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CAPITULO IV
RESPIRACIÓN AEROBIA
4.1. DEFINICIÓN Y CARACTERÍSTICAS DE LA RESPIRACIÓN AEROBIA
La respiración aeróbica implica reacciones que suministran energía y que dependen
del oxigeno. Si el substrato es un azúcar simple y se le extrae el máximo de energía,
obtenemos el proceso representado en la siguiente reacción:
C6HI1206+ 6 O2→ 6CO2 + 6H2O
Además, probablemente se formen cerca de 38 moléculas de ATP. Todos los átomos
de hidrógeno son removidos y reaccionando con el oxigeno forman agua, que es otro
producto microbiano. Los átomos de carbono son separados uno del otro y adheridos
al oxigeno con el fin de producir dióxido de carbono que es otro producto
microbiano.(Figura Nº 4.1).
Este es el ejemplo clásico de la respiración aeróbica, dado que se verifica en animales
y en una variedad de microorganismos y plantas. En vista de que el oxigeno
desempeña un papel prominente debido a que reacciona con los átomos de hidrógeno
y de carbono se reconoce a esta reacción como oxidación.
Dentro de la célula, el proceso se lleva a cabo a través de pequeñas secuencias, cada
una catalizada por una enzima y con la producción de ATP (adenosina–trifosfato), en
ciertas etapas. De esta manera, la energía química disponible se convierte en luz y
calor por medio de una combustión que se utiliza en la formación de ATP en la
oxidación celular. Las células no son completamente eficientes en el uso de la energía
y producen algo de calor más el ATP correspondiente.
Las bacterias son muy versátiles en cuanto a la gran variedad de compuestos
orgánicos que utilizan en la respiración aeróbica. A pesar de que el término respiración
siempre se aplicó a la respiración animal y al intercambio de oxigeno y dióxido de
carbono, ahora tiene un significado más amplio. La respiración aeróbica incluye todas
las reacciones que proveen energía a la célula, siempre y cuando el oxigeno sirva
como aceptor del hidrógeno, como en el ejemplo previo. Se dice que el oxigeno es el
125
aceptor terminal del hidrógeno, o bien, de los electrones que acompañan a los átomos
de hidrógeno.
Figura Nº 4.1. Procesos del Metabolismo Celular
Fuente: (Atlas R.M. y R. Bartha. 2005).
La definición más precisa de respiración aeróbica es: la serie de reacciones que
suministran energía, en las cuales el oxigeno es el aceptor final de electrones. La
respiración aeróbica realizada por las células microbianas o por preparaciones de
tejidos puede medirse al registrar el grado de consumo de oxigeno. (Figura Nº 4.2)
Figura Nº 4.2. Respiración Aerobia
Fuente: (Dreyfus Cortés Georges, 1995).
126
4.2. ASIMILACIÓN DEL OXIGENO
El concepto de respiración se deriva del clásico proceso respiratorio de
Lavoisier, según el cual los organismos vivos consumen oxígeno de un modo
análogo a la combustión de la materia orgánica. De hecho, muchos
microorganismos llevan a cabo dicho proceso en el cual el oxígeno molecular
se convierte en agua en tanto que algún sustrato orgánico desaparece el medio
y todosu carbono se recupera como CO2. El desarrollo de muchos
microorganismos en cultivo puro en un medio con glucosa se realiza de
acuerdo con la estequiometría:
Todo el hidrógeno de la glucosa ha pasado al oxígeno para formar agua. Sin
embargo, las bacterias del ácido acético pueden reducir el O2 a H2O sin formar
CO2. En muchos hongos microscópicos se lleva a cabo una degradación parcial
de la glucosa análoga a la oxidación del etanol, con la acumulación de
productos orgánicos característicos que están parcialmente oxidados y son
diferentes del acetato. Figura Nº 4.3.
Figura Nº 4.3. Respiración Aerobia. Metabolismo energético más eficiente.
Eucariotas, mayoría de bacterias y 50 % de archaeas
Fuente: (Koolman, J. y K, H. Rohm. 2004).
127
Algunos ejemplos ilustrativos pueden ser los siguientes:
Por lo tanto es consistente considerar que la reducción del oxígeno en la
respiración puede llevar tanto la mineralización como a la degradación parcial
de los sustratos orgánicos.
El oxígeno también puede reducirse biológicamente con reductores inorgánicos
como H2, compuestos reducidos de nitrógeno o con compuestos reducidos de
azufre o hierro. Esto tiene lugar en el desarrollo de bacterias que pueden crecer
en medios minerales utilizando CO2como única fuente de carbono.
De hecho, el mismo proceso respiratorio puede considerarse independiente O2,
porque existen microorganismos que pueden utilizar en su lugar NO3-, SO42-,
CO2. . De ahí que se distinga una respiración aerobia de otra anaerobia.
128
En todo caso, la respiración está ligada a un proceso generador de energía
para el crecimiento. No obstante, la reducción biológica del O2 no siempre va
unida a la producción de ATP.
La fosforilación que se lleva a cabo con la reducción de oxigeno y el sistema de
transposición de protones y la reacción ATPásica es una característica obligada
de algunas bacterias estrictamente aerobias como Azotobacter, Caulobacter y
muchas Pseudomonas. Sin embargo, ya hemos visto que este mismo sistema
puede funcionar anaerobiamente en la reducción del CO2 a ácido acético o a
metano, y también tiene lugar en la reducción de NO-3 y de SO42-.
4.3. PRINCIPALES ENZIMAS QUE PARTICIPAN
El mecanismo de la respiración aerobia consiste de una vía de reacciones
enzimáticas de las cuales los principales productos de la respiración anaerobia
son oxidados para proporcionar energía, agua y bióxido de carbono. Aunque el
oxígeno es un reactivo solamente en el paso final del proceso aerobio, es una
reacción indispensable y el mecanismo podría cesar si el oxígeno fuera
retenido.Cuadro Nº 4.1 y Figura Nº 4.4.
Cuadro Nº 4.1. Enzimas participantes de las reacciones de la Respiración
Celular
129
Fuente : Murray, R. K. et. al. 2005.
