extraída con anticoagulante
EDTA 5mM en un tubo Falcon cónico de 15 ml y se agregó 10 ml de solución
de lisis (NH4Cl 155mM, NaHCO3 10mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,4)
La muestra se incubó en hielo durante 15 minutos, mezclando
ocasionalmente de manera suave. Se centrifugó durante 10 minutos a 3000
r.p.m. en centrífuga refrigerada a 4ºC.
Se descartó el sobrenadante y se resuspendió la pastilla de
leucocitos obtenida en 10 ml de solución de lisis. Se colocó nuevamente el
tubo en hielo y se centrifugó como el paso anterior.
Pacientes y métodos
Se eliminó el sobrenadante, se lavó el botón de blancos con
solución de lisis y se resuspendió en 6 ml de TE 1X (Tris-HCl 10mM, EDTA
1 mM, pH 8).
Se añadió 60 μl de proteinasa K (10mg/ml) y 300 μl de sarcosil o
SDS al 20%, incubándose durante toda la noche.
Transcurrido el tiempo, se sacó el tubo para que tomase temperatura
ambiente, se agregó 1 ml de NaCl 5 M, se mezcló en vortex por espacio de 1
minuto y se centrifugó por 10 minutos a 6000 r.p.m. a 4 º C.
El sobrenadante obtenido se trasvasó a un tubo de 50 ml de
capacidad contentivo de dos volúmenes y medio de etanol absoluto frío, se
mezcló suavemente por inversión hasta ver la formación de la malla de ADN.
El ADN formado se tomó con una pipeta pasteur con punta sellada
y se lavó con etanol al 70% dejándolo secar un poco.
Se colocó el ADN lavado en un tubo Eppendorf y se resuspendió en
1 ml de TE 1X, colocándolo durante 24-48 horas en un agitador mecánico para
lograr una completa disolución.
Pacientes y métodos
Cuantificación del ADN.
A todas las muestras de ADN extraídas se les determinó la calidad y
la concentración del ADN en un espectofotómetro Perkin Elmer, tomando las
lecturas de absorbancia a una longitud de onda de 260 y 280 nm, así como su
relación.
Determinación de la Integridad del ADN:
• La integridad del ADN también se confirmó mediante electroforesis
en gel de agarosa al 1%, en buffer TBE1X a 100 V por 15 a 20 minutos,
coloreando con Bromuro de Etidio y observando en un transiluminador de luz
UV, verificando así la presencia del ADN genómico y el estado del mismo.
Análisis Molecular:
La identificación de la transición C por T en el nucleótido 677 del gen de la
Metilenetetrahidrofolato Reductasa se realizó utilizando el método descrito por Frosst y
colaboradores en el año 1995 (22). La secuencia de los primers utilizados fue la siguiente:
(5´-3´): TgA Agg AgA Agg TgT CTg Cgg gA y Agg ACg gTg Cgg TgA gAg Tg los
cuales fueron publicados por Goyete y colaboradores en el año 1995 (36), estos primers
están diseñados para generar un producto amplificado de 198 pares de bases (pb).
A partír de 100 ng de ADN genómico se realizó la Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR) colocando 5 μL de muestra en 20 μL de un cóctel de reacción,
obteniendo un volumen final de 25 μL. Los constituyentes del cóctel de reacción se
detallan en la tabla I. Esta mezcla de reacción se colocó en un termociclador PT-1000
Pacientes y métodos
Perkin Elmer, utilizando un programa de amplificación específico para el polimorfismo
C677T en el gen MTHFR, el cual se detalla en la tabla II.
Verificación de los productos amplificados:
Al final de la PCR, se procedió a realizar la verificación de los productos
amplificados mediante la electroforesis en gel de agarosa al 2%, en buffer TBE1X a 100
Voltios, por un tiempo de 20 a 25 minutos, para lo que se usó un marcador de peso
molecular Ф174X digerido con HAE III de la casa comercial Promega Corporation, para
estimar el tamaño del fragmento amplificado, observándose luego en el transiluminador,
después de ser coloreado con Bromuro de Etidio (5μg/ml).
