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METABOLISMO DEL ASPARTATO EN CULTIVOS PRIMARIOS DE
ASTROCITOS EN CONDICIONES PERINATALES
MARIA JULIANA SALAMANCA ORTIZ
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS
CARRERA DE BIOLOGIA
BOGOTÁ D.C
2009
METABOLISMO DEL ASPARTATO EN CULTIVOS PRIMARIOS DE
ASTROCITOS EN CONDICIONES PERINATALES
MARIA JULIANA SALAMANCA ORTIZ
Trabajo de Grado presentado como requisito parcial
para optar el título de Biólogo
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGÍA
BOGOTÁ D.C
2009
NOTA DE ADVERTENCIA
Reglamento
de
la
Pontificia
Universidad Javeriana. Artículo 23 de
la Resolución No. 13 de julio de 1946.
“La universidad no se hace responsable
por los conceptos emitidos por los
alumnos en sus trabajos de tesis.”
iii
METABOLISMO DEL ASPARTATO EN CULTIVOS PRIMARIOS DE
ASTROCITOS EN CONDICIONES PERINATALES
MARIA JULIANA SALAMANCA
APROBADO
____________________________________________
JAIRO ALFONSO TOVAR FRANCO Ph.D.
Director
___________________________________ _
SONIA LUZ ALBARRACÍN M.Sc
iv
_______________________________
CECILIA ESPINDOLA M.Sc
METABOLISMO DEL ASPARTATO EN CULTIVOS PRIMARIOS DE
ASTROCITOS EN CONDICIONES PERINATALES
MARIA JULIANA SALAMANCA ORTIZ
APROBADO
___________________________
INGRID SCHULER, Ph.D.
Decana Académica
________________________________
ANDREA PATRICIA FORERO
Directora Carrera de Biología
v
AGRADECIMIENTOS
El autor expresa sus agradecimientos a:
A Jairo Tovar por brindarme la oportunidad de trabajar con él y poder realizar mi
tesis. Por su apoyo incondicional y asesoría durante el desarrollo y culminación del
mismo Por sus enseñanzas y observaciones realizadas para poder llevar a cabo un
buen trabajo de investigación
A Colciencias y el medio de decanatura por la financiación parcial de este trabajo
que es parte del proyecto de: Regulación de la utilización del Aspartato por los
Astrocitos durante la Prelactancia.
En general a los miembros del Laboratorio de Neurobiquimica, en especial a la
Doctora Cecilia Espíndola por sus observaciones realizadas al trabajo y la obtención
de bibliografía. A María José Contreras por su amistad y por su colaboración en el
análisis de los datos y en la fase de laboratorio, y Angélica Pinzón por su
colaboración con los implementos de laboratorio.
A mis amigos Natalia Fonseca T, Julie Vigna, Mónica Hernández, Tatiana Romero,
Andrés Peña, Alberto Rodríguez ,Daniel Saldarriaga Luis Miguel Merlano, Michael
Morcos y Ahmed Sabbour por su amistad y consejos para seguir adelante con mi
trabajo pero sobre todo por el apoyo constante e incentivo que me brindaron para
seguir adelante con mi meta y no desistir de esta.
A Dios y a Santa Rita por su presencia en mi vida y permitirme tener constancia
para seguir adelante con mis metas no permitirme perder la esperanza frente a los
inconvenientes que se presentan.
A mi familia, en especial a mis padres por su apoyo, comprensión y colaboración A
mi hermano Juan Felipe Salamanca por sus consejos y sus regaños para continuar el
trabajo. A mi primo Mauricio Visbal por su colaboración en las diferentes fases del
proyecto, las largas noches con un buen tinto y las buenas conversaciones sobre la
vida.
vi
TABLA DE CONTENIDO
Págs.
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 16
1.
MARCO TEÓRICO ..................................................................................................... 18
1.1.
CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LOS ASTROCITOS ............................. 18
1.1.1
Funciones de los astrocitos. ................................................................................... 20
1.1.2
Demanda energética en astrocitos. ........................................................................ 22
1.2.
PERIODO PERINATAL Y METABOLISMO CEREBRAL .................................. 22
1.3.
ASPARTATO ........................................................................................................... 28
1.3.1.
Transporte del Aspartato. ...................................................................................... 29
1.3.2.
Metabolismo del Aspartato. .................................................................................. 30
1.4.
N-acetilaspartato (NAA) ........................................................................................... 37
1.4.1.
Síntesis de NAA. ................................................................................................... 38
1.4.2.
Transporte de NAA. .............................................................................................. 39
1.4.3.
Catabolismo de NAA. ........................................................................................... 42
1.4.4.
Enfermedad de Canavan. ....................................................................................... 43
2.
FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN ....................................... 46
2.1.
FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ...................................................................... 46
2.2.
JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN ......................................................... 46
3.
OBJETIVOS ................................................................................................................. 48
3.1.
OBJETIVO GENERAL ............................................................................................ 48
3.2.
ESPECÍFICOS .......................................................................................................... 48
4.
MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................... 49
4.1.
MATERIALES ......................................................................................................... 49
4.1.1.
Especie ensayada. .................................................................................................. 49
4.1.2.
Concepción de ratas (Aspectos bióticos). .............................................................. 49
vii
4.1.3.
Condiciones del bioterio (aspectos abióticos). ...................................................... 49
4.1.4.
Productos. .............................................................................................................. 50
4.1.5.
Medios instrumentales. .......................................................................................... 50
4.2.
MÉTODOS ............................................................................................................... 51
4.2.1.
Lavado de material de vidrio para cultivo. ............................................................ 51
4.2.2.
Composición de soluciones. .................................................................................. 51
4.2.2.1.
Solución Earle (EBS) ......................................................................................... 51
4.2.2.2.
Solución de disgregación (Solución A): ............................................................ 51
4.2.2.3.
Solución de tripsinización (solución B) en 50 ml de solución A....................... 52
4.2.2.4.
Tampón fosfato salino (PBS) (Elliott, 1969). .................................................... 52
4.2.2.5.
Medio de cultivo. ............................................................................................... 52
4.2.2.6.
Suero. ................................................................................................................. 53
4.2.3.
Preparación de cultivos primarios de astrocitos. ................................................... 53
4.2.4.
Incubación con cultivos primarios de astrocitos. .................................................. 54
4.2.4.1.
Composición del medio Elliott de incubación. .................................................. 54
4.2.4.2.
Preparación de las soluciones para las incubaciones. ........................................ 55
4.2.4.3.
Incubación de astrocitos..................................................................................... 55
4.2.5.
Determinación de la incorporación de sustratos en CO2. ...................................... 56
4.2.6.
Determinación de la incorporación de los sustratos en lípidos totales. ................. 58
4.2.7.
Cálculo de la velocidad de utilización de sustratos. .............................................. 58
4.2.8.
Determinaciones radiométricas. ............................................................................ 59
4.3.
ENSAYO ENZIMÁTICO......................................................................................... 59
4.3.1.
Preparación del homogenado. ............................................................................... 59
4.3.2.
Preparación de soluciones para el ensayo enzimático. .......................................... 61
4.3.2.1.
Soluciones fisiológicas. ..................................................................................... 61
4.3.2.2.
Mezcla de reacción 1. ........................................................................................ 61
4.3.2.3.
Mezcla del homogenado. ................................................................................... 62
4.3.3.
Lectura de datos. .................................................................................................... 62
4.3.4.
Determinación de proteína total por el método de Bradford. ................................ 62
viii
4.3.4.1.
Solución de proteína de reacción (Comassie) .................................................... 63
4.3.4.2.
Determinación de proteína extracelular. ............................................................ 63
4.3.4.3.
Determinación de proteína celular. .................................................................... 63
4.3.5.
Curva de calibración de Nicotinamida adenina dinucleótido (NADH)................. 64
4.4.
TRATAMIENTO ESTADÍSTICO ........................................................................... 64
4.5.
ASPECTOS ÉTICOS ................................................................................................ 64
5.
RESULTADOS ............................................................................................................ 66
5.1.
UTILIZACIÓN DEL ASPARTATO ........................................................................ 66
5.2.
COMPARACIÓN DE LA UTILIZACIÓN DEL ASPARTATO CON OTROS
SUSTRATOS METABÓLICOS EN CONDICIONES PERINATALES ........................... 66
5.3.
EFECTO SOBRE LA UTILIZACIÓN DE ASPARTATO COMO SUSTRATO
METABÓLICO EN PRESENCIA DE OTROS SUSTRATOS BAJO CONDICIONES
PERINATALES Y DE ADULTO. ...................................................................................... 67
5.4.
ACTIVIDAD
ENZIMÁTICA
DE
LA
ASPARTOACILASA
(ASPA)
EN
CULTIVOS PRIMARIOS DE ASTROCITOS EN PRESENCIA DE SUSTRATOS
METABÓLICOS EN CONDICIONES PERINATALES Y DE ADULTO. ...................... 67
6.
DISCUSIÓN ................................................................................................................. 76
6.1.
UTILIZACIÓN DEL ASPARTATO ........................................................................ 76
6.2.
COMPARACIÓN DE LA UTILIZACIÓN DEL ASPARTATO CON OTROS
SUSTRATOS METABÓLICOS EN CONDICIONES PERINATALES ........................... 80
6.3.
EFECTO SOBRE LA UTILIZACIÓN DE ASPARTATO COMO SUSTRATO
METABÓLICO EN PRESENCIA DE OTROS SUSTRATOS BAJO CONDICIONES
PERINATALES Y DE ADULTO ....................................................................................... 81
6.3.1.
Comparación en condiciones perinatales. ............................................................. 81
6.3.1.1.
Efecto de la glucosa. .......................................................................................... 81
6.3.1.2.
Efecto del lactato. .............................................................................................. 82
6.3.1.3.
Efecto del N-acetilaspartato (NAA). ................................................................. 83
6.3.2.
6.3.2.1.
Comparación en condiciones adulto...................................................................... 84
Efecto de la glucosa. .......................................................................................... 84
ix
6.3.2.2.
Efecto del lactato. .............................................................................................. 85
6.3.2.3.
Efecto del N-acetilaspartato (NAA). ................................................................. 85
6.4.
ACTIVIDAD
ENZIMÁTICA
DE
LA
ASPARTOACILASA
(ASPA)
EN
CULTIVOS PRIMARIOS DE ASTROCITOS EN PRESENCIA DE SUSTRATOS
METABÓLICOS EN CONDICIONES PERINATALES Y DE ADULTO ....................... 86
6.4.1.
Modificaciones al protocolo de referencia. ........................................................... 86
6.4.2.
Control de células y medio de cultivo. .................................................................. 87
6.4.3.
Comparación de las variaciones de concentración del NAA y Aspartato. ............ 87
6.4.4.
Comparación de las variaciones de concentración de la glucosa. ......................... 88
6.4.5.
Comparación de las variaciones de concentración de lactato. .............................. 88
7.
CONCLUSIONES ........................................................................................................ 90
8.
RECOMENDACIONES ............................................................................................... 91
BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................. 92
x
LISTA DE TABLAS
Págs.
Tabla1.
Comparación entre la utilización de diferentes sustratos metabólicos.
Durante el periodo perinatal
Tabla 2.
28
Actividad de la aspartoacilasa II en células derivadas del sistema
nervioso
Tabla 3.
45
Efecto causado por diferentes sustratos sobre la utilización del
aspartato como sustrato oxidativo y lipogénico.
Tabla4
69
Actividad enzimática de la aspartoacilasa (ASPA) en cultivos
primarios de astrocitos en presencia de sustratos metabólicos en
condiciones perinatales y de adulto
xi
75
LISTA DE FIGURAS
Págs.
Figura 1.
Funciones normales de los astrocitos.
23
Figura 2.
Lanzadera de malato/aspartato.
36
Figura 3.
Interacciones entre neuronas y astrocitos, mediados por el Nacetilaspartato(NAA) y el N-acetilaspartatilglutamato (NAAG).
Figura 4.
Evolución de la actividad de la aspartaoacilasa en astrocitos
corticales tipo 1 durante el tiempo de cultivo.
Figura 5.
41
45
Representación esquemática sobre el conjunto de pasos realizados
para la determinación de las velocidades de respiración y
lipogénicas en los astrocitos.
Figura 6.
57
Representación esquemática sobre el ensayo enzimático de
acuerdo con Bhakoo et al., 2001).
Figura 7.
Efecto causado por otros sustratos bajo condiciones perinatales y
de adulto sobre la utilizcion de aspartato como sustrato oxidativo
Figura 8.
61
70
Efecto causado por otros sustratos bajo condiciones perinatales y
de adulto sobre la utilización de aspartato como sustrato
lipogenico
Figura 9.
71
Comparación de la utilización de aspartato con respecto a otros
sustratos metabólicos en cultivos primarios de astrocitos.
xii
72
Figura 10.
Curvas de calibración utilizadas para la determinación de la
actividad enzimática.
Figura 11.
74
Actividad enzimática de la aspartoacilasa (ASPA) en cultivos
primarios de astrocitos en presencia de sustratos metabólicos en
Figura 12.
condiciones perinatales y de adulto.
76
Destino de los carbonos marcados a partir de L-[U-14C]-aspartato.
79
xiii
RESUMEN
Durante el periodo perinatal, los astrocitos están en capacidad de suplir nutrientes a las
neuronas. Se ha propuesto que, como en la prelactancia se incrementa la concentración de
N-acetil-L-aspartato (NAA) producido principalmente por las neuronas, este sustrato una
vez absorbido por los astrocitos e hidrolizado vía aspartoacilasa II (ASPA) en acetato y
aspartato, colabora en suplir los requerimientos metabólicos de células del sistema nervioso
central (SNC). El aspartato no ha sido estudiado como un posible sustrato que podría
colaborar en el metabolismo de los astrocitos durante este periodo de ayuno en el recién
nacido.