Figura Nº 4.4. Esquema simplificado del Sistema de Ciclo de Krebs
Fuente: (Brook, G. F.; Janet Butel y Sthepan, A. Morse, 2005)
130
4.4. CICLO DE LOS ÁCIDOS TRICARBOXILICOS (CAT)
4.4.1.Características y Rol Bioquímico del CAT
El ciclo de Krebs también conocido como ciclo del ácido cítrico es la vía común
final de oxidación del ácido pirúvico, ácidos grasos y las cadenas de carbono de
los aminoácidos. Figura Nº 4.5.
El CAT es la vía metabólica más importante para la generación de ATP en las
bacterias aerobias. La oxidación completa de una molécula de acetato a CO2
genera tres moléculas de NADH + H+, una molécula de ATP y un par de e-.
Estos últimos entran en las cadenas respiratorias directamente reduciendo el
FAD. Los nucleótidos de la piridina reducidos se re oxidan también a través de
las cadenas respiratorias.
En las bacterias anaerobias se encuentra la mayor parte de los enzimas del
CAT, pero éstos no tienen la capacidad de transformar el α – cetoglutarato en
acido succínico. El ciclo queda interrumpido en este punto y no es funcional
como sistema terminal de oxidación.
Las bacterias autótrofas obligadas tampoco tienen un CAT funcional. Carecen
de α – cetoglutarato deshidrogenasa y tienen niveles muy bajos de las
deshidrogenasas succínica y málico.
El CAT tampoco es funcional en los metilotrofos obligados que tienen sistemas
membranosos transversales al eje mayor como Methylomonas, Methylobacter y
Methylococcus.
La primera reacción del ciclo ocurre cuando la coenzima A transfiere su grupo
acetilo (de 2 carbonos) al compuesto de 4 carbonos (ácido oxalacético) para
producir un compuesto de 6 carbonos (ácido cítrico).
El ácido cítrico inicia una serie de pasos durante los cuales la molécula original
se reordena y continúa oxidándose, en consecuencia se reducen otras
moléculas: de NAD+ a NADH y de FAD+ a FADH2. Además ocurren dos
carboxilaciones y como resultado de esta serie de reacciones vuelve a
obtenerse una molécula inicial de 4 carbonos el ácido oxalacético.
131
El proceso completo puede describirse como un ciclo de oxalacético a
oxalacético, donde dos átomos de carbono se adicionan como acetilo y dos
átomos de carbono (pero no los mismos) se pierden como CO2.
Figura Nº 4.5. Etapas Generadoras de Energía del Ciclo de Krebs
Fuente: (Mathews, C. K, K. E. Van Hold y K. G. Ahern, 2002)
Ahora que hemos descrito las características del sistema de transporte de
electrones, podemos considerar su función en la oxidación del ácido pirúvico, el
intermediario clave en la oxidación de la glucosa.
El ácido pirúvico conserva la mayor parte de la energía presente en la glucosa y
la mayoría de los organismos aerobios son-capaces de oxidar completamente
ese compuesto a CO2 a través de una serie de pasos denominados ciclo del
ácido tricarboxílico.
El NADH2 formado en el ciclo del ácido tricarboxílico es oxidado de nuevo por
medio de un sistema de transporte de electrones, con producción concomitante
de ATP por medio de la fosforilación oxidativa.
132
El ácido pirúvico es primero descarboxilado, determinando la producción de una
molécula de NADH2 y de un radical acetilo acoplado con la coenzima A (CoA).
El acetilcoenzima A (abreviado. acetil-CoA) constituye una forma activada del
acetato, siendo el enlace del acetil-CoA rico en energía.
Además de resultar un intermediario fundamental del ciclo del ácido
tricarboxílico, el acetil-CoA también desempeña muchas otras funciones
importantes en la biosíntesis.
El grupo acetilo del acetil-CoA se combina con el compuesto tetracarbonado
ácido oxalacético, conduciendo a la formación de ácido cítrico, un ácido
orgánico de seis carbonos, utilizándose la energía del enlace rico en energía
del acetil-CoA para llevar a cabo esta síntesis.
Después siguen reacciones de deshidratación, descarboxilación y oxidación, y
son liberadas dos moléculas de C02.
Por último, es regenerado el ácido oxalacético, y puede servir de nuevo como
un aceptor de acétilo, completándose así el ciclo.
En la Figura Nº 4.6. se representa una visión de conjunto de las reacciones del
ciclo.
133
Figura Nº 4.6. Esquema detallado del Ciclo de Krebs
Fuente: (Nelson, D.L y M.M. Cox y C.M.,2005)
4.4.2. Sistemas Enzimáticos del CAT
En el CAT existen siete sistemas enzimáticos. Todos los sistemas enzimáticos son
reversibles excepto la oxidación de α – cetoglutarato, la cual requiere TPP, ácido
134
lipoico, CoA, FAD y NAD+. Una excepción la constituye Chlorobium thiosulfatophilum,
donde se ha encontrado una reacción de carboxilación
de
succinil – CoA
dependiente de la ferredoxina, unida a una 2 – oxoglutarato sintasa.
El oxalacetato es el compuesto clave del CAT porque es el aceptor de acetil-CoA. Esta
reacción está catalizada por la citrato sintasa.
Este sistema es inhibido por el α-cetoglutarato, por NADH+H+, ATP y el succinil-CoA
La segunda etapa está constituida por unas reacciones de hidratación catalizadas por
la enzima aconitatohidratasa.
Se forma una mezcla en equilibrio de ácido cítrico, cis-aconitico isocítrico. Se conocen
varias aconitasas. Se requiere Fe2+.
El tercer sistema es el de la isocitrato deshidrogenada (ICDHasa).
135
No se ha demostrado la existencia de una oxalosuccínico descarboxilasa por lo que el
mismo enzima debe catalizar las dos reacciones.
La cuarta reacción está constituida por el sistema de la
α-cetoglutarato
deshidrogenasa:
El sistema de la α – cetoglutarato deshidrogenasas comprende un complejo de
enzimas que llevan a cabo una descarboxilación oxidativa del α – cetoglutarato
semejante a la del piruvato.