Digestión enzimática de los productos amplificados:
El producto de amplificación de 198 pb se sometió al digestión con la enzima de
restricción Hinf I, esta enzima reconoce el sitio de restricción creado por la transición C
por T en la posición 677. El alelo mutante T se corta en dos fragmentos, uno de 175 pb y
otro de 23 pb sin cortar el alelo normal (C). Se preparó una mezcla o cóctel de reacción
con los componentes que se muestran en la tabla III. El total de la mezcla de reacción fue
de 10 μl, al agregarle 10 μl del producto amplificado se obtuvo un volumen final de 20 μl,
el cual se incubó en baño María durante 4 horas a 37ºC.
Posteriormente se realizó la caracterización de los productos
mediante la
electroforesis en gel mediano de Poliacrilamida al 15%, el cual se dejó migrar 10 cm.,
visualizando los productos digeridos utilizando la tinción de Nitrato de Plata.
Pacientes y métodos
La interpretación del genotipo fue homocigota CC cuando se observó solo una
banda de 198 pb; homocigota TT cuando se visualizó una banda de 175 pb y otra de 23
pb y heterocigotas CT para el polimorfismo cuando se observaron tres fragmentos de
198 , 175 y 23 pb.
Análisis Estadístico.
A partir de las frecuencias genotípicas, se calcularon las frecuencias alélicas en los dos
grupos por conteo directo manual y se verificó su ajuste al modelo de Equilibrio de Hardy
Weinberg, utilizando el estadístico Chi cuadrado (Х 2 ), a un nivel de significación de < 0,05.
Se utilizó el mismo estadístico para calcular la diferencias entre las frecuencia alélicas entre
madres de Síndrome Down y madres controles
Para establecer la relación entre la presencia del alelo T en la variante 677C>T en el gen
de la MTHFR y el incremento de riesgo de tener niños con síndrome Down, se compararon las
frecuencias de los genotipos mutantes (CT y TT) con el genotipo normal (CC), en las madres
de niños con Síndrome Down y las madres controles, con el estadístico “Odds Ratio”, cuyos
valores >1 indican asociación entre las dos variables. Para el procesamiento de este estadístico,
se utilizó el paquete SAS/STAT (Statistical Analysis System).
Resultados
Características de las madres de niños con síndrome Down.
Se estudiaron 50 madres con una edad promedio de 28.06 ± 6.78 años, con una mínima de 17
y máxima de 39. Una de esas madres (2%), reportó ingesta de ácido fólico periconcepcional.
Descripción de genotipos.
Más del 50 % de las madres de niños con síndrome Down (MSD) fueron homocigotas C/C,
mientras que en las madres controles (MC) más del 50% fueron heterocigotas C/T. En ambas grupos
menos del 10% fueron Homocigotos TT (Tabla IV).
De las madres homocigotas normales (CC);
60% (27/45)
fueron madres de niños con
Síndrome de Down, de las madres homocigotas T/T, el 67 % (6/9) tuvo hijos con Síndrome Down y
de las madres con al menos un alelo alterado, 58% (32/55) tuvo hijos sanos (tabla V).
Frecuencias Alélicas.
En cuanto a las frecuencias alélicas, no se encontraron diferencias significativas entre las MSD
y MC, ni en la frecuencia del alelo T ni en la del alelo C. (Х 2 = 0,83; P > 0,05). (Tabla VI).
El polimorfismo estudiado se encontró en Equilibrio de Hardy Weinberg tanto en el grupo de
las MSD (Х 2 = 1.5249, P>0.05) como en el grupo de las MC (Х 2 =3.76, P>0.05).
Resultados
Alelo materno T en el polimorfismo 677C>T del gen MTHFR y relación con el riesgo de
tener hijos con Síndrome Down.
Las frecuencias genotípicas en las MSD fueron
54% CC, 34% CT y 12% TT, y las
correspondientes a las MC fueron 36%, 58% y 6% respectivamente. No se encontraron diferencias
significativas en las frecuencias de los genotipos entre los dos grupos. (Tabla V). CC/CT OR: 0,39
[0,16- 0,90]; CC/TT OR: 1,33 [0,29 – 6,02](Tabla VII).