En este trabajo, se profundizo en el metabolismo perinatal a partir de cultivos primarios de
astrocitos, evaluando la capacidad para utilizar el L-[U-14C]-aspartato (2 µCi) como
sustrato metabólico a concentraciones fisiológicas perinatales de aspartato (0.5 mM). Se
demostró que los astrocitos están en capacidad de utilizar el aspartato más como un sustrato
oxidativo que lipogénico. Se evidencio que la utilización del aspartato es afectada
significativamente (p<0.05) por las concentraciones de otros sustratos como la glucosa,
lactato y NAA y que su destino depende de las variaciones de las concentraciones de estos
sustratos tanto en condiciones perinatales como en adulto. Al evaluar la actividad de la
aspartoacilasa II, permitió comprobar que su actividad es alta, que no es afectada por
concentraciones perinatales de aspartato y que esta enzima, está siendo regulada por las
concentraciones perinatales de glucosa (5 mM) y lactato (10,5 mM) y por las
concentraciones de lactato (5 mM) en condiciones fisiológicas de adulto.
xiv
ABSTRACT
During the perinatal period, astrocytes are able to supply nutrients to neurons as lactate and
glutamine, among others. It has been suggested that, in prelactany increases the
concentration of N-acetyl-L-aspartate (NAA) produced mainly by neurons.Once, it has
been absorbed and hydrolyzed by astrocytes via aspartoacilasa II (ASPA) in acetate and
aspartate,it can be used to supply metabolic requirements of cells of the central nervous
system (CNS). Early studies with acetate have shown that this substrate is absorbed by the
astrocytes and used as source of carbon for respiration and lipogenesis; however, the
aspartate has not been sufficiently studied as a possible substrate that could assist in the
metabolism astrocytes during this period of fasting in the newborn.
Furthermore, this work was elaborated in order to study perinatal metabolism from primary
cultures of astrocytes from the brains of newborn Wistar rats. The main objective was to
evaluate the ability to use the L-[U-14C]-aspartate (2 Ci) as a metabolic substrate in
perinatal physiological concentrations of aspartate (0.5 mM). According to this It has been
showed that astrocytes are capable of using alternative aspartate as substrate, more like an
oxidative substrate tanlipogenic Moreover, it is evident that the use of aspartate was
significantly affected (p <0.05) by concentrations of other substrates such as glucose,
lactate and NAA, and that their fate depends on the variations in the concentrations of these
substrates in both perinatal conditions as an adult. Additionally, when evaluating the
activity of astrocytes in aspartoacilasa II, it has been revealed that its activity is high, which
is not affected by perinatal concentrations of aspartate and that this enzyme is being
regulated by perinatal glucose concentrations (5 mM) and lactate (10.5 mM) and lactate
concentrations (5 mM) under physiological conditions as adults.
xv
INTRODUCCIÓN
Las células gliales han sido tradicionalmente consideradas como células satélites del
sistema nervioso, cuya función se limitaba únicamente a células de soporte. No obstante,
investigaciones recientes en el campo de neurociencias han permitido demostrar que son
una clase de células muy heterogéneas, cuyas funciones son diversas y de gran importancia
en el sistema nervioso (Montgomery, 1994). Los astrocitos, un tipo de glía, tienen una
relación muy estrecha con la vasculatura, forman una red gliovascular, que está involucrada
no solo en la organización de la estructura cerebral sino además en las vías de
comunicación, activación, potenciales de acción y plasticidad celular. La cooperación de
estas células con otro tipo de células especializadas como las neuronas y los
oligodendrocitos, revela la importancia que tienen estas en cuanto a la regulación del
metabolismo celular para lograr mantener las funciones cerebrales intactas y responder a
diversos estímulos (Nedergaard et al., 2003).
La coordinación metabólica entre los astrocitos y otras células del sistema nervioso es de
vital importancia en los recién nacidos y especialmente en aquellos que nacen pretermino o
con bajo peso. En esta etapa se hace aun más difícil mantener el balance energético ya que
el consumo de las reservas energéticas como glucógeno es mayor, limitando así la
producción de energía por medio de la respiración y disminuyendo la síntesis de lípidos a
partir de carbohidratos. La disminución de la actividad glucolítica conlleva a una
disminución del metabolismo cerebral, causando que procesos que exigen energía como las
bombas de iones (Na+/K+ ATP) que agotan las reservas de ATP, sean afectados por la
disminución de este (Magistretti & Pellerin, 1999).
Aún cuando los astrocitos están en capacidad de suplir nutrientes a las neuronas como
lactato y glutamina, entre otros, se ha propuesto que, como en el periodo perinatal se
16
incrementa la concentración de N-acetil-L-aspartato (NAA) producido principalmente por
las neuronas, este sustrato una vez absorbido por los astrocitos e hidrolizado vía
aspartoacilasa II (ASPA) en acetato y aspartato, colaboraría en suplir los requerimientos
metabólicos de células del sistema nervioso central (SNC) durante la prelactancia. Trabajos
previos con acetato han demostrado que este sustrato es absorbido por los astrocitos y es
utilizado como fuente de carbonos para la respiración y la lipogénesis, no obstante, el
aspartato no ha sido lo suficientemente estudiado como un posible sustrato que podría
colaborar en el metabolismo en los astrocitos.
En este trabajo, se pretende profundizar en el metabolismo perinatal del aspartato
evaluando su capacidad para ser utilizado como un sustrato alternativo oxidativo o
lipogénico en los astrocitos y evidenciar si su utilización es afectada por las
concentraciones de otros sustratos metabólicos.
17
1. MARCO TEÓRICO
1.1. CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LOS ASTROCITOS
El sistema nervioso está constituido por varios tipos de células, además de las neuronas,
están las células de la glía (macro y microglia). La microglia esta contituida por las células
fagociticas en el sistema nervioso central (SNC) y la macroglia principalmente por
astrocítos, oligodendrocitos y células epindemarias El papel de las células gliales en cuanto
a la modulación de diversas funciones neuronales se ha venido investigando los últimos
años con mayor profundidad. La macroglia está constituida principalmente por astrocitos,
oligodendrocitos y células epindemarias (Nedergaard et al., 2003).
Dentro de las células neurogliales, los astrocitos, son una de las células que presentan
mayor
diversidad
morfológica
además
de
ser
muy versátiles
funcionalmente.
Adicionalmente, tienen mayor predominancia en el sistema nervioso central comparado con
otro tipo de células glíales, ocupando entre el 25 y 50 % del volumen cerebral y
sobrepasando el número de neuronas con una relación de 10:1. (Magistretti & Ramson,
2002).
Estas células se pueden identificar a nivel ultraestructural porque presentan ciertas
características que son comunes entre ellas como: su forma irregular estrellada, numerosos
gránulos de glucógeno y paquetes de filamentos intermediarios. Son células que se
caracterizan por un cuerpo pequeño estrellado, de ahí la designación de su nombre, el
núcleo es redondeado u ovalado y la cromatina es pálida y dispersa (Quintanar et al., 2003).
Tienen prolongaciones citoplasmáticas llamados procesos o pies terminales astrocíticos,
que se ramifican y carecen de axones o potenciales de acción. Hay procesos astrocíticos
perifericos (PAPs) que son extensiones estrechas (lamelas y filopodios), los cuales están
cerca de elementos neuronales (sinapsis y los nódulos de Ranvier). Los procesos
18
astrociticos más largos con forma de pies terminales, incluyen aquellos asociados con
arteriolas y vénulas (Hertz et al., .2007).
Los astrocitos de acuerdo con su morfología y su distribución espacial se han clasificado en
tres principales tipos que son: los astrocitos radiales, los astrocitos protoplásmicos o tipo 1
(en la materia gris) y los fibrosos o tipo 2 (en la materia blanca). Los astrocitos que se
encuentran en las regiones límites entre la materia gris y la materia blanca pueden presentar
características mixtas entre astrocitos fibrosos y protoplásmicos (Privat et al., 1995). Los
astrocitos radiales se encuentran ubicados perpendicularmente a la superficie ventricular y
presentan procesos largos no ramificados.
Los fibrosos están asociados generalmente a las fibras nerviosas, presentan una forma más
estrellada, con procesos elongados, lisos y delgados con ciertas ramificaciones. Estos hacen
contacto con la superficie pial en los vasos sanguíneos o se mantienen cerca de los axones
de las neuronas. Por otra parte, los astrocitos protoplásmicos, presentan una forma arbustiva
con gran cantidad de prolongaciones cortas y también hacen contacto con los vasos
sanguíneos.
Ambos tipos de astrocitos presentan filamentos intermediarios de aproximadamente 9 nm,
compuestos por una proteína fibrilar, llamada proteína fibrilar acida de la glía (GFAP),
específica para astrocitos (Quintanar et al., 2003). Esta proteína junto con S-100 (proteína
citosólica de unión a Ca2+) son los marcadores comúnmente utilizados para la identificación
de astrocitos (Eng et al., 2000). La GFAP se puede evidenciar en tejido por medio de
impregnación metálica, basadas en el método de Golgi o puede llevarse a cabo por
inmunohistoquímica. Los astrocitos fibrosos contienen una mayor cantidad de esta proteína
pero de forma dispersa en el citoplasma, mientras que en los protoplásmicos se encuentra
en fascículos pero en menor cantidad (Nedergaard et al., 2003). Este tipo de astrocitos no
expresan suficiente GFAP y como consecuencia son GFAP negativos por métodos
rutinarios de tinción (Eng et al., 2000).
19
1.1.1 Funciones de los astrocitos.
La importancia funcional de los astrocitos, se ha venido considerando en estos últimos
años, refiriéndose a estos como una clase de células heterogéneas. La clave para entender el
papel de estas células dentro del sistema nervioso central (SNC) se basa en comprender el
concepto de heterogeneidad que los caracteriza, ya que sus funciones no se limitan
únicamente a desempeñar un papel estructural de soporte (Montgomery ,1994).
Los astrocitos se encuentran distribuidos en diferentes partes del cerebro como en la corteza
cerebral, cerebellum, corpus callosum, hipocampo, etc., y aún cuando tienen características
que los permiten identificar como astrocitos, tienen características bioquímicas distintas
que los hacen responder en diversas formas frente a lesiones que involucran el SNC
(Maragakis &Rothstein, 2006). Los cuerpos celulares y las extensiones astrocíticas tienen
actividades especializadas y diferentes, por ende las regiones subcelulares se diferencian en
la dependencia espacial y temporal de las vías de glucólisis y de oxidación (Hertz et al.,
2007).
De manera general, se han clasificado las principales funciones de los astrocitos en las
siguientes categorías: guía y soporte durante la migración neuronal; manutención del
microambiente neural y modulación de la respuesta del sistema inmunológico, actuando
como células presentadoras de antígenos. (Montgomery, 1994; Maragakis &Rothstein,
2006).
Estas células gliales tienen un papel central en el catabolismo de ciertos aminoácidos en el
cerebro al igual que de la síntesis de novo de estos. La producción de esqueletos largos de
carbono es posible en los astrocitos por la acción de la enzima piruvato carboxilasa (E.C.
6.4.1.1) considerada una enzima clave en la reposición de intermediarios metabólicos
(Maragakis & Rothstein, 2006). Aún cuando las investigaciones relacionadas con el
metabolismo de diferentes sustratos en astrocitos, se han enfocado principalmente en el
glutamato, el neurotransmisor más abundante en el sistema nervioso central (CNS) de los
20
mamíferos, hay evidencias que sugiere que los astrocitos también contribuyen con el
metabolismo del aspartato, otro amino ácido excitatorio abundante dentro del SNC (Seth &
Koul, 2008).
Se ha demostrado que los astrocitos durante etapa embrionaria son los que dan lugar a la
infraestructura para las células neuronales que se encuentran en migración y que más
adelante formaran el cerebro (Scanlon & Sanders, 2007). Además, las prolongaciones
astrociticas envuelven los capilares cerebrales, contribuyendo así con la barrera
hematoencefalica. Esta tiene un papel importante en el cerebro, protegiéndolo de
fluctuaciones de las concentraciones plasmáticas y de la circulación de otros agentes como
neurotransmisores y xenobióticos capaces de interrumpir la función neuronal. Los
astrocitos están en la capacidad de liberar otros factores químicos que modulan la
permeabilidad endotelial, manteniendo la regulación homoestotática (Abbot, 2002).
En los astrocitos durante periodos críticos de desarrollo cerebral, la proteína quinasa A
anclada a la proteína 12 (PKA AP12) tiene un papel importante como supresora de tumores
asociada también a la proteína kinasa C (PKC). Esta proteína regula la secreción de factores
de crecimiento como las angiopoeitinas (ANG1) y el factor de crecimiento endotelial
vascular (VEGF) en los astrocitos por medio de factores inducibles por hipoxia (HIF-1α.).
Cuando los niveles de oxigeno se ven disminuidos y hay un cese de nutrientes, los FIH se
ven activados al igual que los factores de crecimiento insulínico (IFG-1) y (VEGF). Estos
factores contribuyen con la diferenciación y crecimiento celular, favoreciendo angiogénesis
(formación de vasos sanguíneos) y vasculogénesis (formación del sistema circulatorio
embrionario) (Choi et al., 2007).
Estudios realizados a partir de tejido cortical in vitro e in vivo, han podido demostrar que la
liberación de glutamato activa receptores metabotrópicos, cuya señal promueve la vía del
inositol trifosfato (InsP3), incrementando las concentraciones de Ca2+ en los pies terminales
de los astrocitos movilizando las reservas de calcio y finalmente dilatando las arteriolas .La
21
propagación de la señal glutamatérgica a través del espacio astrocitico depende de dos vías,
que involucran mecanismos mediados por calcio; uno que involucra las uniones gap y el
otro la liberación paracrina de ATP. Así el calcio que es liberado puede ser transferido a los
astrocitos adyacentes por medio de uniones gap, compuesta por conexina 43 o también se
libera ATP a través de hemicanales de conexina 43, activando receptores de purina
(Maragakis & Rothstein, 2006) (Figura 1).
1.1.2 Demanda energética en astrocitos.
Por otra parte, la demanda energética de los astrocitos es incitada principalmente por
procesos de señalización, respuestas a neurotransmisores como el glutamato, flujos de iones
calcio (Ca+2), motilidad filopodial y la entrada de iones potasio (K+). La vía glucolítica y
otro tipo de vías oxidativas le proporcionan la energía a estas células, pero
fundamentalmente la mayor energía adquirida en forma de ATP proviene de la respiración
(Hertz et al., 2007).
Las extenciones lamelipodiales y filopodiales constituyen un 80 % del área de superficie de
cada astrocito lo que sugiere que demandan una gran energía ya que están en contacto con
vasos sanguíneos y deben estar activos para el intercambio y suplemento de nutrientes.