En esta reacción se produce la segunda mólecula de CO2. Participan el NAD+, Mg2+, el
ácido lipoico y el TPP en a y el ADP y Pi en b. Se origina ATP. El FAD interviene para
la regeneración del lipoico:
136
El sistema de la α – cetoglutarato deshidrogenasa juega un importante papel regulador
en las bacterias anaerobios facultativos. Es extraordinariamente sensible a la
deficiencia de oxígeno y está sujeta a represión por la glucosa. En condiciones
anaerobias, el CAT deja de existir como vía metabólica cíclica y la formación de α –
cetoglutarato tiene un sentido puramente biosintéticos; el succinato para las
necesidades biosintéticas se forma a partir del oxalacetato por lo que se denomina un
brazo reductor del CAT.
La quinta etapa es la deshidrogenación del succinato, catalizada por la succinato
deshidrogenasa.
(5)
La succinato deshidrogenasa toma los e- y queda en estado reducido. Su reoxidación
requiere FAD. También se requiere Fe2+. Es el único enzima del CAT que se
encuentran en la fracción particulada. La succinato deshidrogenasa es inhibida por el
oxalacetato. Cuadro Nº 4.2.
La sexta reacción final del CAT es la deshidrogenación del malato por la fumarato
hidratasa:
(6)
La reacción final del CAT es la deshidrogenación del malato a oxalacetato, catalizada
por la malato deshidrogenas que requiere NAD+:
137
(7)
En E. coli, la Malato deshidrogenasa dependiente de NAD+ es soluble, pero en
Azotobacter agilis y Micrococcus luteus hay, además, un sistema particulado. La
primera puede estar ausente en Serratia marcescens, Pseudomonas fluorescens y P.
ovalis, que tienes el sistema particulado ligado directamente al O2. Este sistema
también puede hallarse en Lactobacillus.
En E. coli se encuentra una malato deshidrogenasa dependiente de NAD+
constitutiva y, además, otra dependiente de NADP+ inducible.
Esta última cataliza la reacción:
Malato deshidrogenasa (descarboxilante (NADP+))
Este enzima es inhibido por el oxalacetato y acetil – CoA. También es inhibido por el
AMP cíclico. Al parecer tiene una función biosintética en relación con la formación de
ácidos grasos. En Micrococcus sp. es la única deshidrogenasa del malato presente y
juega un importante papel en la carboxilación del ácido pirúvico a malato.
En Chromatium no hay ninguno de los dos sistemas antes señalados de
deshidrogenación del málico. Sin embrago, el malato se convierte en oxalacetato por
una descarboxilacion a piruvato seguida de una recarboxilación del piruvato a
oxalacetato.
138
Cuadro Nº 4.2. Enzimas, Coenzimas, Tipo de reacción de cada molécula
participante del Ciclo de Krebs.
Molécula
Enzima
Tipo de reacción
Reactivos/ Productos/
Coenzimas Coenzima
I. Citrato
1. Aconitasa
Deshidratación
II. cis-Aconitato
2. Aconitasa
Hidratación
H2O
Oxidación
NAD+
NADH + H+
III. Isocitrato
IV.Oxalosuccinato
V. α-cetoglutarato
VI. Succinil-CoA
VII. Succinato
VIII. Fumarato
IX. L-Malato
X. Oxaloacetato
3. Isocitrato
deshidrogenasa
4. Isocitrato
deshidrogenasa
H2O
Descarboxilación
5. α-cetoglutarato
Descarboxilación
NAD+ +
NADH + H+
deshidrogenasa
oxidativa
CoA-SH
+ CO2
GDP
GTP +
+ Pi
CoA-SH
FAD
FADH2
6. SuccinilCoAsintetasa
7. Succinato
deshidrogenasa
Hidrólisis
Oxidación
8. FumaratoHidratasa Adición (H2O)
9. Malato
deshidrogenasa
10. Citrato sintasa
Oxidación
H2O
NAD+
NADH + H+
Condensación
Fuente: (Mathews, C.K.; K.E. Van Holde y K.B. Ahern, 2002)
4.5. BALANCE ENERGÉTICO DE LAS REACCIONES OXIDATIVAS
Contabilidad total de la Producción Aeróbica del ATP
Cuando una Molécula de Glucosa o Glucógeno se degrada mediante las Vías
aeróbicas produce un Total de:
-
38 Moléculas de ATP (Degradación Aeróbica de la Glucosa).
139
-
39 Moléculas de ATP (Degradación Aeróbica del Glucógeno): La
Producción GlucolItica Neta del ATP por el Glucógeno es una Molécula de
ATP Adicional en Comparación con la Glucosa.
Observando el balance parcial del ciclo de Krebs, se comprueba que en este
proceso no se obtiene energía directamente bajo la forma de ATP (sólo se
obtiene 1 GTP que es equivalente a 1 ATP). En cambio se obtienen cantidades
de coenzimas reducidas (NADH y FADH2), y es a través de la oxidación
posterior que se obtendrá la energía para sintetizar ATP.Cada coenzima NADH
equivale a 3 ATP y cada coenzima FADH2 equivale a 2 ATP. Cuadro Nº 4.3
Cuadro Nº 4.3 - Balance Parcial de la Respiración
PROCESO
SUSTRATO
GLUCÓLISIS
Glucosa
PRODUCTOS
2 ácido pirúvico
2 ATP
2 NADH
2 Acetil CoA
ENTRADA AL CICLO DE
KREBS
2 ácido pirúvico
2 CO2
2 NADH
4 CO2
CICLO DE KREBS
2 Acetil CoA
2 GTP (equivalentes a 2
ATP)
6 NADH
2 FADH2
6 CO2
2 ATP
Glucosa
2 GTP
10 NADH
2 FADH2
Fuente: (Koolman, J. y K, H. Rohm, 2004).
140
La producción de ATP en la oxidación aerobia de glucosa por células eucariotas es la
siguiente:
Vía glucolítica
Fosforilación a nivel de sustrato (ATP)
Fosforilación oxidativa con 2 NADH
2 ATP4
6 ATP
2 piruvato a 2 acetil-CoA
Fosforilación oxidativa con 2 NADH
6 ATP
Ciclo de los ácidos tricarboxílicos
Fosforilación a nivel de sustrato (GTP)
2 ATP
Fosforilación oxidativa con 6 NADH
18 ATP
Fosforilación oxidativa con 2 FADH2
4 ATP
Rendimiento aeróbico total
Rendimiento total de ATP
38 ATP
36 a 38 ATP
En algunas células el costo energético de transportar los electrones desde el NADH
formado en la glucólisis a través de la membrana mitocondrial interna deprime el
rendimiento neto de estos 2 NADH a sólo 4 ATP.