La combinación de homocigotos con heterocigotos (CT + TT) tampoco mostró diferencias
significativas entre las MSD y las MC. (OR: 0,48 [0,21- 1,06]) (Tabla VII)
Discusión
El Síndrome de Down es la anomalía cromosómica mas frecuente en recién nacidos vivos
y la de mayor sobrevida; es la causa mas frecuente de retardo mental y es responsable del mayor
número de referencias a las consultas de Genética Médica. Más del noventa por ciento de los
casos se deben a trisomías libres, en las cuales, se ha podido demostrar que en el 95% de ellas, la
no-disyunción ocurrió en la meiosis I siendo la edad materna aumentada, el único factor
reconocido hasta la fecha. Sin embargo, el 75% de las trisomías libres ocurren en madres jóvenes
y aún, en la década de la secuenciación del genoma humano, se desconoce el mecanismo
molecular que subyace al fenómeno de la no-disyunción.
En este sentido, en la década del 90, se propone como hipótesis para explicar la nodisyunción, la hipometilación del ADN y la consecuente inestabilidad cromosómica que ella
genera y que puede ser causada por alteraciónes en la vía metabólica del folato. Varios estudios
han mostrado que una variante termolábil de la enzima MTHFR afecta el metabolismo del folato,
causa de leve a moderada hiperhomocisteinemia y disminuye el aporte de grupos metilo. El gen
de la MTHFR fue clonado en 1994 y se han descrito 18 mutaciones, 14 de muy baja frecuencia
que se asocian a un déficit enzimático variable pero severo y 4 relativamente comunes que
originan una deficiencia enzimática de grado variable. (36)
De estas últimas, la primera descrita fue la transición 677C>T que codifica la variante
termolábil de MTHFR con una actividad enzimática menor de 50%. Esta transición se ha
estudiado extensamente y se ha asociado a aumento de riesgo para defecto del tubo neural
(DTN), enfermedad vascular y algunas neoplasias. También se ha asociado a disminución de
riesgo para cancer colorectal, leucemias en adultos y linfoma maligno. (18). De todas estas
asociaciones, la mas estudiada y aceptada es la que involucra un mayor riesgo para defectos del
tubo neural (DTN). Efectivamente, la frecuencia del alelo T en los diferentes grupos étnicos se
correlaciona con la incidencia de los DTN, común entre hispanos, menos frecuente en blancos no
hispanos y rara en negros; sin embargo es interesante recordar que en 30% de los pacientes con
DTN, no existe asociación entre la variante y el mayor riesgo.(40)
Discusión
Otro hecho importante es que varios estudios también sugieren que los riesgos asociados
con esos genotipos se pueden modificar dependiendo de factores maternos como los niveles
sanguíneos de folato y de allí la recomendación de los diferentes servicios de salud pública en los
países desarrollados y en muy pocos en desarrollo de que la mujeres en edad de concebir deben
consumir 400 ugr de ácido fólico diario, periconcepcional, conducta que ha originado un
descenso en el riesgo de recurrencia para DTN de 75%.(40).
En las últimas décadas, el polimorfismo 677C>T ha sido asociado a un mayor riesgo de
aparición de trisomía 21 libre, especialmente en madres jóvenes (27, 28, 30,31). Uno de los
objetivos de este trabajo fue determinar las frecuencias alélicas y genotípicas de dicho
polimorfismo en madres de niños con Síndrome de Down (MSD) y en las madres controles
(MC). Este estudió encontró una frecuencia del alelo T de 0.29 y del homocigoto TT de 12% en
MSD, la Tabla VIII permite observar que estas frecuencias son mayores que las reportadas en
madres turcas (TT: 7,2%); francesas (TT: 7%), irlandesas (TT:5%) e hindúes (TT:3,5%) y
menores que las MSD de USA y de Italia ; cuya frecuencia de homocigotos TT fue de 14% y
18,3% respectivamente; estos datos confirman la extensa variabilidad geográfica y étnica de la
variante 677C>T, que ya había sido reportada y contrario a lo reportado en los DTN, estos
resultados no se relacionan ni con la frecuencia, ni con el riesgo para presentar el síndrome de
Down.
El objetivo mas importante de este trabajo fue determinar la asociación entre el
polimorfismo y el mayor riesgo para el síndrome y se llegó a la conclusión que no existen
diferencias significativas en la frecuencia de los alelos T y C en madres de niños con síndrome
Down (MSD) y en madres controles (MC). De acuerdo a nuestros resultados la presencia del
polimorfismo 677C>T en el gen MTHFR no es un factor de riesgo para Síndrome Down. Este
resultado confirma lo reportado en otros trabajos y refuta lo reportado por otros.