Estas extensiones son muy estrechas para albergar un gran número de mitocondrias, la
mayor cantidad de energía proviene vía glucólisis, glucogenólisis, difusión de ATP y la
fosfocreatina generada a partir del metabolismo mitocondrial. Estos han evidenciado tener
altas tasas de oxidación y dependencia de las reacciones de glucolisis y gluconeogenesis
(Hertz et al., 2007).
1.2. PERIODO PERINATAL Y METABOLISMO CEREBRAL
El periodo perinatal comienza en el momento en el que ocurre la concepción hasta el
momento del destete. Entre las etapas comprendidas durante el periodo perinatal, se
encuentra la prelactancia. Esta etapa es definida como el tiempo transcurrido entre el parto
y el comienzo de la lactancia, caracterizandose por ser una etapa critica a nivel de
22
Figura 1. Funciones normales de los astrocitos.
(1) La modulación sináptica se da vía los transportadores de glutamato, los cuales transportan
el glutamato desde la hendidura sináptica hasta la célula. (2) La comunicación entre los
astrocitos ocurre por medio de la liberación de ATP y la unión a receptores de purina en los
astrocitos adyacentes. Esta unión, promueve la activación de la fosfolipasa C, seguida de la
activación del Inositol trifosfato y movilización de calcio. (3) Las uniones Gap permiten el
intercambio de pequeñas moléculas y facilitan la comunicación entre célula y célula. (4) Las
funciones metabólicas incluyen la reposición de glutamato neuronal a través del ciclo de
glutamato- glutamina y (5) el transporte de glucosa desde los vasos sanguíneos. (6) La
regulación del flujo sanguíneo es modulada por los pies astrociticos que hacen contacto con
los vasos, liberando sustancias vasoactivas. (7) La liberación de glutamato se puede dar como
consecuencia a la elevación de los niveles de calcio intracelular y por factores relacionados
con prostanglandinas. (8) Esta liberación a través de canales químicos también puede ser
inducida in vitro disminuyendo los niveles extracelulares de calcio. (9) Una vez el glutamato
se une a los receptores metabotropicos de glutamato, se activa el calcio intracelular, liberando
sustancias vasodilatadoras.
Fuente: Maragakis y Rothstein, 2006
23
metabolismo para el desarrollo cerebral de los neonatos (Medina, 1988). Durante la
gestación en los vertebrados, tiene lugar la formación y distribución de neuronas en la
corteza cerebral.No obstante, los procesos de conexión, reorganización de sinapsis,
mielinizacion, neurogénesis, etc, encargados de formar el sistema nervioso central se
acentúan aun mas durante la vida perinatal y postnatal (Connors et al., 2008).
Durante el desarrollo fetal y cerebral en mamíferos, la glucosa es un sustrato energético
fundamental, además de una fuente de carbonos para la formación de estructuras celulares.
La glucosa puede pasar la barrera hematoencefálica gracias a transportadores, que permiten
su paso a los astrocitos y de ahí ser distribuida a las neuronas. Las isoformas de los
transportadores que han sido reportadas son GLUT1, presentes en la barrera
hematoencefálica y en astrocitos y GLUT1, GLUT3, GLUT6 y GLUT8 en neuronas (Baud,
2002). Adicionalmente, los astrocitos tienen la capacidad de almacenar glucógeno, es decir
son una fuente directa de combustible glucosídico para el normal sostenimiento del
metabolismo cerebral y sobre todo para la demanda energética que se ve incrementada
durante la prelactancia.
A través de la circulación placentaria, muchos de los nutrientes provenientes de la madre
son transferidos al feto. En este periodo la totalidad de glucosa, proviene exclusivamente de
la madre, por esta razon las concentraciones fetales pueden ser aproximadamente muy
similares. Se ha reportado que al momento de nacer, la concentración de glucosa constituye
el 80% de la glucosa proveniente de la madre. Sin embargo, decrece rápidamente
transcurridos 30 a 90 minutos, alcanzando concentraciones de 40 a 60 mg/dl o incluso
inferiores (Garg & Devaskar, 2006). La hipoglicemia producida, mantiene los niveles
disminuidos de glucosa en la sangre, se considera que puede llegar a valores que están por
debajo de los 50 mg/dl, estos pueden variar, según el criterio (Benjon et al., 2004).
Para los neonatos, mantener la normoglucemia se vuelve crítico justo en el momento de
nacer, ya que hay un cambio drástico en el metabolismo. Durante la vida intrauterina hay
24
una dependencia del aporte transplacentario de todos los nutrientes y al momento de nacer
hay una interrupción en la transferencia de estos (Bergmann et al., 2004). En los neonatos
de ratas, los niveles plasmáticos de glucosa son muy bajosdurante la primera hora de
nacido, mientras que en los en los humanos solo durante los primeros treinta minutos. En la
última etapa de gestación, el feto a termino ya ha comenzado a almacenar glucógeno en el
cerebro (Medina, 1988).
La inducción postnatal de varios mecanismos como la gluconeogenesis y la glucogenolisis
hepática son necesarias para tratar de subir los niveles de glucosa al igual que la lipólisis
inducida por un aumento de catecolaminas en sangre (epinefrina, norepinefrina y
dopamina) (Bergmann et al., 2004; Garg & Devaskar, 2006). Paralelamente, la actividad
enzimática también cambia, disminuyendo la actividad de la glucógeno sintetasa, mientras
que la actividad enzimática de la fosforilasa aumenta, al igual que la actividad de la
fosfoenolpiruvato carboxilasa en la cetogénesis. Sin embargo, la demanda metabólica del
cerebro durante este período depende
principalmente de la cetogénesis, ya que la
gluconeogénesis no es muy activa sino hasta transcurridas doce horas postparto (Mayor,
1985). Después del nacimiento transcurridas 12 a 24 horas los niveles de glucosa en la
sangre se estabiliza alcanzando niveles entre 60 a 80 mg /dl (Garg & Devaskar, 2006).
Cuando la glucosa disminuye en la sangre, se inhibe la secreción de insulina por parte de
las células β del páncreas y se aumenta la producción de glucagón para estimular la
utilización de las reservas de glucógeno presentes en el hígado. De esta forma se evita que
la glucosa sea utilizada muscularmente y en el tejido adiposo, en ausencia de glucosa
disminuyen las concentraciones de glicerol fosfato impidiendo la esterificación de los
ácidos grasos y favoreciendo la liberación de ácidos grasos en la sangre, por medio de la
lipólisis. Estos ácidos grasos ya quedan disponibles para ser oxidados en el hígado y formar
cuerpos cetónicos (acetoacetato y 3 hidroxibutirato) (Medina, 1988).
25
En especial los cuerpos cetónicos y el lactato, son utilizados como sustratos alternos. La
síntesis de transportadores, miembros de la familia de monocarboxilatos (MCT) se
incrementa en este periodo y son los encargados de transportarlos desde la sangre hasta los
astrocitos y las neuronas. MCT1, es la isoforma presente en astrocitos y MCT2 en
neuronas. Paralelamente, la lanzadera de lactato entre astrocitos y neuronas es un
mecanismo de protección alternativo a la utilización de glucosa durante la hipoglicemia
(Baud, 2002).
Por otra parte, la lipogénesis pulmonar se mantiene activa , pero en los neonatos de rata la
lipogénesis hepática disminuye en el momento del parto y se ve incrementada hacia la
formación de surfactante pulmonar preparto, que recubrirá postparto, la superficie alveolar
con el fin de disminuir la tensión superficial y evitar que los alvéolos colapsen. Uno de los
componentes de este surfactante son los glicerofosfolipidos. La mayor parte de los lípidos
se encuentran como triacilgliceroles almacenados en tejido adiposo y son producidos por el
feto a partir de la glucosa proveniente de la madre. Existen dos tipos de tejido adiposo, el
marrón y el blanco. Las reservas de lípidos presentes en el tejido marrón no pueden ser
utilizadas, ya que están destinadas específicamente para la termogénesis. No obstante, las
ratas no poseen tejido adiposo blanco, mientras que los humanos pueden utilizar esas
reservas lipídicas (Medina, 1988).
El acetil-coenzima A proveniente de la β-oxidación de ácidos grasos, puede a su vez entrar
al ciclo de los ácidos tricarboxílicos o ser utilizada para la formación de cuerpos cetónicos.
La acetil-CoA se forma en la matriz mitocondrial y debe transportarse hacia el citosol para
la síntesis de ácidos grasos vía citrato. En el cerebro durante el periodo perinatal el acetilCoA es comúnmente transportado como acetato, citrato, NAA o lípidos, estos últimos con
ayuda de carnitina (Escriva, 1988).
El cerebro en desarrollo presenta mecanismos de transferencia de acetil-CoA al citosol, la
lanzadera de citrato/piruvato, la cual actúa como transportador de los grupos acetilo y
regula la síntesis de ácidos grasos. Este se forma en la mitocondria en el primer ciclo de los
26
ácidos tricarboxílicos, a partir de la acetil-CoA y del oxaloacetato por actividad de la
enzima citrato sintasa (E.C. 2.3.3.1) Cuando las concentraciones de citrato aumentan y
sobrepasan las necesarias para el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, este es transportado al
citosol. Una vez en el citosol la enzima citrato liasa (E.C.2.3.3.8), forma nuevamente acetilCoA y oxaloacetato, esta reacción requiere gasto de ATP. Como el oxalacetato no puede
pasar la membrana mitocondrial es convertido a malato, por la malato deshidrogenasaNAD dependiente citosólica (cMDH) (E.C.1.1.1.3.7). Parte de ese malato citosólico puede
ser descarboxilado oxidativamente por la deshidrogenasa-NADP dependiente citosólica
(también llamada enzima malica, cME), formando piruvato el cual es transportado a la
mitocondria y por acción de la piruvato carboxilasa (E.C.6.4.1.1) se forma oxaloacetato
nuevamente. Adicionalmente, parte del malato formado también vuelve a la mitocondria y
es intercambiado por citrato a través de un antiporte (Indiveris et al., 1987).
Con el fin de profundizar sobre la utilización de sustratos alternativos en astrocitos durante
la prelactancia, se han realizado estudios con lactato, 3-hidroxibutirato, acetato, glucosa y
glutamina (Tovar, 1995; Tovar & Salazar, 2005).Los estudios reportados con acetato
sugieren que los astrocitos durante esta etapa metabólica crítica, utilizan el acetato más
como un sustrato oxidativo que lipogénico, demostrando su importancia para mantener el
metabolismo oxidativo por medio del reciclaje de carbonos. La utilización de [1-
14
C]-
acetato refleja una alta actividad anaplerotica, contribuyendo con los reservorios de
oxaloacetato y acetil-CoA para lograr mantener la respiración. La actividad en los
astrocitos de las enzimas como la acetil-CoA sintetasa mitocondrial, la piruvato carboxilasa
y la malato deshidrogenasa citosólica es de vital importancia. Por otra parte el uso de [214
C]-acetato demostró que los astrocitos durante el periodo perinatal tienen un alto
requerimiento de carbonos destinados para la síntesis de glutamina (Tovar & Salazar,
2005).
Los estudios con lactato demuestran que este sustrato es utilizado activamente no solo por
neuronas sino también por los astrocitos como sustrato oxidativo y precursor de
27
fosfolípidos y esteroles (Medina et al., 1996). Incluso de acuerdo con estudios
comparativos llevados a cabo con glucosa, 3-hidroxibutirato, glutamina y acetato,
demuestran que este sustrato es utilizado preferencialmente por los astrocitos presentando
las mayores tasas de velocidad tanto para oxidación como para lipogénesis (Tovar, 1995;
Medina et al., 1996, Tovar y Salazar, 2005).(Tabla1).
Tabla 1. Comparación entre la utilización de diferentes sustratos metabólicos.
Durante el periodo perinatal
Sustratos
Glutamina (2mM)
3-HB (2mM)
Glucosa (5mM)
Lactato (10mM)
Acetato (5mM)
Astrocitos
Respiración
4.42 ± 0,11
3.55 ± 0,14
1.84 ± 0,14
6.60 ± 0,17
0.39 ± 0.06
Lipogénesis
0.16 ± 0.12
0.38 ± 0.05
0.58 ± 0.02
1.37 ± 0.04
0.06 ± 0.01
Los resultados están expresados como nmoles de CO2 incorporados / hora /millón de
células para respiración y nmoles de CO2 incorporados a lípidos/hora/millón de
células Fuente: Medina et al., 1996, Tovar y Salazar, 2005.
1.3. ASPARTATO
El L - aspartato, es un aminoácido no esencial dicarboxilico. Es de gran importancia, ya que
está involucrado en la síntesis de proteínas neuronales, oligopéptidos, purinas, pirimidinas,
ácidos nucleicos y L - arginina. Se ha encontrado en la mayoría de tejidos corporales y en el
cerebro, aunque el fluido cerebroespinal contiene bajas concentraciones de L-aspartato libre
(Baslow ,1997). Al igual que el glutamato, este aminoácido es considerado, un transmisor
excitatorio en el sistema nervioso central (SNC) en los mamíferos (Bender, 1997).
Adicionalmente, las células del SNC están en capacidad de utilizar el aspartato para la
producción de energía por medio de su utilización en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos
(Baslow ,1997; Farooqui et al., 2008).
Aún cuando es considerado un neurotrasmisor, el mecanismo de almacenamiento vesicular
del aspartato no se tiene muy claro. Se ha encontrado que el aspartato es almacenado en
28
vesículas sinápticas en neuronas del hipocampo y en microvesículas sinapticas (SLMVs) en
los pinealocitos. De acuerdo con esto, se ha propuesto que un cotransportador reportado
tanto en vesículas del hipocampo como en los pinealocitos, llamado sialin, un
cotransportador lisosomal de H+/acido sialicilico que actúa como un transportador
vesicular de aspartato/glutamato y probablemente está involucrado en el almacenamiento
de aspartato, mediado por un gradiente electroquímico de protones (Mijayii et al., 2008).
Un incremento en las concentraciones de este amino ácido, puede generar efectos tóxicos
en las neuronas y en la células gliales, aumentando la liberación de Ca+2 y liberando
radicales libres, si se presenta un aumento excesivo en el plasma sanguíneo (Choi, 1998).