4.6. LA CADENA RESPIRATORIA
Es Responsable de la Fosforilación Oxidativa: La Producción Aeróbica dentro de la
Mitocondria o mesosoma.
Vía Metabólica Final Común en las Células Aeróbicas mediante la cual los Electrones
derivados de los diferentes sustratos son transferidos hacia el Oxígeno.
Serie de Reacciones de oxidación-Reducción realizadas por unas enzimas altamente
organizadas. Figura Nº 4.7.
141
Figura Nº 4.7. Transferencia de Electrones por la Cadena Respiratoria
Fuente: (Frenchel, T.G.M. y T. H. Blackburn, 1998)
Luego de la Glicólisis y del ciclo de Krebs, los electrones pasan a la cadena
transportadora de electrones, un sistema de transportadores de electrones ubicado en
la membrana interna mitocondrial, que actúan secuencialmente.
4.6.1. DESCRIPCION DE LA CADENA DE TRANSPORTADORES
La cadena de transportadores puede ser descrita como un gran proceso de 3 eventos,
que son:
142
1.
Transferencia de los electrones del NADH y FADH2 a otras sustancias, donde
finalmente se reoxidan a NAD+ y FAD para seguir participando en mas
reacciones redox.
2.
Los electrones transferidos participarán en la oxidación-reducción secuencial de
+10 centros redox en 4 complejos enzimáticos, antes de reducir el O2 a H2O.
3.
Durante la transferencia de los electrones, los H+ liberados por las coenzimas,
serán expulsados de la matriz mitocondrial al espacio intermembrana, y
creando una gradiente entre ambas. Finalmente, la ΔG de ésa gradiente
electroquímica conducirá la síntesis de ATP a partir de ADP y Pi a través de la
fosforilación oxidativa.
La cadena transportadora consiste de una serie de transportadores que actúan
secuencialmente y que están unidos a la membrana interna. Los transportadores son
proteínas integrales de membrana con grupos prostéticos capaces de aceptar y/o
donar 1 o 2 electrones. Figura Nº 4.8.
Figura Nº 4.8. Potencial de Oxido-reducción de los Transportadores de
Electrones.
Fuente: (Moat, A.G.; Foster, J.W. y M.P. Spector, 2002).
143
Los transportadores realizan 3 tipos de transferencias en todo éste proceso:
1.
Transferencia directa de electrones (asociada a metales)
2.
Transferencia de átomo de hidrógeno → H+ + e-
3.
Transferencia de ión hidruro → H- (H+ + 2e-)
Figura Nº 4.9. Complejos de la Cadena Respiratoria
Fuente: (Smith, C.A. y Wood, E.J., 1998)
En lasFigurasNº 4.9 y Nº 4.10 se muestra que existen 5 tipos demoléculas
transportadoras de electrones en éste proceso:
1. NAD+ y NADP+
2. Flavoproteínas
3. Ubiquinona
4. Proteínas Ferro-sulfuradas
5. Citocromos
144
Figura Nº 4.10. Energía libre y Potencial de Oxido reducción de las
Coenzimas que participan en la Cadena Respiratoria.
Fuente: (Smith, C.A. y Wood, E.J., 1998)
4.6.2. Cadena Transportadora de Electrones en Bacterias
En eucariotas, el NADH es el donador de electrones más importante. En procariotas,
es decir bacterias y arqueas la situación es algo más complicada, debido a que hay un
gran número de donante de electrones y un gran número de aceptores.
Si generalizamos el transporte en bacterias este podría quedar de la siguiente forma:
145
Puede que los electrones pueden entrar a la cadena en tres niveles: un nivel en
donde participa una deshidrogenasa, otro en la que actúa un reservorio de
quinonas, o en un nivel en el que actúa un transportador móvil como es el
citocromo. Estos niveles corresponden a sucesivos potenciales redox más
positivos o sucesivas bajadas de las diferencias en el potencial relativo en los
aceptores de electrones. En otras palabras, corresponden a cambios cada vez
menores en la energía libre de Gibbs.
Las bacterias pueden usar múltiples cadenas de transporte de electrones, e
incluso simultáneamente. Las bacterias pueden usar varios donadores
diferentes de electrones. Por ejemplo, Escherichia coli, cuando crece en
condiciones aeróbicas usando glucosa como fuente de energía, usa dos NADH
deshidrogenasas diferentes y dos quinol oxidasas diferentes, un total de cuatro
cadenas de transporte que funcionan simultáneamente.
Las bacterias también generan un gradiente de protones, para ello utilizan al
menos tres bombas de protones, al igual que las mitocondrias, aunque se han
descrito casos en los que solo existen dos o incluso una. Evidentemente
siempre tiene que existir al menos una bomba de protones para poder generar
el gradiente electroquímico, que es esencial para la generación de ATP.
En la respiración aerobia el aceptor final de los electrones es el oxígeno que se
reduce a agua. Pero hay organismos que son capaces de respirar sin oxígeno
llevando los electrones hasta otros aceptores con el mismo objetivo final,
obtener mucho ATP.
Hay organismos capaces de respirar:

Nitrato, generando nitrógeno (bacterias denitrificantes)

Sulfato, generando sulfuro (bacterias sulforeductoras)

CO2, generando metano (bacterias metanogénicas)
146
Hay algunas cadenas respiratorias bastante bien conocidas, entre las cuales se
describen los siguientes ejemplos:
A. Mycobacterium phlei
Uno de los sistemas de transporte de electrones mejor estudiados es el de
Mycobacterium phlei.
El mismo puede representarse como sigue:
La oxidación del Malato es catalizada por dos sistemas enzimáticos distintos,
uno en la fracción soluble y otro en la particulada.
En la primera se ha identificado una malato- vitamina K1 reductasa que es
activada por FAD y que cataliza la reducción de la vitamina K9H de una fracción
particulada.(Figura Nº4.11).