En este sentido James y colaboradores estudiaron la frecuencia de este polimorfismo en
57 madres de niños con síndrome Down (MSD) y la compararon con 50 madres control (MC). En
las MSD el 14% fueron homocigotas para el polimorfismo mientras que en las MC fue de 8%. El
polimorfismo le confiere 2,6 veces mayor riesgo de tener niños afectados; asimismo, se observó
Discusión
un incremento significativo en los valores de homocisteina y en la citotoxicidad al metrotexate
en las MSD lo que es consistente con la reducida habilidad de adaptación al déficit de folato.(27)
Un estudio americano posterior, en el mismo laboratorio, confirma la asociación con este
polimorfismo y también con el 66A>G en el gen MTRR, involucrado anteriormente con riesgo
para DTN. Se evaluaron 157 muestras de MSD y 144 MC; el alelo T fue dos veces más común en
las MSD que en los controles. Además, las homocigotas para el polimorfismo 66A>G en el gen
MTRR tuvieron un riesgo aumentado en 2.57, mientras que la combinación de los dos
polimorfismos fue asociado con un riesgo de 4,1. (28). Asimismo, en Brasil se analizó la
frecuencia de este polimorfismo en 36 MSD y 200 controles encontrando una mayor proporción
de alelos T en el grupo de MSD con una P = 0.02. (30) En ese mismo orden de ideas, un estudio
Irlandés evaluó 48 MSD y 192 MC, reportando que las madres con ambos polimorfismos tienen
un riesgo 3 veces mayor de tener hijos afectados. (31).
Por otra parte, en Italia se analiza el polimorfismo 677C>T en 64 MSD y 112 controles
sin encontrar incremento de riesgo para SD en las madres portadoras del alelo T (34). La
probable explicación es que la elevada concentración de folato plasmático en la población
producto de la dieta mediterránea, contrarresta el efecto de este polimorfismo. En ese mismo
sentido, un estudio francés compara la frecuencia de este polimorfismo en 85 madres de fetos con
trisomía 21 libre confirmada por estudio citogenético y en 107 controles, sin encontrar asociación
entre estas variables (33). Estos resultados son similares a los reportados en USA por
Yanamandra y colaboradores, donde la frecuencia del alelo T fue similar en los casos y controles,
no encontrando relación entre la presencia de este alelo y el mayor riesgo de tener hijos con
síndrome Down al estudiar 22 embarazadas con fetos con trisomía 21 libre y 375 controles.( 41).
De igual forma, Boduroglu y colaboradores en Turquía, analizan los polimorfismos 677C>T y
1298 A>C en el gen MTHFR en 152 MSD y 91 MC sin encontrar relación entre estas variantes y
el mayor riesgo de tener hijos afectados con SD (35).
Ante estos resultados, se debe analizar todos los factores a favor y en contra de la
asociación. Sólo tres trabajos la confirman (USA y Brasil), en dos de ellos, la muestra estudiada
es bastante pequeña (57 y 36) y el tercero estudia 157 madres lo que la hace una de las muestras
Discusión
mas numerosa que se ha reportado. Por otro lado, las investigaciones realizadas en USA, Francia,
Irlanda, India, Italia y Turquía niegan la asociación, pero de ellas sólo la muestra de Turquía,
estudia 152 MSD, todos los demás trabajos, incluyendo el presente, estudian muestras de tamaño
menor. Este hecho nos lleva a considerar que mientras menor sea el tamaño muestral, más difícil
será evaluar la significación de los resultados y esta desventaja se suma al hecho de que todas las
muestras examinadas son muestras no probabilísticas, lo que impide la generalización de los
resultados obtenidos al universo de madres de niños con Síndrome de Down. Otro factor
importante a considerar es que sólo los trabajos de Petersen y col (32) y Chadefaux y col (33) que
también niegan la asociación, determinan el origen parental del cromosoma trisómico, es decir
que son los únicos que descartan el 10% de los casos en donde la no-disyunción fue paterna; sin
embargo, la baja frecuencia de no disyunción paterna no debe ser un factor que modifique los
resultados reportados en los estudios.