1.3.1. Transporte del Aspartato.
Hay algunos sistemas de transportes que han sido descritos en las membranas neuronales y
gliales. Existe una familia de transportadores de solutos conocida como SLC1 (Solute
carrier family). Dentro de esta familia se encuentran cinco transportadores de glutamato de
alta afinidad, como el EAAC1, GLT-1, GLAST, EAAT4 Y EAAT5, conocidos también
como SLC1A1, SLC1A2, SLC1A3, SLC1A6, y SLC1A7, respectivamente (Kanai &
Hediger, 2004).
En las células gliales, el tipo de transportador que ha sido descrito es el GLAST
(transportador de glutamato-aspartato), encargado de modular el transporte de Lglutamato, L - aspartato y D - asparto. Este sistema de transporte se da conjuntamente con
la entrada de tres iones de Na+, un ion H+ y la salida de un ion K+. El aislamiento de este
transportador se ha realizado a partir de cerebros de ratas y la verificación de sus funciones
se han llevado a cabo en los oocitos de Xenopus laevis. (Kanai & Hediger, 2004).
Este transportador se encontró ampliamente distribuido en el cerebro, en el cerebelo, se
evidenció en el stratium gangliosum en las células de Bergmann. Se ha encontrado que
estos sistemas de transporte son altamente dependientes de sodio y son inhibidos a su vez
29
por el DL-treo-3-hidroxiaspartato (Storck et al., 1992) En comparación con el transportador
de dicarboxilatos mitocondrial, GLAST no puede transportar L - malato, el cual es
estructuralmente similar al aspartato. Los valores que de KM reportados para glutamato y
aspartato son de 77 ± 27 µM y de 65± 30 µM respectivamente. La afinidad para ambos
sustratos en muy similar al valor obtenido de los cultivos primarios de astrocitos, los cuales
presentaron valores entre 67 -77 µM. Sin embargo, en los cultivos primarios de neuronas la
afinidad por ambos sustratos es mucho más alta, con valores de 20 µM para glutamato y 32
µM para aspartato (Storck et al., 1992).Por otra parte se han realizado estudios sobre los
efectos que tiene el cadmio, (metal pesado toxico) sobre los trasportadores de glutamato en
las células gliales, específicamente en GLAST y en GLT1 y se ha evidenciando que en los
astrocitos la expresión del GLAST es mayor en el día postnatal 1 (Liu et al., 2008).
1.3.2. Metabolismo del Aspartato.
En el cerebro, las principales vías metabólicas que han sido consideradas para la
producción de L– aspartato, son vía el oxalacetato procedente del ciclo de ácidos
tricarboxilicos, acoplado a la lanzadera del aspartato malato vía aspartato aminotranferasa
(AST) presente en el citosol y la mitocondria (Gundersen & Storm-Mathisen, 2000;
Johannessen et al., 2001).
Otra fuente reportada en los astrocitos que da lugar a la formación de L- aspartato, es el
aminoácido L- asparginina por medio de la actividad de la L-asparginasa EC (3.5.1.1)
(ASP; L-asparaginasa-amidohidrolasa). Esta enzima ha sido reportada en cerebros de rata,
se encarga principalmente de la deaminación de la asparagina, formando así el aminoácido
L-aspartato y amonio. En los mamíferos, se ha encontrado un tipo de esta enzima,
denominada Gliap (Glial asparaginasa), se encuentra en hígado, testículos y en cerebro. En
este último se encuentra predominantemente en el citosol de las terminaciones astrociticas,
al parecer esta enzima hace parte de un nuevo grupo atípico de L-asparginasas tipo I porque
posee el centro activo de una glicosilasparaginasa tipo 1, carece de un sitio autoproteolitico
como las aspariginasas presentes en plantas y tiene una actividad enzimática tipo II. Su
30
distribución particular en los astrocitos, ha sugerido el papel que tiene en cuanto a la
síntesis del aminoácido neutro activo L-aspartato (Dietrich et al., 2003).
No solo se ha encontrado L- aspartato en cerebro y en tejidos de mamíferos sino también se
ha encontrado el isómero D- aspartato, particularmente en tejidos de neonatos. Los niveles
reportados pueden llegar a alcanzar concentraciones milimolares en la corteza cerebral de
recién nacidos, en la glándula pituitaria y en la glándula adrenal (Schell et al., 1997). Sin
embargo, también se han reportado concentraciones de este isómero, que alcanzan el orden
entre 0.48 y 0.90 nmol/g de tejido seco, sugiriendo que son concentraciones muy bajas
comparadas con L-aspartato, además el isómero D-aspartato es difícilmente metabolizado
por el cerebro y tiende a acumularse. Este tiene afinidad por receptores de glutamato
compitiendo con otros agonistas de glutamato, posiblemente una de las funciones que se le
ha atribuido es que actúe como modulador de la trasmisión sináptica excitatoria del
glutamato (Gong et al., 2005).
En la corteza de ratas adultas, el D-aspartato es transportado con alta afinidad, este
transporte depende de las concentraciones de sodio presentes en el medio. Si el sodio es
reemplazado por colina, su transporte se ve inhibido totalmente, mientras que si es
reemplazado por iones de litio, el transporte disminuye pero no es ihnibido. La liberación
de este isómero se relaciona con las altas concentraciones de potasio y de calcio. Tanto el D
como L-aspartato desencadenan hiperactividad cuando son inyectados intraperitonealmente
en las ratas inmaduras. El uso de D-aspartato radiactivo sirve para evidenciar el papel que
tiene el L-aspartato como neurotransmisor, ya que el metabolismo de D-aspartato es mucho
más lento (Davies & Johnston, 1975).
La enzima D- aspartato oxidasa (DAPOX) (EC 1.4.3.1), es la única enzima conocida capaz
de metabolizar el D-aspartato, además de regular los niveles de este ismoero en el cerebro
Esta enzima cataliza la reacción de D-aspartato + H2O + O2, formando oxaloacetato + NH3
+ H2O2 (Schell et al., 1997). A partir de estudios de inmunohistoquímica y de hibridación
31
in situ, se analizó el mRNA en humanos y en cerebros de ratas. Permitiendo evidenciar su
localización celular y subcelular De igual forma demostraron que la distribución de la
localización de esta enzima es reciproca con la disponibilidad de D-aspartato y ha sido
reportada principalmente en peroxisomas. En el cerebro los peroxisomas, están
concentrados en oligodendrocitos en la sustancia blanca. Sin embargo, su actividad ha sido
reportada más que todo en neuronas y aun cuando está presente
astrocitos y
oligodendrocitos, su actividad es baja. Los mayores niveles de D-aspartato se presentan en
la glándula pituitaria, adrenal y pineal, sugiriendo que este puede ser un modulador del
sistema endocrino (Schell et al., 1997).
Se sabe que el L-glutamato y el D-aspartato promueven la toma de Na+ en los astrocitos, ya
que son cotransportados junto con este ion. Esto promueve el incremento intracelular de la
concentración de sodio, estimulando simultáneamente a la bomba de sodio y potasio y a su
vez incrementa la demanda de energía en forma de ATP. (Schell et al., 1997).
La mayoría de estudios relacionados con el metabolismo del aspartato se basan en la
cromatografía de gas- espectrofotometría de masa. En un estudio realizado con [15N]
aspartato en cultivos de astrocitos, se identificaron las vías metabólicas en las que el
nitrógeno de este aminoácido está involucrado. En la primera vía, hay una transaminación a
glutamato, mediado por la aspartato aminotransferasa. El glutamato a su vez puede ser
convertido en otros aminoácidos como glutamina, alanina, serina y ornitina. La segunda
ruta está relacionada con el ciclo de los nucleótidos de purina, el aspartato se condensa con
inosin monofosfato (IMP) por acción de la adenilosuccinato sintetasa (E.C.6.3.4.4) para dar
lugar al compuesto adenilsuccinato. Este último es convertido a fumarato y a adenosin
monofosfato, por la adenilosuccinasa, restableciendo nuevamente el ciclo. La tercera vía
tiene que ver con algunos compuestos que intervienen en el ciclo de la urea, el aspartato se
condensa con la citrulina en el citosol por acción de la enzima argininosuccinato sintetasa,
dando como resultado argininosuccinato. Una vez formado puede ser hidrolizado a
fumarato y a [15N]-arginina por medio de la arginosuccinasa (Yudkoff et al., 1987).
32
En este mismo estudio se midio la formación de arginina comparada con la de otros
aminoácidos y la formación de esta fue más relevante, el flujo de nitrógeno (nmol de
15
N/min por mg de proteína) fue mayor para arginina, con un valor de 9.93. Al parecer esta
parte del ciclo de la urea está muy activa en los cultivos de astrocitos, lo que indica
principalmente que estas células están en capacidad de sintetizar citrulina de novo, aun
cuando después de la adición de [15N]-aspartato no se reporto formación de [15N]-urea.
Adicionalmente, se hicieron incubaciones con NaH13CO3 para corroborar esto, indicando
que si hay una incorporación
incorporación de
13
13
C marcado citrulina con un valor de 24 ±11.2 e incluso la
C en aspartato fue de 49.4 ±18.9 .Posiblemente la formación de
aspartato se debe a la transaminacion de [13C]-oxaloacetato, debido a la acción de la
piruvato carboxilasa, restringida únicamente a astrocitos (Yudkoff et al., 1987).
Por otra parte se ha encontrado que el sistema nervioso central es sensible frente a cambios
drásticos en los niveles de oxigeno. En el caso de la hipoxia, llegan a disminuir la
utilización de citrato hasta un 30%, influyendo sobre los procesos metabólicos celulares y
el estado energético de las células. El metabolismo del citrato, estudiado a partir de
cerebros de ratas se ve afectado principalmente por las condiciones de hipoxia y no por el
decrecimiento de la actividad enzimática. (Rafalowska et al., 1975).
En este mismo trabajo se encontró en los cultivos aislados de astrocitos citosólicos, que los
niveles de sustratos (nmoles/mg de proteína) en condiciones normales de oxigeno
(normoxia) para aspartato fueron (62.00), citrato (2.27) y α-cetoglutarato (0.51). Mientras
que en condiciones de hipoxia estos valores difieren: los niveles de aspartato decrecen a
24.96, los de citrato se mantienen y los de α-cetoglutarato aumentan a 0.62. La disminución
del aspartato está relacionado con el tiempo de exposición a bajos niveles de oxigeno, ya
que la caída más grande de este sustrato se alcanza, transcurridos 30 minutos, descendiendo
hasta 0.02 µmoles de aspartato/mg de proteína y volviendo a los valores iniciales del
aspartato en condiciones normales después de 60 minutos. Al adicionar 0.4 mM de
33
aspartato, se incremento la oxidación de citrato, la ausencia de aspartato endógeno en la
fracción citosólica puede inhibir la oxidación de citrato. Esta ausencia de aspartato se debe
a que este sustrato puede ser utilizado en otras vías metabólicas (Rafalowska et al., 1975).
La formación de aminoácidos neuroactivos en la capa celular fotorreceptora, ha sido
estudiada, a partir de precursores como la glucosa y la glutamina radiactivamente
marcados. Se demostró que los principales aminoácidos derivados de estos sustratos son el
aspartato, glutamato y GABA. Se ha sugerido que el glutamato y el aspartato actúan como
neurotransmisores en la capa celular fotorreceptora. La mayor incorporación de [14C]glucosa y [3H]-glutamina en glutamato y aspartato se dio específicamente en esta parte de
la retina, abarcando entre el 40-50% del tejido. La concentración endógena de aminoácidos,
definida como nmol/3.0 mm dia.disc del tejido fue de 2.05 ± 0.1 para aspartato y para
glutamato 3.53 ± 0.11 incubados con los respectivos sustratos sin marcar (Morjaria &
Voaden, 1979).
La lanzadera de malato-aspartato, es un
mecanismo metabólico característico en
mamíferos (Figura 2). Las células para continuar con el metabolismo oxidativo del
piruvato, generado a partir de la glucólisis necesitan estar renovando constantemente las
tasas de NADH/NAD+ y continuar con el metabolismo oxidativo vía el ciclo de los ácidos
tricarboxílicos., la cual provee la mayor cantidad de energía. El fin de este mecanismo es
transferir equivalentes reducidos desde el NADH en el citosol hacia la matriz mitocondrial,
ya que la membrana interna mitocondrial es impermeable tanto a NADH como a NAD+
(Riera et al., 2008).
El funcionamiento adecuado de la lanzadera de malato-aspartato, requiere de la
intervención de ciertas enzimas y de la acción de transportadores de membrana.
Las enzimas involucradas en esta lanzadera son la malato deshidrogenasa-NAD
dependiente (E.C.1.1.1.37) y la aspartato aminotransferasa (E.C. 2.6.1.1). Las isoformas
34
citoplasmáticas y mitocondriales de estas enzimas son de igual forma necesarias teniendo
en cuenta que es un mecanismo reversible, que se lleva a cabo entre el citosol y la
membrana interna mitocondrial de las células.
Por otra parte, son necesarios los antiportes aspartato/glutamato y malato/α-cetoglutarato.
Se han descrito dos formas para el transportador de aspartato/glutamato, llamado aralar 1
(AGC1), el cual es sensible a las concentraciones de Ca+2 y está presente en tejido muscular
y algunas partes del cerebro. La segunda forma descrita es citrin (AGC2), este
transportador fue inicialmente reportado en riñón e hígado (Del Arco et al., 2000), sin
embargo, también se encontró la expresión de este transportador en astrocitos en
condiciones de cultivo y se sugirió que el transportador AGC1 es más activo en
mitocondrias neuronales que en las astrociticas (Ramos et al., 2003). Finalmente para
esclarecer un poco el panorama sobre la ubicación de este transportador, se llevo a cabo un
análisis del transcriptoma en astrocitos aislados de cerebros adultos de ratas, evidenciando
que AGC1 también se expresa en estas células (Lovatt et al., 2007). Las enzimas
involucradas en esta lanzadera son la malato deshidrogenasa-NAD dependiente
(E.C.1.1.1.37) y la aspartato aminotransferasa (E.C. 2.6.1.1). Las isoformas citoplasmáticas
y mitocondriales de estas enzimas son de igual forma necesarias teniendo en cuenta que es
un mecanismo reversible, que se lleva a cabo entre el citosol y la membrana interna
mitocondrial de las células.