La irradiación a 360 nm inhibe la oxidación del malato y del succinato, pero
solo la primera es reversible con adición de vit. K1.
La oxidación del succinato comprende un compuesto metálico que se inhibe
con cianuro. En el esquema se incluyen los enzimas flavinicos (FP) inhibidos
por la atebrina y el punto de acción de otros inhibidores.
La NOQNO es la N-oxido-2-n-nonilhidroxiquinoleina.
147
Figura Nº 4.11. Transporte de Electrones de Mycobacterium phlei.
x representa un componente fotolábil a 360 nm.
y un componente no hemínico con hierro.
Θ indica inhibición por el correspondiente compuesto o por efecto de la
radiación
Fuente: (Pares, I.F. y A. Juárez, 1997).
B. Bacillus
El sistema de transporte de electrones en el género Bacillus seria:
148
Como en el caso anterior la oxidación del succinato no incluye vit. K. La
menaquinona (K2) ocupa el lugar de la naftoquinona K9.
C. Enterobacteriaceas
No
tienen
citocromo
c
terminal.
En
condiciones
aeróbicas
utilizan
preferentemente ubiquinonas y en anaerobias menaquinonas. Con nitrato
utilizan ubiquinona-8, cit b y nitrato reductasa.
A continuación se representan las cadenas respiratorias con nitrato y oxigeno
como aceptores terminales de electrones respectivamente.Figura Nº 4.12.
Figura Nº 4.12. Cadenas Respiratorias con Nitrato y Oxigeno como
Aceptores Terminales de Electrones.
149
Fuente: (Pares, I.F. y A. Juarez, 1997).
D. Respiración del Nitrato en las Bacterias Facultativas
La respiración del nitrato desempeña un papel importante en el metabolismo de
las bacterias entéricas y es un punto clave para la regulación de la variedad de
los sistemas disponibles de producción de energía.
Las cadenas respiratorias de las bacterias entéricas pueden utilizar una gran
variedad de sustratos (Figura Nº 4.12). Cada una de las distintas
deshidrogenadas unidas a la membrana NADH + H+, lactato, succinato,
formiato o L-glicero-3-fosfato deshidrogenadas) pueden dar electrones a un
“pool”
común
de
quinona
(ubiquinona-8
en
condiciones
aerobias
y
menaquinona-8 en condiciones anaerobias), la quinona da a su vez electrones
a las reductasas terminales y a los complejos citocromo o-citocromo d. hay un
gran número de posibilidades para una simple cadena constituida por
deshidrogenada-quinona-reductasa.
Los complejos citocromo o y citocromo d tiene un mecanismo similar para la
transposición protónica. La ubiquinol oxidasa libera un periplasma 2 H+ + 2 e- en
tanto que la inserción de la oxidasa del oxigeno molecular consume 2 H+ + 2 een el citoplasma.
150
Durante el crecimiento del aerobio, el NADH + H+ puede ser reoxidado por la
cadena respiratoria, pero en condiciones anaeróbicas el NAD+ se regenera de
otro modo y tienen lugar a cambios metabólicos importantes. Figura Nº 4.13.
Figura Nº 4.13. Mecanismo del glicolato por Pracoccus denitrificans. (1)
Glioxilatoreductasa dependiente de NAD. (2) Glicinoaminotransferasa. (3)
Eritro-2-hidroxiaspartato
aldolasa.
aspartatodeshidratasa.
Fuente: (Pares, I.F. y A. Juarez, 1997).
E. Azotobacter
151
(4)
Eritro-3-
hidroxi-
Contiene ubiquinona-8 y citocromo a1, a2y citocromo oxidasa. En el bypass
sobre UQ-8, también citocromo c4, citocromo c5 y citocromo a1. El sistema de
transporte de electrones en Azotobacter es:
Los estudios de inhibición con KCN que afecta principalmente al cit a1, han
revelado la existencia de la rama lateral.
F. Bacterias Halofilas
En el esquema siguiente se representa el sistema de transporte de electrones
en Halobacterium.
152
4.7. FOSFORILACIÓN OXIDATIVA
La generación de ATP puede lugar bien por fosforilación a nivel del sustrato, a
través de un número relativamente reducido de reacciones que ya han sido
descritas en los capítulos referentes a la formación de productos finales del
catabolismo, o bien por fosforilación oxidativa. Este ultimo sistema realmente el
de tipo más generalizado y es también el que está ligado a la cadena
respiratoria. El transporte de dos protones y de dos electrones desde el NAD
hasta el O2 va unido a la formación de tres moléculas de ATP a partir de ADP,
correspondiendo a la reducción de ½ O2 a H2 O. Teóricamente, en la respiración
aerobia la relación P/O es de 3, aparte de la posible generación concomitante
de ATP por fosforilación a nivel sustrato.
La fosforilación oxidativa solo ocurre cuando el transporte de electrones tiene
lugar en una estructura inalterada de membrana. La oxidación de portadores de
electrones va acompañada de la transposición de protones hacia el exterior con
la creación de un gradiente de concentración que determina la nueva entrada
de protones a través de puntos específicos, con la proteína ATPasa dando
lugar a la reacción.
ADP + Pi +
H+ → ATP + H2O
La teoría quimiosintetica puede considerarse ampliamente comprobada en la
respiración aerobia y en sistemas anaerobios ligados a citocromos o sin ellos.
La actividad ATPasica está circunscrita a puntos específicos de la membrana y,
como consecuencia de la actividad metabólica, resulta efectivamente un
gradiente de pH entre fuera y dentro de la célula.
La relación entre las concentraciones de ADP y ATP es crítica para la velocidad
de respiración. De hecho, en el efecto Pasteur el factor limitante de la
penetración de glucosa es la disponibilidad de ADP.
153
En bacterias, los valores de la relación P/O encontrados en preparados libres
de células enteras es siempre inferior a 3 y, con frecuencia, un poco mayor que
1.
Es evidente que en las células enteras dichos valores puedan ser superiores.
No obstante, es posible que las bacterias tenga lugar una respiración aerobia
con una relación P/O inferior a la que se consigue en los microorganismos
eucariotas gracias al sistema mitocondrial.