Asimismo, otros datos que refutan la asociación del polimorfismo y la propensión a la no
disyunción, son los trabajos publicados por Hassold y colaboradores (42) quienes estudiaron el
polimorfismo materno 677C>T en 93 casos de trisomías de cromosomas sexuales, 44 de trisomía
18,
y 158 casos de trisomías de los autosomas 2,7,10,13,14,15,18 y 22 y dado que sólo
observaron un significativo aumento de dicho polimorfismo en madres de niños con trisomía 18,
concluyen que al menos para trisomías de cromosomas sexuales y de un grupo combinado de
trisomías autosómicas, los polimorfismos en la vía metabólica del folato no son un contribuyente
significativo a la no disyunción meiótica humana.
La firme asociación entre las alteraciones del metabolismo del folato y los defectos de
cierre de tubo neural, pudiera hacer pensar que en estas familias el riesgo de tener hijos con
síndrome Down fuera mayor. En este sentido, en el 2003, Amorin y colaboradores (43) analizan
los nacimientos en el Estudio Colaborativo Latinoamericano de Malformaciones Congénitas
(ECLAMC) entre los años 1982 y 2000, buscando agregación familiar de DTN y Síndrome
Down, y reportan que no hay asociación entre familias con riesgo para DTN y aquellas con riesgo
para SD. Finalmente, quizás uno de los aportes mas significativos sea el de Ray y colaboradores
en el mismo año (44), quienes analizan la prevalencia de la trisomía 21 antes y después de la
fortificación de alimentos con ácido fólico en Canadá, y reportan que no hubo disminución en la
Discusión
frecuencia de trisomía 21 posterior a la misma, contrario a lo que ocurre con respecto a los DTN
lo que descarta la acción preventiva del ácido fólico en ese síndrome.
En ese mismo orden de ideas, en el momento de la toma de las muestras, en este trabajo
(datos no reportados) se analizó la concentración de folatos en sangre periférica en las madres de
niños con síndrome Down (MSD) y en el grupo de madres control (MC), dando como resultado
en el grupo total, una media de 9.2411 ± 4.7216 ng/ml. Para el grupo de MSD, la media de folato
fue ligeramente menor (8.5936 ± 4.0066 ng/ml) que la de MC (9.8765 ± 5.2936 ng/ml), pero esas
diferencias no fueron estadísticamente significativas. Ya que sólo una de las madres admitió la
ingesta de ácido fólico, estos resultados sugieren que la dieta de las madres estudiadas en el
presente trabajo debe ser rica en folatos, y que al igual que en Francia e Italia, pudiera neutralizar
el efecto metabólico de este polimorfismo en caso de existir tal asociación.
Finalmente, es interesante discutir lo reportado en cuanto al trabajo de Boduroglu y
colaboradores en Turquía, en 2004 (35). Este autor estudia 152 MSD y 91 MC y aplicando el
estadístico Odds ratio no demuestra diferencias estadísticamente significativas entre la presencia
del alelo T y la frecuencia de niños con Síndrome Down. Ellos reportan dos valores de OR
(CC/CT y CC/TT) mayores a 1 (CC/CT: OR 1.24 [0.71-2.15] P=0.48; CC/TT: OR 2.48 [0.669.25] P=0.25), pero sus valores de P fueron mayores de 0,05 y por tanto, estadísticamente no
significativos. A pesar de todos los argumentos en contra, en el año 2004, Martínez Frías y
colaboradores (45) en una carta al editor, discuten los resultados de Boduroglu y col. y concluyen
que no debe descartarse la posible significación, ya que los intervalos de confianza encontrados
sugieren que la muestra es muy pequeña para alcanzar resultados significativos y citan diversos
trabajos de expertos en Estadística que sugieren que en Biología, deben tomarse mas en cuenta
los intervalos de confianza al analizar la pruebas de hipótesis.