En el citosol, la malato deshidrogenasa (cMDH) (E.C.1.1.1.37), es la encargada de
transferir electrones al oxaloacetato, formando así malato y NAD+. Estos electrones pueden
venir por la vía de la glucólisis o por la oxidación de lactato a piruvato. Una vez formado el
malato, es transportado por medio del antiporte malato/α-cetoglutarato hacia la matriz
mitocondrial. A medida que entra malato a la matriz, simultáneamente es exportado αcetoglutarato hacia el citosol. El malato es convertido nuevamente a oxaloacetato por
acción de la malato deshidrogenasa mitocondrial (mMDH) al igual que el NAD+ es
reducido nuevamente a NADH, finalmente para ser utilizado en la fosforilación oxidativa.
35
Figura 2. Lanzadera de malato/aspartato.
Los electrones provenientes de la glucolisis o de la oxidación de lactato a piruvato
son transferidos como equivalentes reducidos del citosol a la mitocondria. El malato
citosólico es transportado a la matriz mitocondrial e intercambiado por αcetoglutarato, a través del transportador de malato/ α-cetoglutarato. En la matriz es
oxidado a oxaloacetato por la mMDH. Los electrones son transferidos y utilizados en
fosforilaciòn oxídativa. El oxaloacetato pasa a aspartato por la transaminación con
glutamato por la AAT mitocondrial .Luego es llevado al citosol por AGC1 y es
intercambiado por glutamato y un proton. Nuevamente es convertido a oxaloacetato
por la acción de la cAAT.
Fuente: Riera et al., 2007.
36
El grupo amino del oxaloacetato es transferido al glutamato, por la enzima aspartato
aminotransferasa (mAAT) (E.C 2.6.1.1), convirtiendo el oxaloacetato a aspartato y el
glutamato pasa a ser α-cetoglutarato. El aspartato puede ser transportado por AGC1
nuevamente hacia el citosol y hay un intercambio electrogenico con glutamato y un protón.
En el citosol es convertido nuevamente a oxaloacetato por transaminacion con αcetoglutarato por acción de la aspartato aminotransferasa citosolica (cAAT) (Mckenna et
al., 2006).
1.4. N-acetilaspartato (NAA)
El N-acetil aspartato (NAA), es un aminoácido clave involucrado en la mayoría de los
procesos metabólicos del sistema nervioso central (SNC). Se encuentra ampliamente
distribuido en neuronas alcanzando concentraciones desde 10 mM e incluso hasta 20mM,
aproximadamente (Hanaya et al., 2008). El NAA, aun cuando se encuentra en la mayor
parte del cerebro, se concentra especialmente en la materia gris, como se pudo confirmar
con estudios de espectroscopia de alta resolución (Urenjak et al., 1992; Urenjak et al.,
1993).
Es importante resaltar que
las funciones de este aminoácido aun siguen generando
controversias en cuanto a su papel metabólico y neuroquímico y no se ha logrado establecer
el papel principal en el cerebro. Por esta razón, se han propuesto varias hipótesis sobre las
posibles funciones que puede tener este aminoácido dentro del sistema nervioso.
Enfermedades como Alzheimer, epilepsia, esquizofrenia, sindrome de Canavan, están
asociados con alteraciones en los niveles normales de NAA (Moffet et al., 2007).
Dentro de esas funciones se han propuesto las siguientes, el NAA está involucrado en la
manutención del reservorio de glutamato, cuando el flujo de este es muy rápido, ya que el
glutamato está involucrado en el metabolismo de amonio, transducción de señal, síntesis de
proteínas, de neurotransmisores, transmisión sináptica e intermediario en el metabolismo
(Clarck et al., 2006 ). Otras de las funciones que se le atribuyen al NAA, es que puede
37
actuar como un osmolito neuronal para mantener el balance hídrico (Baslow, 2002).
También se ha sugerido que es una fuente de acetato esencial para la síntesis de lípidos y
mielinizacion en el sistema nervioso central (SNC), especialmente durante el pico de
mielinización postnatal (Namboodiri et al., 2006).
1.4.1. Síntesis de NAA.
La síntesis de NAA, se da a partir de L-aspartato y del acetil CoA. La enzima encargada de
llevar la acetilación del aspartato es la acetilCoA/L-aspartato N-acetiltransferasa (ANAT;
EC 2.3.1.17), reportada en ratas. Se ha encontrado que esta enzima presenta una alta
afinidad por el aspartato y se encuentra únicamente en el sistema nervioso, principalmente
en las mitocondrias de las neuronas (Truckenmiller, 1985; Madhavarao et al., 2003). Por
otra parte se ha encontrado que los niveles de NAA en el cerebro aumentan notablemente
en el periodo perinatal durante la activa mielinizacion y desarrollo cerebral (Huang et al.,
2000).
Estudios comparativos realizados entre varias zonas del cerebro, han demostrado que la
actividad sintasa de esta enzima presenta variaciones y los niveles más altos corresponden
al tallo cerebral y medula espinal y las de menor concentración se encontraron en la retina
Con el fin de profundizar en este aspecto confirmaron la presencia de esta enzima en
diferentes fracciones subcelulares, específicamente en las mitocondrias y en los
microsomas del cerebro (Lu et al., 2004).
En el fluido extracelular el NAA presente, puede provenir de dos fuentes, una de esas
fuentes son las neuronas, encargadas de la biosíntesis de este aminoácido en el cerebro o la
otra posibilidad es que provenga de la hidrólisis del N-acetilaspartil glutamato a partir de
una enzima amino péptida de membrana plasmática, cuyo sitio activo se encuentra en el
espacio extracelular (Huang et al., 2000). La enzima que cataliza la hidrólisis del Nacetilaspartil glutamato (NAAG) a glutamato y NAA, es la glutamato carboxipeptidasa II
(GCPII), conocida también como NAAG peptidasa. Esta enzima permite que el glutamato y
el NAAG sean liberados de los terminales sinápticos, esta acción se puede ver inhibida el
38
acido pentanodióico 2-fosfonometil (Lusczki et al., 2006). La síntesis de NAAG, también
se ve limitada por la disponibilidad de NAA. El NAAG es liberado a partir de cortes
cerebrales y de sinaptosomas por medio de procesos de despolarizaciones dependientes de
Ca2+ . A su vez es exportado astrocitos, activando receptores metabotrópicos de glutamato
en la superficie celular de astrocitos y donde va a ser hidrolizado.
1.4.2. Transporte de NAA.
El NAA y la enzima encargada de su hidrólisis, están distribuidos en distintos
compartimentos celulares en el cerebro. El NAA se expresa predominantemente en las
mitocondrias de las neuronas mientras que la enzima aspartoacilasa II (ASPA); EC
3.5.1.15) es la encargada de hidrolizar el NAA, en aspartato y acetato, se encuentra
principalmente en el citoplasma de oligodendrocitos y astrocitos. El hecho de que exista
una compartimentación del NAA y de ASPA, sugiere que debe existir algún mecanismo de
transporte que permita intercambiar este aminoácido para que pueda ser hidrolizado por
ASPA en los en los astrocitos y oligodendrocitos, probablemente el NAA es liberado
constantemente en el espacio intersticial del cerebro (Chakraborty et al., 2001) (Figura3).
Un estudio realizado con cultivos primarios de astrocitos y de neuronas con [3H]-NAA,
demostraron que aun cuando ambos transportan NAA, en los astrocitos el transporte es
mucho mayor (Sager et al., 1999). En los cultivos realizados en neuronas había entre un 3 y
5 % de astrocitos y las neuronas presentaron una VMAX del 5%, evidenciando que los
astrocitos si presentan un sistema de captación de NAA mucho mayor que en las neuronas.
Al parecer el sistema de transporte de captación de NAA en astrocitos descrito es saturable
y se ve influenciado por las concentraciones en el orden mM de sodio, cloro y calcio (Sager
et al., 1999). Sin embargo, el ion cloro no parece influir directamente sobre el transporte de
NAA, aun cuando en su ausencia disminuye el transporte de este aminoácido, aun
prevalece su transporte (Huang et al., 2000; Fujita et al. ,2005). Existe una mayor afinidad
por el isómero L de NAA que por el D-NAA. La afinidad para análogos estructurales varia,
siendo mayor para L-NAA (0.12 mM), N-acetilaspartilglutamato (0.4mM), L-aspartato 1>
(Sager et al., 1999).
39
Las células gliales poseen un transportador con alta afinidad por el NAA, ya que su
transporte hacia estas células es indispensable para que este aminoácido pueda ser
hidrolizado intracelularmente y el acetato quede disponible para su utilización en la síntesis
de lípidos (Huang et al., 2000). A pH fisiológico el N-acetilaspartato existe como un anión
divalente, por la acetilación del grupo amino. Por esta razón es muy difícil que este amino
acido logre por medio de una difusión atravesar la membrana interna de las células gliales y
requiera de un transportador especifico para este. (Sager et al., 1999).
En investigaciones recientes se ha reportado que en los astrocitos un transportador llamado
NaDC3 (Na-coupled high-affinity dicarboxylate transporter). El sistema se ve
influenciado por la concentración de sodio, ya que este simporte intercambia tres iones de
sodio por molécula de NAA, y se ha identificado en las células que expresan la
aspartoacilasa (Huang et al., 2000; Fujita et al., 2005). Este transportador fue clonado a
partir de cultivos de células humanas y de ratas, en estas últimas se trabajo con cultivos
primarios de astrocitos. El patrón expresado en el cerebro concuerda con el expresado en
las células gliales y en la barrera hematoencefálica. La constante de Michales Menten con
respecto al NAA fue de aproximadamente de 60µM en ratas, mientras que para humanos la
constante fue de aproximadamente 250 µM (Huang et al., 2000)
Este transportador tiene afinidad por los intermediarios del ciclo de Krebs, como el
oxaloacetato, fumarato, malato, α-cetoglutarato y succinato, con este último el NAA
mantiene una similitud estructural, sugiriendo que este transportador puede actuar de la
misma manera que con el succinato. En los astrocitos de ratas se encontró que este
transportador presenta menor afinidad por el NAA con un KM de 110 µM y una mayor
afinidad por el succinato con un KM de 30 µM. (Fujita et al., 2005) aun cuando el NAA se
comporta como un inhibidor del transporte del succinato, presentando un IC50 de 180± 11
µM (Huang et al., 2000). La mayor parte de este aminoácido se encuentra en el cerebro y se
40
Figura 3. Interacciones entre neuronas y astrocitos, mediados por el Nacetilaspartato(NAA) y el N-acetilaspartatilglutamato (NAAG).
El NAA es sintetizado principalmente en las mitocondrias neuronales a partir de la
enzima acetilCoA/L-Aspartato N-acetiltransferasa (ANAT; EC 2.3.1.17). Este a su vez
es transportado a oligodendrocitos o es liberado al espacio intercelular y captado por los
astrocitos, El transportador NaDC3 ha sido reportado para oligodendorcitos y astrocitos.
Una vez en el citoplasma de estas células gliales es hidrolizado por la aspartoacilasa
(ASPA; EC 3.5.1.15), formando aspartato y acetato,este ultimo es indispensable para la
síntesis de mielina. Paralelamente, el NAA se une con glutamato dando lugar a NAAG
y es liberado por vesículas sinápticas, Por medio del receptor tipo3 metabotropico del
glutamato (mGluR3) bloquea canales de Ca 2+ y la liberación de glutamato. A su vez
actua con este receptor en los astrocitos, promoviendo la liberación de factores de
crecimiento.Puede ser hidrolizado en los astrocitos por al carboxipeptidasa II (GCP II),
dando lugar a glutamato y NAA, este es liberado a la circulación
Fuente: Modificado a partir de la figura de Benarroch et al., 2008.
41
encuentra en una concentración en el espacio intersticial de aproximadamente 80-100
µM, superando las concentraciones extracelulares de succinato que se mantienen en 20
µM, los intermediarios del ciclo de Krebs alcanzan concentraciones mayores en la
circulación sistémica Por ejemplo, el succinato 40 µM, oxalacetao 10 µM, αcetoglutarato 50 µM. Estos sustratos representan buenas fuentes de energía, además de
ser precursores de otros sustratos como el aspartato y el glutamato, importantes para el
funcionamiento metabólico celular (Huang et al., 2000). En presencia de estos sustratos,
el transporte también es inhibido notablemente demostrando que son los reconocidos
por el tipo de transporte NAA dependiente de sodio. A diferencia de los intermediarios
del ciclo de Krebs, el L-aspartato 2.5 mM, también mostro cierto grado de inhibición
pero no tan alto ya que posee un grupo de carga positiva y dos grupos de carga negativa
(Fujita et al., 2005). El NaDC3 se expresa además en el hígado, riñón, placenta y su
función puede estar encaminada más hacia el transporte de estos intermediarios que del
mismo NAA en estos tejidos. (Huang et al., 2000).
1.4.3. Catabolismo de NAA.
La aspartoacilasa II (ASPA) (EC 3.5.1.15), es la enzima que cataliza la hidrólisis del acido
N-acetilaspartico (NAA) para producir acetato y L-aspartato. Esta enzima también es
conocida como aspartoacilasa II o N-acetil -L aspartato amidohidrolasa y presenta una alta
especificidad por este aminoácido (Madhavarao et al., 2005).
Los estudios que se han realizado sobre esta enzima están enfocados primordialmente para
evidenciar sus funciones metabólicas con respecto a la utilización del NAA. Los primeros
intentos de purificación, se llevaron a cabo a partir de cerebro de ratas y finalmente se logro
purificar a partir de cerebro de bovinos. Anteriormente, se había propuesto que esta enzima
estaba asociada únicamente a membranas plasmaticas, sin embargo, estudios de
inmunoreactividad mostraron todo lo contrario, la reactividad hacia los anticuerpos de esta
enzima se evidencio más que todo en el citosol y no en las membranas (Moffet et al.,
2007).