Las grandes cantidades de NADH que resultan de la actividad del ciclo del ATC
pueden utilizarse para biosíntesis reductiva, sin embargo el potencial reductivo
del NADH mitocondrial es más frecuentemente utilizado para dar energía para
la síntesis de ATP por la vía de la fosforilación oxidativa. La oxidación del
NADH con la fosforilación del ADP para formar ATP son procesos que se hacen
con el apoyo del transporte de electrones de la mitocondria y por la sintasa de
ATP, que son complejos proteicos que se encuentran en la membrana
mitocondrial interna.
La cadena de transporte de electrones está compuesta por una serie de
complejos proteicos que catalizan reacciones secuenciales de oxidación y
reducción; algunas de estas reacciones son termodinámicamente competentes
para permitir la producción de ATP por la vía de la ATP sintasa proveyendo que
un mecanismo de acoplamiento esté disponible, como por ejemplo un
intermediario común. La translocación de protones y el desarrollo de un
gradiente de protones transmembrana proveen el mecanismo de acoplamiento.
Figura Nº 4.14.
Figura Nº 4.14. La translocación de protones y desarrollo del gradiente de
protones transmembrana.
154
Fuente: (Mathews, C.K.; K.E. Van Holde y K.B. Ahern, 2002).
Figura Nº 4.15. Estructura química de la coenzima NAD y FAD oxidadas y
reducidas.
155
Fuente: Murray, R. K. et. al. 2005).
4.7.1. Proceso Metabólico
La fosforilación oxidativa es una ruta metabólica que utiliza energía liberada por
la oxidación de nutrientes para producir adenosín trifosfato (ATP). Aunque las
diversas formas de vida utilizan una gran variedad de nutrientes, casi todas
realizan la fosforilación oxidativa para producir ATP (Figura Nº 4.15), la
molécula que provee de energía al metabolismo. Esta ruta es tan ubicua,
debido a que es una forma altamente eficaz de liberación de energía, en
comparación con los procesos alternativos de fermentación, como la glucólisis
anaeróbica.
156
Durante la fosforilación oxidativa, los electrones son transferidos desde un
donante de electrones a un aceptor de electrones, como el oxígeno, a través de
reacciones redox. Estas reacciones liberan energía, la cual es utilizada para
producir ATP. En eucariotas, estas reacciones redox son llevadas a cabo en las
mitocondrias por una serie de complejos de proteínas, mientras que en los
procariotas, estas proteínas se encuentran ubicadas en la membrana interna de
la célula. Estos grupos relacionados de enzimas son llamados cadena de
transporte de electrones. En eucariotas, están involucrados cinco complejos de
proteínas, mientras que en procariotas se presentan muchas enzimas
diferentes, utilizando una variedad de donantes y aceptores de electrones.

Proceso Mediante el Cual se Forma ATP en la Forma de Electrones y luego
Transferidos hacia el Oxígeno Mediante una Serie de Transportadores de
Electrones.

Proceso Final: El Oxígeno acepta los Electrones que van pasando y se combina
con Hidrógeno para formar Agua.
La energía liberada por estos electrones desplazándose a través de la cadena
de transporte de electrones es utilizada para transportar protones a través de la
membrana interna mitocondrial, en un proceso llamado quimiosmosis. Esto
genera energía potencial bajo la forma de un gradiente de pH y un potencial
eléctrico a través de la membrana. El almacenamiento de energía es
aprovechado permitiendo que los protones fluyan de regreso a la membrana a
favor del gradiente, a través de la enzimaATP sintasa. La enzima utiliza esta
energía para generar ATP desde el adenosín difosfato (ADP), en una reacción
de fosforilación. Esta reacción es llevada a cabo por el flujo de protones, que
provoca la rotación de una parte de la enzima.
Aunque la fosforilación oxidativa es una parte vital del metabolismo, produce
especies reactivas del oxígeno tales como superóxido y peróxido de hidrógeno,
lo que lleva a la propagación de radicales libres, provocando daño celular,
contribuyendo a enfermedades y, posiblemente, al envejecimiento. Las enzimas
157
que llevan a cabo esta ruta metabólica son blanco de muchas drogas y
productos tóxicos que inhiben su actividad.
4.7.2. Estequiometria de la Fosforilacion Oxidativa
Por cada par de electrones que se originan en el NADH, se sinterizan 3
equivalentes de ATP, lo que requiere 22.4 kcal de energía. Así, con 31,2 Kcal
de energía disponible, está claro que el gradiente de protones generado por el
transporte de electrones contiene la energía suficiente para la síntesis normal
de ATP. Los electrones a partir del succinato tienen aproximadamente 2/3 de la
energía de los electrones del NADH: ellos generan PMFs que son
aproximadamente 2/3 de la fuerza que se genera con los electrones del NADH
y llevan a la síntesis de solamente 2 moles de ATP por mol de succinato
oxidado.
4.7.3. Regulación de la Fosforilación Oxidativa
Debido a que el transporte de electrones esta acoplado a la translocación de
protones, el flujo de electrones a través del sistema de transporte de electrones
se regula por la magnitud de la PMF. Mientras más alta es la fuerza, más baja
la proporción de transporte de electrones, y viceversa. Bajo condiciones de
reposo, con una carga alta de energía en las células, la demanda para síntesis
nueva de ATP se limita y, aunque la PMF esta alta, el flujo de electrones hacia
la matriz de la mitocondria a través de la ATP sintasa es mínima. Cuando las
demandas de energía se incrementan, como durante la actividad muscular
rigurosa, el ADP en el citosol se incrementa y es intercambiado con el ATP de
la mitocondria por medio del transportador transmembrana nucleótido de
adenina, la translocasa ADP/ATP.
Las concentraciones altas de ADP hacen que la PMF sea descargada a tiempo
de que los protones fluyen a través de la ATP sintasa, regenerando así la
cantidad de ATP. Así, mientras la proporción del transporte de electrones
depende de la PMF, la magnitud de la PMF en cualquier momento refleja la
carga de energía de la célula. A su vez la carga de energía, o más
158
precisamente la concentración de ADP, normalmente determina la proporción
del transporte de electrones por principios de acción de masa.