Para concluír, lo único que justificaría seguir estudiando la significación de esta
asociación seria la debilidad metodológica de la mayoría de los trabajos publicados, ya que
ninguno ha logrado reunir una muestra de madres de SD de tamaño significativo para que los
resultados puedan considerarse estadísticamente confiables y que tome en cuenta el aporte
Discusión
paterno a la no-disyunción, por tanto se sugiere antes de descartar la asociación, diseñar un
programa nacional colaborativo que involucre diferentes laboratorios venezolanos que estén
trabajando en Genética molecular como Barquisimeto, Mérida, IVIC y Ciudad Bolívar que
garantice un aumento significativo del tamaño muestral, que la muestra sea representativa, y que
en el cual se determine el origen parental de la no-disyunción y se estudien otros polimorfismos
de la MTHFR y de la MTRR, evaluando paralelamente la concentración de folatos en sangre
periférica.
Conclusiones y recomendaciones
1.- La revisión exhaustiva de la literatura, permite concluir que este es el primer trabajo en
Venezuela que intenta demostrar la asociación entre el mayor riesgo de recurrencia para
Síndrome Down y la presencia del polimorfismo 677C>t
2- La frecuencia del alelo T y del homocigoto TT en MSD en la muestra analizada, es similar a
las reportados en otros trabajos que analizan esta asociación.
3.- Las poblaciones estudiadas se ajustan al modelo de equilibrio de Hardy Weinberg .
4.- No se demostró asociación entre la presencia del alelo T en el polimorfismo 677C>T en el gen
de la MTHFR y el incremento de riesgo de tener niños con Síndrome de Down.
5.- La literatura revisada y el análisis de los resultados permite sugerir el diseño de un Programa
de investigación que incluya: un aumento significativo del tamaño muestral, lo cual podría
lograrse a través de un esfuerzo colaborativo con otros laboratorios de Genética del país, como
Barquisimeto, IVIC, Mérida y Ciudad Bolivar; que incluya madres venezolanas de diferentes
edades, determine del origen parental de la no-disyunción, estudie otros polimorfismos de la
MTHFR y de la MTRR que han sido involucrados en otras investigaciones y se evalúe
paralelamente la concentración de folatos en sangre periférica, en las poblaciones estudiadas.
Tablas
Tabla I. Reactivos utilizados en la Reacción en Cadena de la Polimerasa. (PCR).
REACTIVOS
VOLUMEN
Buffer Taq 10X
2.5 μl
Primer 1 (10μM)
1.0 μl
Primer 2 (10μM)
1.0 μl
Dntp`s (10μM)
0.5 μl
MgCl2 (25 mM)
2.0 μl
Agua ultrapura
12.5 μl
Taq polimerasa (5 U/ μl)
0.5 μl
Volumen total (coctel)
20 μl
Volumen de muestra (ADN)
5.0 μl
VOLUMEN FINAL
25 μl
Tablas
Tabla II. Etapas de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para 677C>T en
MTHFR.
ETAPAS
TEMPERATURA
TIEMPO
Desnaturalización
prolongada
94ºC
5’
Desnaturalización corta
94ºC
30’’
Apareamiento primers
65ºC
30’’
Extensión
72ºC
30’’
72ºC
10’
32 ciclos desde el paso 2
al 4
Extensión prolongada
Tabla III. Reactivos utilizados para la digestión enzimática: Hinf I.
REACTIVOS
VOLUMEN
Producto amplificado
10 μl
Buffer de la enzima
2 μl
BSA
2 μl
Multicore
2 μl
Agua ultrapura
3 μl
Enzima Hinf I.
1 μl
VOLUMEN FINAL
20 μl
Tablas
Tabla IV
Clasificación de las madres según Genotipo. Maracaibo, Edo. Zulia, 2004.
Genotipo
N
%
C/C (Homocigotas normales)
45
45
C/T (Heterocigotas)
46
46
T/T (Homocigotas mutados)
9
9
100
100
Total
Fuente: Formato de recolección de datos
Tabla V
Clasificación de las madres según su Genotipo y Síndrome de Down. Maracaibo, Edo. Zulia,
2004.
Genotipo
Homocigotas C/C
Heterocigotas C/T
Homocigotas T/T
Total
Fuente: Resultados del SPSS.
Hijos con Síndrome de
Down
Si
No
Total
27
(54%)
17
(34%)
6
(12%)
50
18
(36%)
29
(58%)
3
(6%)
50
45
46
9
100
χ2
5.93
g.l.
2
Significación
Estadística
0.052
Tablas
Tabla VI.
Frecuencias alélicas para la variante 677C>T en madres de niños con síndrome Down y controles.