42
Inicialmente, la expresión de esta enzima se había reportado principalmente en
oligodendrocitos en la materia blanca (Baslow et al., 1999; Madhavarao et al., 2004). No
obstante, también se encontró asociada a mielina (Chakraborty et al., 2001) y los astrocitos
tipo II también la presentan (Bhakoo et al., 2001). Esta enzima no se ha encontrado en las
neuronas. Se han identificado componentes específicos en diferentes secciones del riñón
por medio de inmunohistoquímica de peroxidasa (Hershfield et al., 2006). Aun cuando se
creía que esta enzima podía pertenecer a la familia de las estereasas, se llevaron a cabo
estudios de alineamiento, mostrando así muy pocas similitudes entra esta enzima y las
estereasas. Por otro lado, los alineamientos realizados con una familia de enzimas de zinccarboxipeptidasas, sugieren que esta enzima es una peptidasa dependiente de zinc. Sin
embargo, toda la secuencia de identidad de las aspartoacilasas conserva un rango de
similitud del 10% e incluso menor. Al parecer, han encontrado que esta enzima se
distribuye tanto en el citoplasma como en el núcleo (Hershfield et al., 2006).
Estudios realizados a partir de cultivos primarios de células gliales y neuronas, han
reportado la distribución de la actividad de ASPA.De acuerdo con esto, se evidencio que la
actividad de la enzima es mayor hacia los 14 días de cultivo en los astrocitos (Figura4), de
mostrándose que su actividad no está restringida únicamente en las neuronas sino también,
en oligodendrocitos inmaduros y oligodendrocitos progenitores de células tipo 2. (Tabla 2.)
(Bhakoo et al., 2001).
1.4.4. Enfermedad de Canavan.
La alteración o inactivación en la actividad de la aspartoacilasa II, está relacionada con la
enfermedad de Canavan. Esta enfermedad fue reportada por primera vez por Myrtelle
Canavan en 1931 y reconocida mas tarde en 1949 por Van Bogaert y Betrand (Adachi et
al., 1973). Es un desorden neurodegenerativo autosomal-recesivo muy común entre judíos
asquenazíes. Es causada por mutaciones en el gen acy2 el cual codifica para esta enzima
aspartoacilasa, los síntomas clínicos incluyen poco control de los movimientos de la
43
cabeza, atrofia óptica, macrocefalia, hipotonía y muerte temprana durante la niñez (Viola,
2007). Existen también tres variantes reconocidas clínicamente e incluyen la forma
congénita y más agresiva que es reconocida en las primeras semanas de vida. La forma
infantil que es la más común y aparece al cabo de seis meses de vida y finalmente la forma
juvenil que se manifiesta al cabo de los cuatro o cinco años de vida. La causa de los
síntomas no se tiene muy claro, ya que no hay evidencias que demuestren que son
consecuencia del incremento excesivo de NAA y un déficit en su metabolismo o la
incapacidad de formar L-aspartato y acetato (Viola, 2007).
Basados en estudios ultraestructurales, se ha encontrado que dentro de las patologías
asociadas a esta enfermedad, están las que alteran a los astrocitos, los cuales presentan
hipertrofia e hiperplasia. Adicionalmente también hay una degeneración esponjosa cortical
y subcortical de la sustancia blanca del cerebro con vacuolas dentro de las hojas de mielina,
defectos en mielina, además de una desmielinizaciòn continua, inflamación de los
astrocitos y mitocondrias (Namboodiri et al., 2006).
La síntesis y degradación de NAA es crucial para lograr mantener la materia blanca, la cual
está compuesta por fibras neuronales cubiertas en su mayoría por mielina. Es posible que
este amino acido sea una fuente primordial para la producción de ciertos lípidos que darán
lugar a la mielina .A partir de esta hipótesis, se ha propuesto que la hipomielinizaciòn se
debe más que todo al déficit de acción de esta enzima, ya que una de las posibles funciones
de ASPA es proveer acetatos para el incremento en la síntesis de lípidos principalmente
durante el desarrollo postnatal del sistema nervioso central. (Madhavarao et al., 2005;
Namboodiri et al., 2006). Esto mismo es corroborado por estudios sobre síntesis de lípidos,
en donde se demuestra que existe una disminución en la síntesis al igual que un
decrecimiento de la actividad enzimática (Madhavarao et al., 2005). El decrecimiento en la
actividad enzimática genera una acumulación del NAA y esto se ve reflejado en pacientes
diagnosticados con este tipo de leucodistrofia, en donde se presentan altos niveles de NAA
en la orina, en la sangre y en el fluido cerebroespinal, en el orden de 10 a 100 veces.
44
Tabla 2. Actividad de la aspartoacilasa II en células derivadas del sistema nervioso.
La actividad enzimática es expresada como (nmol/min/mg proteína); media±DS; n:
numero de preparaciones celulares. Los cultivos primarios de neuronas y células
gliales fueron aisladas a partir de cerebro de ratas. Los progenitores O-2, se obtuvieron
del cuerpo calloso de ratas de 7 días de nacidas, astrocitos tipo-2 y oligodendorcitos
maduros e inmaduros provienen de la misma población de progenitoreS O-2. Los
astrocitos tipo-1y las neuronas cerebelares granulosas se aislaron de cerebro de rata de
siete días de nacido, mientras que las neuronas corticales de embriones de 14-16 días.
Los valores de p se obtuvieron del análisis de ANOVA y la actividad enzimática se
comparo con la obtenida de los progenitores O-2 A.
Fuente: Bhakoo et al., 2001.
Figura 4. Evolución de la actividad de la aspartaoacilasa en astrocitos
corticales tipo 1 durante el tiempo de cultivo.
Las actividades obtenidas en diferentes tiempos de cultivo se compararon con el día 0 y
se consideraron estadísticamente diferentes a (p<0.001).
Fuentes: Bhakoo et al., 2001.
45
2. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
2.1. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
El desarrollo intrauterino y el nacimiento están caracterizados por cambios funcionales y
anatómicos. Estos cambios adaptativos son importantes y están relacionados con el
mantenimiento energético para la supervivencia del recién nacido durante la prelactancia
(aproximadamente 2 horas postparto). Este periodo del desarrollo, es crítico, ya que al
momento de nacer el neonato deja de recibir súbitamente el aporte de nutrientes de la
madre y debe comenzar a sobrevivir con sus propias reservas energéticas. Por otra parte, el
restablecimiento de los niveles de glucosa en la sangre por medio de rutas metabólicas
como la gluconeogénesis, no es suficiente para el SNC, se requiere entonces, la utilización
de otros posibles sustratos que contribuyan con el gasto energético, la formación de
precursores de neurotransmisores y la síntesis de lípidos.
De acuerdo con estudios de sustratos como el lactato, 3-hidroxibutirato, acetoacetato,
acetato y glutamina en condiciones fisiológicas perinatales, se ha demostrado que éstos
pueden contribuir a la producción de energía o para la síntesis de lípidos mientras se
establece la normoglucemia. Con base en lo mencionado anteriormente, este trabajo se
enfoco principalmente en el estudio de la utilización del aspartato por los astrocitos, como
un sustrato alternativo para apoyar los procesos metabólicos involucrados durante la
prelactancia.
2.2. JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN
El estudio del uso de sustratos alternativos a la glucosa por parte de los astrocitos permitirá
entender como logran estas células sobrevivir a este breve período de inanición
(prelactancia) y suplir metabólicamente a las neuronas optimizando los recursos
energéticos. Es importante tener en cuenta que la prelactancia es una etapa crucial para el
46
individuo, principalmente en cuanto a su desarrollo cerebral y fisiológico para lograr una
homeostasis energética. Debido a la gran demanda energética durante esta etapa, es
primordial que continúe la biosíntesis de sustratos energéticos, que puedan ser utilizados
por el recién nacido.
A pesar de que en trabajos previos se ha demostrado que los astrocitos están en capacidad
de metabolizar otros sustratos, no hay estudios perinatales sobre la utilización del aspartato.
Este trabajo constituye una primera aproximación al estudio de la capacidad de los
astrocitos para utilizar el aspartato como fuente de energía y para la síntesis de lípidos y
permitirá complementar el mapa metabólico existente
47
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GENERAL
Estudiar el metabolismo del aspartato en los astrocitos durante el periodo de la prelactancia.
3.2. ESPECÍFICOS
Evaluar la capacidad de los astrocitos para utilizar el aspartato como sustrato oxidativo o
lipogénico en condiciones fisiológicas perinatales.
Evaluar si la utilización del aspartato puede ser modificada por variaciones en las
concentraciones de glucosa, lactato y N-acetil-L-aspartato (NAA).
Determinar si hay variaciones de la actividad enzimática de la aspartaoacilasa II (N acetilL-aspartato amidohidrolasa) en presencia de diferentes sustratos metabólicos en cultivos
primarios de astrocitos.
48
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. MATERIALES
4.1.1. Especie ensayada.
Se utilizaron neonatos de ratas albinas Wistar suministradas por el bioterio de producción
de la Facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana para llevar a cabo los
cultivos primarios de astrocitos. (Saneto, 1987; Cohen, 1995; Tovar, 1995).
4.1.2. Concepción de ratas (Aspectos bióticos).
Una de los métodos para determinar el sexo en ratas jóvenes ó adultas se basa en la
observación del espacio anogenital, en los machos la distancia entre el ano y la papila
genital es mucho más grande que el que se presenta en las hembras. Tanto en machos como
en hembras, la pubertad se da entre los 50-60 días de edad. En las hembras la vagina
empieza a abrirse hacia los 72 días y el primer ciclo estral ocurre hacia los 77 días de vida
aproximadamente. Normalmente las ratas se ponen a cohabitar entre los 100 y 120 días de
edad y la fertilidad máxima se alcanza entre los 100 y los 300 días de edad (Baker, 1979).
El periodo gestacional tiene un promedio de duración de 22 a 23 días, desde el momento en
que las hembras son copuladas hasta el momento del parto y presentan un alargamiento
abdominal hacia los trece días de embarazo. La edad gestacional de la rata se controló
limitándose a una noche el tiempo de cohabitación de ratas vírgenes con machos,
apartándoseles en la mañana del día siguiente.
4.1.3. Condiciones del bioterio (aspectos abióticos).
Las ratas empleadas para los experimentos, se mantuvieron en jaulas con un ritmo de luzoscuridad de 12 horas, con la fase de oscuridad entre las 20 y 8 horas del día siguiente. Las
condiciones de humedad variaron entre el 45 y 65% y la temperatura entre 20 y 25.
Se les proporciono a las ratas acceso ad libitum a agua y con una dieta sólida estándar de
49
Rodentina® constituida por un 17% de proteínas, 3% de lípidos, 58.7% de carbohidratos,
4.3% de celulosa, 5% de minerales y 12% de humedad.
4.1.4. Productos.
El medio de cultivo para el crecimiento de astrocitos fue de tipo Eagle modificado por
Dulbecco (DMEM) (Sigma, D-2902), suero fetal bovino (FBS) (Gibco BRL 16000-36),
DNAsa tipo I (Boehringer Mannheim, Ref. 104159), gentamicina (Sigma Ref. G1272),
poli-L-lisina (Sigma, P-8954), albúmina bovina (Sigma, A3311), tripsina (Sigma, T-5266),
bicarbonato de sodio anhidro (NaHCO3) (Sigma Ref. S5761, PM= 84.01 g/mol), rojo de
fenol (Merck, 7241), cloruro de potasio (25 mM) (Merck, 4936).
Se emplearon tres tipos de agua: agua destilada y agua desionizada para el lavado del
material y para la preparación de las soluciones se emplea agua desionizada previamente
pasada por autoclave (agua ultrapura).
4.1.5. Medios instrumentales.
Durante el desarrollo del experimento se utilizaron los siguientes equipos: balanzas
analíticas (AND HR-120 y Sartorius 210), pH metro (Schott C6 840B), cámara de flujo
laminar (Diseño industrial modelo H24336C00-AAAAAA), incubadora de CO2 (GS
Laboratory Equipment, Revco última RCO30000T-7-AB), centrífuga para tubos Falcon
(IEC International Centrifuge MPR4R), baño serológico, agitador magnético (Lab Line
Pyro Magnestic), desionizador (Millipore Milli-Q Water system), congelador y nevera
(Centrales), microscopio (Olimpus), pipep-boy (Accu-jet Brand), centrifuga para
Eppendorf (Eppendorf centrifugue 5410), estufa (Heraeus Instruments Model T6 Class 2) y
autoclave (Pressure sterilize Model 1925X).
Adicionalmente se utilizaron un hemocitómetro (cámara de Neubaüer), pipetas automáticas
(Brand 100-1000(l; 10-50 (l), filtros estériles de 1 litro (Nalgene NYL 151-4020), tubos
Falcon estériles (VWR Scientific Products N. 21008-178) y filtros estériles de 0.22 (m
50
(Sterile Millex-GS, Ref. SLG0250S).
4.2. MÉTODOS
4.2.1. Lavado de material de vidrio para cultivo.
En el caso de este material, se sumergió en HCl (15.5 ml/500ml de agua destilada) 24-48 h.
Se aclaró con agua destilada. Una noche con agua destilada y después, 8 aclarados a mano
con agua destilada y 8 con agua ultrapura. Luego del secado, se envolvió en papel aluminio
y se llevó a la autoclave a 121 °C con 15 libras de presión o en la estufa a 180 °C, de
acuerdo con la naturaleza del material (Morgan, 1995).
4.2.2. Composición de soluciones.
4.2.2.1. Solución Earle (EBS)
Esta solución se empleó para sumergir los cerebros extraídos y para el proceso de
disgregación mecánica y tripsinización de los cortes del cerebro (Saneto, 1987)
Solución de Earle (EBS)
NaCl
116 mM
KCl
5.4 mM
NaH2PO4.H2O
1.0 mM
MgSO4.7H2O
1.5 mM
NaHCO3
2.6 mM
Rojo fenol
10 mg/L
D-Glucosa
14 mM
Se ajustó el pH a 7.15 y se guardó a -20 °C. Esta disolución está dos veces concentrada.
4.2.2.2. Solución de disgregación (Solución A):
Se tomaron 50 ml de la solución de EBS concentrada y se diluyeron con 50 ml de agua
ultrapura (314 mOsM/kg H2O), además se le agregó:
51
Albúmina (Fracción V)
0.3% (P/V)
DNAsa tipo I
60 (g/ml
Se ajusta el pH a 7.6.
4.2.2.3. Solución de tripsinización (solución B) en 50 ml de solución A.
Tripsina
0.025% (P/V)
DNAsa tipo I
60 (g/ml)
Estas soluciones se esterilizaron por filtración (0.22 μm).
4.2.2.4. Tampón fosfato salino (PBS) (Elliott, 1969).
Esta solución se empleó para el lavado de las monocapas celulares y para la dilución del
concentrado de tripsina.EDTA.