La proporción del transporte de electrones usualmente se mide al determinar la
proporción de consumo de oxigeno y a esto se refiere como la tasa de
respiración celular. La tasa de respiración se conoce como estado 4 cuando la
carga de energía es alta, la concentración de ADP es baja, y el transporte de
electrones está limitado por el ADP. Cuando los niveles de ADP aumentan y el
fósforo inorgánico está disponible, el flujo de protones a través de la ATP
sintasa es elevado y se observan proporciones altas en el transporte de
electrones; la tasa respiratoria resultante se conoce con el nombre de estado 3.
Así, bajo condiciones fisiológicas la actividad respiratoria mitocondrial esta en
un ciclo entre los estados 3 y 4. Figura Nº 4.16.
Figura Nº 4.16. Transporte de electrones en la membrana.
Fuente: (Dreyfus Cortés G.1995).
4.7.4. Inhibidores de la Fosforilación Oxidativa
La vía del flujo de electrones a través del ensamblaje para el transporte de los
mismos, y las propiedades únicas de la PMF, han sido determinadas por medio
de el uso de varios antimetabolitos importantes. Cuadro Nº 4.3.
159
Algunos de estos agentes son inhibidores del transporte de electrones en sitios
específicos en el ensamblaje de transporte de electrones, mientras otros
estimulan el transporte al descargar el gradiente de protones.Figura Nº 4.17.
Por ejemplo, la antimicina A es un inhibidor específico del citocromo b. En
presencia de antimicina A, el citocromo b puede ser reducido pero no oxidado.
Como es de esperarse, en presencia de la antimicina A el citocromo c
permanece oxidado, así como también los citocromos posteriores a y a3.
Una clase importante de antimetabolitos son los agentes desacopladores
ejemplificados por el 2,4-dinitrofenol (DNP). Figura Nº 4.18.
Los agentes desacoplantes actúan como ácidos lipofílicos débiles, que se
asocian con protones en el exterior de la mitocondria, que pasan a través de la
membrana unidos a un protón, y que se disocian del protón en el interior de la
mitocondria.
Estos agentes causan tasas de respiración máxima pero el transporte de
electrones no genera ATP, debido a que los protones translocados no regresan
a la matriz mitocondrial a través de la ATP sintasa. Cuadro Nº 4.4.
Cuadro Nº 4.4. Inhibidores de la Fosforilación Oxidativa
Nombre
Rotenona
Amital
Función
inhibidor del
transporte de e–
inhibidor del
160
Sitio de Acción
Complejo I
Complejo I
transporte de e–
Antimicina A
Cianuro
Monóxido de
Carbono
Azida
inhibidor del
transporte de e–
inhibidor del
transporte de e–
inhibidor del
transporte de e–
inhibidor del
transporte de e–
Complejo III
Complejo IV
Complejo IV
Complejo IV
Transportador
2,4,-dinitrofenol
Agente desacoplante
transmembrana
de H+
Transportador
Pentaclorofenol
Agente desacoplante
transmembrana
de H+
Oligomicina
Inhibe la
Fracción OSCP
sintasa de
de la sintasa
ATP
de ATP
Fuente: (Audesirk, T. y G. Audesirk. 2003)
161
Figura Nº 4.17. Tipos de inhibidores de la fosforilación
Fuente: (Pares, I.F. y A. Juarez, 1997).
162
Figura Nº 4.18. Estructuras químicas de los inhibidores fosforilativos.
Fuente: (Pares, I.F. y A. Juarez, 1997).
4.8. REACCIONES ANAPLEROTICAS
Son reacciones que regeneran intermediarios del ciclo de Krebs cuando éstos
han sido utilizados en reacciones biosintéticas, situación en la cual no hay
disponible oxalacetato (sustrato regenerador) indispensable para el inicio del
ciclo.Figura Nº 4.19.
Para que el ciclo sea funcional es necesario que haya cierta concentración de
oxalacetato, el cebador del ciclo. La degradación de algunos aminoácidos
proporciona metabolitos intermediarios del C.A.T. que pueden alimentar al ciclo.
163
Otra reacción que puede suministrar oxalacetato es la de carboxilación del
piruvato:
Oxalacetato + ADP + Pi + 2 H+
Piruvato + CO2 + ATP + H2O
A estas reacciones, que procuran intermediarios al C.A.T., se les denomina
anapleróticas.
Figura Nº 4.19. Formación de intermediarios al C.A.T. por las reacciones
anapleróticas.
Fuente: (Murray, R. K. et. al. 2005)
164
4.8.1. Mecanismos de las Reacciones Anapleróticas
En la oxidación del piruvato se libera una molécula de CO2 y por lo tanto solo dos
átomos de C ingresaran en el CAT. El drenaje de α-cetoglutarato, succinato y
oxalacetato con fines biosintéticos produce una disipación importante de intermediarios
que puede agotar el ciclo. Hay dos sistemas para impedir que esto ocurra:
a) Las reacciones anapleróticas, que generan compuestas C4 por fijación de CO2.
Estas reacciones tienen lugar principalmente cuando se utilizan azúcares como
sustratos.
b) El relleno de compuestos C4 a partir del metabolismo de compuestos C2 por la
vía del glioxilato.
En bacterias se han caracterizado cinco enzimas para las reacciones anapleróticas:
1. La llamada reacción de Wood – Werkman, en la cual el ácido pirúvico es
fosforilado a fosfoenol pirúvico con ATP y la piruvato fosfotransferasa. La
fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (ATP) forma oxalacetato, requiriéndose ADP
para formar ATP.
El acido fosfoenol pirúvico es el verdadero aceptor de CO2 y el ADP o el IDP
funcionan como aceptores de fosfato.
2. Hay una reacción muy parecida a la anterior catalizada por una fosfoenol
piruvato carboxilasa que requiere bicarbonato y fosfato inorgánico, el cual es
convertido en pirofosfato:
165
3. Un piruvatocarboxilasa (Cuadro Nº 4.5)dependiente de la biotina que produce
oxalacetato desde el piruvato con ATP:
Hay una enzima diferente en los mamíferos que lleva a cabo esta reacción con
acetil – CoA y no es dependiente de la biotina.
4. La reacción de los enzimas málico (malato deshidrogenasa descarboxilante
(NADP+ / NAD+)) que catalizan la carboxilación reductora del piruvato a malato,
utilizando bien NADPH + H+ o bien NADH + H+ :
No hay duda de que no todos estos enzimas se hallan presentes a la vez en el mismo
microorganismo.