Maracaibo, Edo. Zulia, 2004.
Alelos
Madres niños
Down
0.71
C
T
Madres
Control
0.65
χ2
P
0.35
0.83
› 0.05
0.29
Fuente: Resultados del SAS.
Tabla VII. Cálculo de riesgo para los genotipos la variante 677C>T en el gen MTHFR.
Maracaibo, Edo. Zulia, 2004.
Hijos con Síndrome de Down
Genotipo
Si
Odds
Ratio
No
95%
IC
P
Homocigotas C/C
27 (54%)
18 (36%)
45
1
----
----
Heterocigotas C/T
17 (34%)
29 (58%)
46
0.39
0.16-0.90
0.028
Homocigotas T/T
6 (12%)
3 (6%)
9
1.33
0.29-6.02
0.70
CT+TT
23
32
55
0.47
0.21-1.06
0.07
Fuente: Resultados del SAS.
Tablas
Tabla VIII. Frecuencias alélicas y genotípicas en Madres con Síndrome de Down
(MSD) y en madres controles (MC) en trabajos publicados en la literatura.
MSD
Autores
País y Año
MC
C
T
C
T
James et al
USA
1999
0,56
0,44
0,70
0,30
Hobbs et al
USA
2000
0,59
0,41
0,69
0,31
Chadefaux et al
Francia
2002
0,68
0,32
0,64
0,36
Stupia et al
Italia
2002
0,56
0,44
0,52
0,48
Brunelli et al
Brasil
2002
--
0,37
--
0, 29
Yanamandra et al
USA
2003
--
0,36
---
0,35
Boduroglu et al
Turquía
2004
0,75
0,25
0,80
0,20
Presente trabajo
Venezuela
2005
0,71
0,29
0,65
0,35
MSD: Madres con niños con Síndrome Down.
MC: Madres controles.
Tablas
Tabla IX.
Tabla resumen de los estadísticos descriptivos del Folato (ng/ml). Maracaibo, Edo. Zulia, 2004.
Media
Aritmética
General
Madres
de
hijos
Síndrome Down
Desviación Valor
Típica
Mínimo
Valor
Máximo
n
9.2411
4.7216
2.70
23.50
100
8.5930
4.0066
2.70
19.50
50
9.8765
5.2936
2.90
23.50
50
con
Controles.
Fuente: Resultados del SPSS.
Tabla X.
Tabla Resumen de la prueba t de Student de muestras independientes para la comparación de
medias de Folato según el genotipo. Maracaibo, Edo. Zulia, 2004
Genotipo
C/C
Media
Aritmética
8.8889
9.3518
C/T+T/T
Fuente: Resultados del SPSS.
Desviación
Típica
4.2233
4.9871
Diferencia
de Medias
Prueba t
Significación
Estadística
-0.4629
-0.494
0.622
Anexos
Anexo Nº 1. Metabolismo del folato.
Síntesis ADN
Dihidrofolato
DHFR
dTMP
THF
TS
dUMP
Metionina
5-10-metilene-THF
SAM
B12
MTRR
MTHFR
5-Metil-THF
SAH
Homocisteína
Metilación ADN
Anexos
Anexo Nº 2. Diagrama del gen MTHFR.
Anexos
Anexo Nº 3. Imagen Fotográfica del Producto de Amplificación del Polimorfismo
677C>T en el Gen MTHFR en un grupo de muestras analizadas.
MPM
198 pb
Gel de agarosa 2%. Tinción: Bromuro de Etidio.
MPM: Marcador de peso molecular.
198 pares de bases. (pb)
Anexos
Anexo Nº 4. Imagen Fotográfica del producto de digestión con la enzima HinfI en un
grupo de muestras analizadas (Gel de poliacrilamida al 15%. Tinción: Nitrato de Plata)
MPM CC TT
CC CT
CC
CT TT
TT
MPM: Marcador peso molecular.
CC: Genotipo homocigoto para ausencia de corte con la enzima HinfI.(198 pb).
CT: Genotipo heterocigoto para la enzima HinfI.(198 pb, 175 pb, la banda de 23 pb no se
evidencia en el gel)
TT: Genotipo homocigoto para la presencia de corte con la enzima HinfI.(2 bandas de 175 pb,
las bandas de 23 pb no se evidencian en el gel)
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