NaCl
136 mM
KCl
2.7 mM
NaH2PO4
1.7 mM
Se ajustó el pH a 7.4 (Booher y Sensenbrenner, 1972) y se esterilizó por filtración (0.22
μm).
4.2.2.5. Medio de cultivo.
En el estudio de células animales in vitro en monocapas o en suspensión, se utiliza un
medio de cultivo sintético producido comercialmente. Para el cultivo de astrocitos
primarios se utilizo el medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Sigma D5523). Se
preparo 1 litro de este medio y se le adiciono bicarbonato de sodio anhidro (3.7g/l) el cual
tiene incorporado el indicador rojo de fenol (315 mOsm/kg H2O). Al medio se le ajusto el
pH a 7.2 (Chesler, 1990) y se esterilizo por filtración (0.22 µm). Una vez realizado esto, se
le adicionaron varios antibiòticos estériles: gentamicina (4 ml/L), penicilina +
estreptomicina (50 μl/L) y anfotericina (25 μl/L). Finalmente el medio fue envasado en
52
frasco oscuro para evitar su exposición a la luz y se llevo a refrigeración. Durante el
proceso de preparación se evito la exposición a la luz fluorescente ya que ciertos
compuestos como la riboflavina y triptófano al hacer contacto con esta pueden generar
productos tóxicos que afecten la composición del medio y a su vez el crecimiento celular
(Wang, 1976).
4.2.2.6. Suero.
Para la realización del cultivo primario de astrocitos, se le adiciono al medio de cultivo
suero fetal bovino (FBS) al 10 % (Kimelberg, 1983; Tabernero, 1993).
Este suero es considerado un fluido importante por promover la adhesión, sobrevivencia,
proliferación y diferenciación de las células en cultivo (Saneto, 1987). En estos cultivos la
adición de suero es de vital importancia para evitar que los espongioblastos se diferencien
en oligodendrocitos. (Saneto, 1987; Cole, 1989; Van Der Pal, 1990; Ishii, 1992).
4.2.3. Preparación de cultivos primarios de astrocitos.
Se utilizaron cerebros de neonatos de un día de vida postnatal (Cole y De Vellis, 1989;
McCarthy y De Vellis, 1980; Saneto y De Vellis, 1987; Schousboe, 1980). Una vez los
animales fueron limpiados con etanol (70%) y decapitados, se extrajeron sus cerebros
retirando el cerebelo y el bulbo. El cerebro fue frotado con ayuda de un pañuelo de papel
(estéril) para retirar las meninges y los vasos sanguíneos visibles. Se utilizaron 20 cerebros
de neonatos, los cuales fueron depositados en una placa de Petri con 7 ml de la solución A.
En esta solución los cerebros fueron disgregados con un bisturí y centrifugados durante 2
minutos a 1800 rpm. El precipitado obtenido se resuspendio varias veces en la solución B
para ser tripsinizado. Se incubo a 37 C y se agito mecánicamente durante 15 minutos a 80
ciclos/min .La suspensión se recogió en un tubo falcon con DMEN y FBS (10%),
deteniendo así la tripsinizacion. Nuevamente fue centrifugado a 1800 rpm durante 5
minutos, se retiro el sobrenadante y el precipitado fue resuspendido en una pipeta Pasteur
siliconada 8 veces en solución A para evitar la formación de grumos.
53
Se recogió el sobrenadante y el tejido se sometió al mismo tratamiento anterior. Se
reunieron los dos sobrenadantes y se centrifugaron a 1800 rpm durante 5 minutos, con
aceleración y desaceleración suaves.
Para llevar a cabo la determinación de la viabilidad y conteo celular, se resuspendieron las
células en 20 ml de DMEM y suero bovino (FBS) al 10%, KCl (25 mM) y el cóctel de
antibióticos. Se tomo una pequeña alícuota de esta suspensión celular y se mezcló en partes
iguales con azul de tripano (0.2%). La suspensión celular inicial se diluyó con el medio
anterior para conseguir una solución con una concentración de 9 x 105 células/ml
recomendada para la siembra de astrocitos (Tabernero, 1993).
Las células fueron sembradas en frascos Roux recubiertos con poli-L-lisina y se colocaron
en incubadora a 37°C con un 5% de CO2 (McCarthy y De Vellis, 1980). Los cambios de
medio se realizaron cada dos días durante los 14 días de incubación in vitro (DIV).
4.2.4. Incubación con cultivos primarios de astrocitos.
Se utilizaron como trazador radiactivo
el L-[14C]-aspartato, el rango de la actividad
específica del trazador es de (4400-9400 dpm/nmol) (Vicario, 1991; Tabernero, 1993a;
Tovar, 1995).
4.2.4.1. Composición del medio Elliott de incubación.
Esta solución tiene una composición aproximada a la del fluido cerebro espinal. Tiene más
baja concentración de calcio que el medio Krebs y Henseleit, pero aproximadamente la
misma cantidad de calcio ionizado en el plasma. Inicialmente, se preparo una solución de
tampón fosfato de 125 ml, de los cuales 100 ml corresponden a Na2HPO4 (11mM) y 25 ml
a NaH2 PO4 11mM y se le ajusto el pH a 7.6. Una vez preparado esta solución tampón se le
adicionaron otros compuestos. Por último se le adiciono el CaCl2 con agitación constante,
ya que este tiende a precipitar con el fosfato. Finalmente, se llevo el medio Elliot a un pH
7.4 y fue filtrado a través de una membrana de 22 µm (Elliott, 1969). La composición
54
definitiva es:
NaCl
KCl
KH2PO4
MgSO4
CaCl2
122 mM
4.8 mM
0.4 mM
1.2 mM
1.3 mM
4.2.4.2. Preparación de las soluciones para las incubaciones.
Inicialmente, para poder determinar la utilización del aspartato ya sea como sustrato
oxidativo o lipogenico, se preparo una solución de L-aspartato (0.5 mM) (Sigma A6683).en medio Elliot y se le adiciono 2 µCi de L-[U-14C]-aspartato (MP 10054E83)
(Rafalowska et al., 1975). A partir de esto, se hicieron las determinaciones cuantitativas,
para calcular la actividad específica (dpm/nmol).
Paralelamente, se prepararon soluciones donde se utilizaron diferentes sustratos fríos, como
glucosa (Merck 1.08337), L-lactato (Merck 366.0500) y N-acetil-DL-aspartato (NAA)
(Sigma A-5625). Las concentraciones se eligieron de acuerdo a concentraciones
fisiológicas en sangre en adulto y perinatal reportadas para cada uno respectivamente. Se
asumió concentraciones perinatales de glucosa (2 mM) lactato (10,5 mM) y N-acetil-DLaspartato (NAA) (20 mM) y concentraciones de adulto de glucosa (5 mM), L-lactato (5
mM) y N-acetilaspartato (10 mM). Cada una de las soluciones fue preparada en medio de
incubación Elliot al que se le adiciono 2 µCi de L-[U-14C]-aspartato. Los resultados de
respiración y lipogénesis se compararon con respecto al aspartato 0.5 mM. (Figura5).
Por cada frasco Roux se utilizaron 1.5 ml de medio de incubación Elliott, el cual contiene
los respectivos sustrato fríos y el L-[U-14C]-aspartato. De cada solución se tomaron 100 µL
para determinar la radiactividad inicial, necesaria para calcular la actividad específica
(dpm/nmol).
4.2.4.3. Incubación de astrocitos.
Antes de llevar a cabo las incubaciones, se gasearon durante 30 minutos los medios de
incubación con los respectivos sustratos. Para las incubaciones se emplearon astrocitos de
55
14 días de cultivo, en donde se consideran que estos están quiescentes y su metabolismo
estable. Se les retiro el medio de cultivo a los frascos tipo Roux donde se cultivaron los
astrocitos y se lavaron los frascos 2 veces con PBS. Luego, se añadió el medio de
incubación (Elliott, 1969) con los sustratos fríos y el respectivo radioactivo. Los frascos se
cerraron con un tapón de goma para ser incubados a 37°C. Adicionalmente, se incubaron
frascos tipo Roux con medio de incubación y los sustratos fríos más el radiactivo los cuales
se utilizaron como blanco. Para finalizar la incubación los frascos se enfrían a 4°C (Tovar,
1995; Tabernero, 1993).
Figura 5. Representación esquemática sobre el conjunto de pasos realizados para la
determinación de las velocidades de respiración y lipogénicas en los astrocitos.
Fuente: Autor
4.2.5. Determinación de la incorporación de sustratos en CO2.
Para determinar el 14CO2 producido durante la incubación se utilizo el método descrito por
Sykes, con algunas modificaciones (Edmond, 1987; Sykes et al., 1986a). Antes de realizar
56
la recolección del medio de cultivo, se preparo un erlenmeyer con un pocillo central, en el
cual se introdujo un tubo Eppendorf. En cada uno de los tubos Ependorf se añadieron 500
µl de hidróxido de hiamina para capturar el
14
CO2 .Paralelamente, alrededor del pocillo
central se añadieron 100 µl de KOH (10 M) para recoger el CO2 residual. Una vez realizado
esto, se cerraron herméticamente con un tapón de goma cada uno de los Erlenmeyer.
Los frascos de cultivo se colocaron en una bandeja con hielo para llevar a cabo la
extracción del medio de incubación. La extracción se realizo con ayuda de una jeringa sin
retirar los tapones de goma de cada uno de los frascos. A cada uno de los frascos de cultivo,
se les hizo un lavado con PBS y fue recuperado en su respectivo erlenmeyer.
Seguidamente, fueron inyectados 2 ml de KOH (0.3 M), manteniendo los frascos en una
posición en la que no hubiera contacto entre el hidróxido potásico y las células. De esta
forma se capturo el CO2 remanente de los frascos de cultivo. El hidróxido potásico se dejo
actuar durante una hora y transcurrido este tiempo fue retirado e inyectado en los erlemeyer
respectivamente.
Nuevamente se realizó otro lavado con PBS hasta completar todos los volúmenes en los
erlenmeyer. Por último se les agregó 100 µl de HClO4 (5 M) para poder acidificar el medio
y volatilizar el
14
CO2.Con el fin de atrapar todo el CO2 liberado, se dejaron durante una
hora bajo estas condiciones todos los erlemeyer.
Una vez realizado esto, el siguiente paso fue colocar en viales los tubos erlenmeyer con
hiamina, a los cuales se les adiciono 5ml de líquido de centelleo. Se agitaron por 30
segundos y se llevo a cabo la lectura de las desintegraciones por minuto. Las cuentas por
minuto (cpm) se corrigieron con base en la curva de apantalleamiento establecida según el
número H (Beckman, Palo Alto, CA., U.S.A.). Se utilizaron como blancos los frascos de
cultivo sin células, a los cuales se les realizó exactamente el mismo procedimiento,
mencionado anteriormente.
57
4.2.6. Determinación de la incorporación de los sustratos en lípidos totales.
El procedimiento para la determinación de lípidos difiere un poco del de la respiración.
Este se realizo con base en el método de Folch et al., 1957, con ligeras modificaciones
(Tovar, 1995; Tabernero, 1993). A los frascos de cultivo se les adiciono 2ml de metanol y
junto con un raspador se recogieron las células. Luego se pasaron a un tubo cónico con 2ml
de cloroformo (bidestilado), se agitaron por 30 segundos y se dejaron en la nevera por 16
horas.
La muestra se centrifugo a 2900 rpm durante 15 minutos a 4 ºC, se extrajo el tejido residual
producido entre las dos fases de solvente y luego se le adicionaron 1.2 ml de NaCl saturado
de cloroformo a cada uno de los tubos. Se agitaron los tubos mecánicamente por 30
segundos y se tomo la fase acuosa de cloroformo con pipeta Pasteur, recogiéndose en viales
de centelleo. Estos se dejaron enreposo bajo una corriente de N2 hasta secarse
completamente. Una vez realizado esto, se le adicionaron 5 ml de liquido de centello a cada
uno de los viales, se agitaron por 30 segundos y se midió la radioactividad incorporada a
los lípidos transcurridas 24 horas.
4.2.7. Cálculo de la velocidad de utilización de sustratos.
La velocidad de utilización de los sustratos se calculó dividiendo la radiactividad
incorporada en CO2 o en lípidos, por la radiactividad específica de los sustratos en el medio
de incubación (dpm/nmol), por el tiempo de incubación (1 h) y por el número de células
(106) (Albarracín, 2002; Tabernero, 1993; Tovar, 1995; Vicario, 1991).
Oxidación
(dpm muestra – dpm blanco) / (AE x h x 106 células).
Lipogénesis
(dpm muestra) / (AE x h x 106 células)
donde, AE = Actividad específica (dpm/nmol).
58
De acuerdo con este cálculo, los resultados se expresaron como nmol de sustrato radiactivo
incorporado en CO2 o en lípidos, por hora y por 106 células.
4.2.8. Determinaciones radiométricas.
La radiactividad se determino utilizando un contador de centelleo líquido. La corrección del
apantallamiento de las muestras en disolución acuosa se hizo empleando cantidades
crecientes de hidróxido de hiamina (de 0 a 500 µL) como sustancia apantallante. El cálculo
del apantallamiento en las muestras se realizó por interpolación en la curva de eficiencias
del contaje, ajustada a una ecuación polinómica de tercer grado. La eficiencia del aparato se
calcula en un 96-97% para la curva para la radiactividad inicial y los blancos; del 90-92%
para la curva de 14CO2 y del 85-86% para la curva de lípidos totales (Bolaños, 1992).
4.3. ENSAYO ENZIMÁTICO
El ensayo enzimático se hizo a partir de cultivos primarios de astrocitos. Se eligieron
células quiescentes de 14 días de cultivo y fueron cultivadas bajo las mismas condiciones
mencionadas anteriormente. El procedimiento para medir la actividad de la aspartoacilasa,
se realizo de acuerdo con el protocolo de Bhakoo et al., 2001 con algunas modificaciones
(Figura 6).
4.3.1. Preparación del homogenado.
Para la preparación del homogenado, se utilizaron células procedentes de astrocitos
crecidos in vitro en cajas de Petri de 9 cm de diámetro. Se recogió el medio de cada una de
las cajas de Petri en tubos falcon de 50 ml y las células se lavaron con 6 ml de PBS.