166
Cuadro Nº 4.5. Características de las etapas de las reacciones anapleróticas
Desde
A
Reacción
Notas
Esta reacción es catalizada por
piruvato +
Piruvato
oxalacetato
la piruvatocarboxilasa,
CO2 + H2O + una enzima activada por Acetil-CoA,
indicando una falta de oxalacetato.
ATP
oxalacetato
+ ADP + Pi
+ 2H+
El Piruvato puede también ser
convertido en L-malato, otro
intermediario, mediante una vía
similar.
Esta reacción es reversible pudiendo
formar oxalacetato a partir
Aspartato
oxalacetato
-
de aspartato en una reacción
detransaminación, vía aspartato
transaminasa.
glutamato +
NAD+ +
Glutamato
αcetoglutarato
H2O
NH4+ + αcetoglutarato
Esta reacción está catalizada por
la glutamato deshidrogenasa.
+ NADH +
H +.
Cuando se oxidan ácidos grasos de
β-
cadena impar, se forma una
oxidaciónde ácidos succinil-CoA -
molécula de succinil-CoA por cada
grasos
ácido graso. La enzima final es
la metilmalonil-CoAmutasa.
Fuente: (Frenchel, T.G.M. y T.H. Blackburn, 1998)
167
4.8.2. Enzimas de las Reacciones Anapleróticas
En las reacciones anapleróticas, de hecho, donde intervienen enzimas como la
piruvato carboxilasa , la acetil-CoA carboxilasa, la propionil-CoA carboxilasa y la
3-metilcrotonil-CoA carboxilasa. La fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, la malato
deshidrogenasa-NADP (enzima málica), la NADP-isocitrato deshidrogenasa, y
catalizan procesos reversibles que, al menos en teoría, pueden conducir a la
fijación de CO2.
La acetil-CoA carboxilasa se encuentra en el citosol y cataliza la carboxilación
de acetil-CoA a malonil-CoA y está considerada como el paso limitante en la
biosíntesis de ácidos grados de cadena larga.
La propionil-CoA carboxilasa ha sido localizada exclusivamente en
mitocondrias. Las deficiencias de biotina causan una marcada reducción de la
actividad de esta enzima que está implicada en el metabolismo del propionato y
los aminoácidos ramificados.
La piruvato carboxilasa, se encuentra principalmente en mitocondrias y
cataliza la formación de oxalacetato a partir de piruvato.
Posiblemente, esta enzima es la principal responsable de la fijación del CO2,
puesto
que
la
fosfoenolpiruvato
carboxiquinasa
tiene
una
función
descarboxilante y la enzima málica carece de suficiente actividad para fijar la
cantidad observada de CO2. Parece que la incorporación de CO2 a través de la
piruvato carboxilasa depende de la disponibilidad de piruvato.
La actividad anaplerótica de la piruvato carboxilasa provee a-cetoglutarato y
glutamina que sirven como precursores para el restablecimiento de la reserva
de neurotransmisores.
La malato deshidrogenasa-NADP (enzíma málica) se han encontrado en
citosol y en mitocondrias y favorece la lipogénesis durante el desarrollo.
168
La isocitrato deshidrogenasa-NADP se encuentra en citosol y mitocondria de neuronas
y favorece, posiblemente, la lipogénesis. Esta enzima existe en tejidos de mamíferos
como dos isoenzimas, una que se encuentra en el citosol y la otra en la mitocondria.
La participación de la forma citosólica de la isocitrato deshidrogenasa-NADP en una
lanzadera con el a-cetoglutarato a sido demostrada, aunque su contribución en proveer
grupos acetilo para la síntesis de ácidos grasos es relativamente pequeña.
Las enzimas catalizadoras de las cuatro principales reacciones anapleróticas, esto es
la piruvato carboxilasa, la enzima málica, la isocitrato deshidrogenasa-NADP y la
fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, podrían causar la oxidación completa de los
intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, en el caso de que existiera una
escasa producción de piruvato, o como mecanismo para la oxidación de aminoácidos.
La enzima fosfoenolpiruvatocarboxilasa (PEPC) está ampliamente distribuida en
células vegetales, bacterias fotosintéticas y no fotosintéticas, cianobacterias y en algas
verdes. Participa en procesos de la ruta fotosintética en la fijación del CO2 atmosférico
en plantas C4 y en las plantas con metabolismo ácido crasuláceo (CAM); también es
la enzima anaplerótica más importante de todos los tejidos vegetales, que suministra
ácidos dicarboxílicos al ciclo de los ácidos tricarboxílicoscuando son utilizados
intermediarios para biosíntesis.
En la práctica parece que la piruvato carboxilasa es responsable de la mayor parte de
la fijación de CO2, dado que aproximadamente un 7-10% de todo el piruvato utilizado
sirve para sustituir los intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos durante el
normal funcionamiento de este ciclo.
La enzima málica y la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa contribuyen de forma poco
significativa,
ya
que
sus
estados
de
equilibrio
favorecen
mucho
más
la
descarboxilación que la carboxilación. Además, las reacciones de transaminación
pueden generar intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos en condiciones
cinéticas favorables y, por tanto, servir como función anaplerótica.Figura Nº 4.20.
169
Figura Nº 4.20. Enzimas de las reacciones Anapleróticas
Fuente: (Koolman, J. y K, H. Rohm.2004).
4.8.3 Rol bioquímico de las Reacciones Anapleróticas
Por lo que podemos concluir que las reacciones anapleróticas permiten:
o
Reacciones que permiten la entrada de intermediarios de carbono al
Ciclo de Krebs.
170
o
Intermediarios que entren al ciclo de esta manera son sintetizados en
otras rutas metabólicas.
Formación de intermediarios del Ciclo de Krebs:
o
Oxaloacetato
o
Malato
o
Alfa-cetoglutarato
o
Formación por carboxilación y transaminación.
Los intermediarios del ciclo son repuestos mediante las reacciones ANAPLEROTICAS
(Figura Nº 4.21).
Figura Nº 4.21. Reacciones Anapleróticas
Fuente: (Ganong, W.F.1996).
171