Se retiro el PBS de cada una de las cajas de Petri y se le adiciono 1ml de CaCl2 a cada una
de la siguiente forma: primero se rasparon y se recogieron las células con 500 µl y luego a
cada caja se le adiciono 500 µl CaCl2 más para recoger las células remanentes. Las dos
fracciones se recogieron en un tubo eppendorf. Posteriormente de una solución de Tritón X-
59
Figura 6. Representación esquemática sobre el ensayo enzimático de
acuerdo con Bhakoo et al., 2001).
En el siguiente esquema, se indican cada uno de los pasos realizados para llevar a cabo
el ensayo de la enzima aspartoacilasa II a partir de cultivos primarios de astrocitos.
Fuente: Autor
60
100 se tomaron 100 ml para poder permeabilizar las membranas. A cada eppendorf se les
adiciono 10 µl de esta solución para una concentración final 0.04%. Luego, la suspensión
fue homogenizada, antes de que las muestras fueran sonicadas 2 veces por 10 segundos.
4.3.2. Preparación de soluciones para el ensayo enzimático.
4.3.2.1. Soluciones fisiológicas.
Las soluciones de incubación se realizaron en un buffer de Tris-HCl (0.1 M) pH 8.0 para
evitar cambios drásticos de pH. Se preparo 10 ml de una solución a concentraciones
fisiológicas perinatales de N-acetil-DL-aspartato (NAA) (Sigma A-5625) (20 mM) de la
cual se tomaron alícuotas para preparar 10 ml de una solución de NAA (2 mM) y 10 ml de
una solución a concentraciones fisiológicas de adulto de NAA (10 mM). Adicionalmente se
prepararon soluciones de 10 ml a concentraciones fisiológicas de adulto: glucosa (5 mM)
(Merck 1.08337) y L-lactato (5 mM) (Merck 366.0500) y a concentraciones fisiológicas
perinatales: glucosa (2 mM), L-lactato (10,5 mM) y L-aspartato (0.5 mM) (Sigma A-6683).
Antes de llevar a volumen (10 ml) a cada una de las soluciones de glucosa, aspartato y
lactato se les adiciono una alícuota de NAA de manera que la concentración final fuera de 2
mM.
4.3.2.2. Mezcla de reacción 1.
Para la mezcla de reacción se prepararon las siguientes soluciones en buffer de Tris-HCl
(0.1 M), pH 8 : 25 ml de α-cetoglutarato (30 mM) (Sigma K-1128); 1ml de malato
deshidrogenasa (MDS) (Calbiochem 442610) y -NADH (Sigma N-8129).La mezcla de
reacción se preparo a partir de 1 ml de α-cetoglutarato, 1 ml de -NADH (1.5 mM) y 10 µl
de la enzima malato deshidrogenasa (MDS). La mezcla se llevo a un volumen final de 6.5
ml con buffer de Tris-HCl (0.1 M), pH 8 y se homogenizo mecánicamente con vortex por 1
min.
61
4.3.2.3. Mezcla del homogenado.
Se tomaron 200 µl de cada homogenado y se mezclaron con 200 µl de cada una de las
soluciones previamente preparadas para el ensayo enzimático. Adicionalmente, para el
blanco se tomaron 200 µl del homogenado y se mezclaron con 200 µl de buffer de Tris-HCl
(0.1 M), pH 8. Esto mismo se realizo para el medio de cultivo, a partir del cual se tomaron
200 µl y se mezclaron con 200 µl de buffer de Tris-HCl (0.1 M). Todas las soluciones
fueron incubadas a 37ºC por 2 horas. Después de las 2 horas de incubación se paró la
reacción a 100 ºC durante 10 minutos para desnaturalizar cualquier enzima presente.
Luego, cada mezcla fue centrifugada a 1800 rpm por 2 minutos para remover el precipitado
proteico.
4.3.3. Lectura de datos.
De la mezcla del homogenado se tomaron 300 µl del sobrenadante y se mezclaron con 1.2
ml. de la mezcla de reacción en tubos de vidrio. Luego, cada uno de los tubos se incubo a
37ºC por cinco minutos y transcurrido este tiempo de incubación, se les midió la
absorbancia inicial a 340nm con un espectrofotómetro (Genesis20). Antes de realizar las
lecturas de absorbancia a 340nm se empleo un blanco de 1.5 ml de solución buffer para
ajustar el 0 de absorbancia. Una vez realizada la lectura inicial, se le adiciono a cada una de
las muestras 5 µl de la enzima aspartato aminotransferasa (ATT) (Calbiochem 351800) y
las soluciones se dejaron incubando a 37 ºC por 2 horas para medir la absorbancia final a
340nm en estas condiciones.
4.3.4. Determinación de proteína total por el método de Bradford.
La determinación de proteínas en los cultivos celulares son de vital importancia, en este
caso se eligió el método colorimétrico de Bradford. Se realizo una curva de calibración
entre un rango de 10 -100 μg en un volumen de 0.1 ml.
62
4.3.4.1. Solución de proteína de reacción (Comassie)
Para la solución de proteína de reacción se utilizo Coomassie Brilliant Blue G-250 (40mg),
el cual fue disuelto en 20 ml de Etanol (95%). A esta solución se le adiciono 40 ml de acido
fosfórico (H3PO4) y se llevo a un volumen final de 400 ml con agua destilada.
Adicionalmente, se preparo una solución de albumina bovina (BSA) 1000 µg/ml y se llevo
a un volumen de 25 ml con una solución de NaCl 0.15 M. A partir de la solución de
albumina, se realizo una dilución 1:10 para obtener una solución de 100 µg/ml y a partir de
esta se hicieron diluciones seriadas 1:2. Luego, se tomo 0.1ml
de cada una de las
diluciones y 5 ml de la solución comassie en tubos y se llevo a cabo la lectura de las
respectivas absorbancias a 595nm.
4.3.4.2. Determinación de proteína extracelular.
Para determinar la cantidad de proteína extracelular en el medio de cultivo, primero se
extrajo el medio de las cajas de Petri y se llevo a tubos falcon de 50 ml. Se tomaron 12 ml
de los respectivos tubos y se centrifugaron a 1800rpm durante 2 minutos. De cada
sobrenadante se tomaron 0,1ml y 5 ml de Comassie y se midio la absorbancia a 595nm. El
blanco utilizado para los medios se hizo a partir de 0,1ml de medio y 5ml de solución
Comassie.
4.3.4.3. Determinación de proteína celular.
A las células de cada caja de Petri, se les hizo un lavado con 6ml de PBS a 37ºC, luego de
que este PBS fue desechado, se le adiciono 1 ml de PBS para raspar las células remanentes.
En tubos eppendorf se recogieron las células y se centrifugaron a 1800 rpm durante dos
minutos. Se desecho el solvente y se le agrego 1ml de PBS con 0.5 μl de Triton X -100
agitando la mezcla en vortex, antes de que fuera sonicada durante 2 minutos. La mezcla se
centrifugo en las mismas condiciones mencionadas anteriormente, de la cual se tomaron
0,1ml de la muestra y 5ml del reactivo comassi. Estos se mezclaron mecánicamente durante
1 minuto, se dejo reposar la mezcla durante 2 minutos y se leyeron las respectivas muestras.
63
Para la lectura de las muestras se utilizo un blanco, a partir de 0,1ml de PBS y 5ml de
comassie completando un volumen final de 5,1 ml para la lectura.
La determinación de proteína total fue la sumatoria de la cantidad de proteína celular y
extracelular.Los resultados de absorbancia fueron interpolados en la respectiva curva de
calibración.
4.3.5. Curva de calibración de Nicotinamida adenina dinucleótido (NADH).
Para la realización de la curva de calibración se prepararon simultáneamente tres soluciones
de 10 ml de NADH 1,5 mM. A partir de las cuales se hicieron diluciones seriadas 1:2,
obteniendo las siguientes concentraciones: 1,5; 0,75; 0,375:0.1875 mM. Se tomo 1 ml de
cada solución, se mezclo con 1.1 ml de la solucion buffer Tris-HCl y se homogenizaron. De
esta mezcla se tomaron finalmente 1,2 ml y se le adiciono 300 µl de la misma solución
buffer para llevar a cabo las lecturas respectivas de absorbancia de cada uno a 340nm.
4.4. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO
Los experimentos se realizaron de acuerdo con un diseño completamente aleatorizado con 3
replicaciones con quintuplicado por experimento para astrocitos. Los resultados obtenidos
del efecto sobre la utilización del aspartato con difrenetes concentraciones de sustrato se
analizo estadísticamente por medio del programa de Microsoft Excel. A los cuales se les
realizo con un análisis de varianza (ANOVA). Se hicieron comparaciones múltiples a los
resultados de actividad específica.
4.5. ASPECTOS ÉTICOS
El presente proyecto se ajustó a las normas científicas, técnicas y administrativas para la
investigación en salud [Bioseguridad de las investigaciones (título IV, Capítulo III) e
investigación biomédica con animales (Título V)] de la resolución No. 008430 de 1993, del
Ministerio de Salud de Colombia y en la ley 84 de 1989.
Se utilizaron ratas por el hecho de que es una especie con un desarrollo cerebral parecido al
64
del humano; y también porque se ha demostrado que tienen un metabolismo similar, que
permite extrapolar muchos de los resultados de los experimentos in vivo, in vitro y ex vivo.
Sin embargo, no se pueden utilizar procedimientos de sedación, analgesia o anestesia
porque pueden afectar los resultados metabólicos.
65
5. RESULTADOS
5.1. UTILIZACIÓN DEL ASPARTATO
Los resultados de respiración y lipogénesis obtenidos en este trabajo, evidencian la
utilización del aspartato tanto para la respiración (1.48 ± 0.28 nmol CO2/h/106 células)
como para la lipogénesis (0.017 ± 0.003 nmol lípidos/h/106células) a partir de la utilización
del L-[U-14C]-aspartato en condiciones perinatales en los cultivos quiescentes de astrocitos
(Tabla 3, Figuras 7 y 8). No obstante, estos resultados sugieren que el aspartato es
destinado principalmente para la respiración y en menor proporción para la lipogénesis.
5.2. COMPARACIÓN DE LA UTILIZACIÓN DEL ASPARTATO CON OTROS
SUSTRATOS METABÓLICOS EN CONDICIONES PERINATALES
En la Figura 9, se muestra la representación grafica de la comparación de los resultados de
la utilización de aspartato con respecto a otros resultados obtenidos sobre el metabolismo
de otros sustratos a partir de cultivos primarios de astrocitos en condiciones perinatales. Los
resultados obtenidos muestran una utilización del aspartato similar a la utilización del
acetato como sustrato oxidativo, que comparado con los demás sustratos, su contribución es
muy baja. El nuevo orden de utilización de sustratos seria Lactato (6.60 ± 0,17) >
Glutamina (4.42 ± 0,11) > 3-Hidroxibutirato (3.55 ± 0,14) > Glucosa (1.84 ± 0,14) >
Acetato= Aspartato (0.39 ± 0.06; 0.99 ± 0.13, respectivamente) (Tovar, 1995; Medina et
al., 1996; Tovar & Salazar ,2005).
Por otro parte estos resultados resaltan la baja contribución del aspartato como sustrato
lipogénico durante la prelactancia, El nuevo orden de utilización de sustratos seria Lactato
()> Glucosa (0.58 ± 0.02) >3-Hidroxibutirato (0.38 ± 0.05)> Glutamina=Acetato (0.16 ±
0.12; 0.06 ± 0.01, respectivamente)>Aspartato (0.01±0.05) ;( Tovar, 1995; Medina et al.,
1996; Tovar & Salazar ,2005). Teniendo en cuenta las comparaciones realizadas tanto para
respiración como para lipogensis se evidencia que durante el periodo perinatal los astrocitos
utilizan preferencialmente otros sustratos diferentes al aspartato como sustrato energético.
66
5.3. EFECTO SOBRE LA UTILIZACIÓN DE ASPARTATO COMO SUSTRATO
METABÓLICO
EN
PRESENCIA
DE
OTROS
SUSTRATOS
BAJO
CONDICIONES PERINATALES Y DE ADULTO.
Los resultados obtenidos con aspartato al compararse con los obtenidos a partir de la
variación en las concentraciones de glucosa, NAA y lactato (Tabla 3 y Figuras 7 y 8)
evidencian que la utilización de aspartato puede variar de acuerdo a las concentraciones
perinatales y de adulto utilizadas durante las incubaciones con estos sustratos,
encontrándose diferencias significativas (p<0.05) en la utilización de aspartato con glucosa,
NAA y lactato en condiciones perinatales y diferencias significativas(p<0.05)con lactato y
NAA en condiciones de adulto para respiración y lipogénesis.
5.4. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA ASPARTOACILASA (ASPA) EN
CULTIVOS
PRIMARIOS
DE
ASTROCITOS
EN
PRESENCIA
DE
SUSTRATOS METABÓLICOS EN CONDICIONES PERINATALES Y DE
ADULTO.
Se hicieron curvas de calibración de proteína total por el método de Bradford utilizando
albumina bovina (Figura 10A) y una curva de variación del NADH (Figura 10 B). Estas dos
curvas se utilizaron como referentes para calcular la proteína total del homogenado y la
variación de las concentraciones de NADH en los experimentos de actividad enzimática.
Los resultados obtenidos (Tabla 4 y Figura 11) demuestran la presencia de esta enzima en
los astrocitos. A partir de los cuales se pudo determinar la actividad enzimática y el efecto
sobre su actividad con variaciones en las concentraciones de glucosa, lactato y NAA en
condiciones perinatales y de adulto. Estos resultados sugieren al mismo tiempo que no
todos estos sustratos en condiciones perinatales y de adulto tienen el mismo efecto sobre la
enzima. La comparación entre los diferentes sustratos utilizados en las condiciones
mencionadas anteriormente sugiere una mayor actividad en presencia de NAA, aspartato y
67
glucosa. No obstante, la variación de la concentración de NAA comparada con el referente
(2 mM) no genero un aumento o disminución significativo en la actividad de la enzima
(p<0,05). Por otra parte la glucosa y el lactato en condiciones perinatales al igual que el
lactato en condiciones adultas si tienen un efecto significativo (p<0.05) sobre la actividad
enzimática.
68
Tabla 3. Efecto causado por diferentes sustratos sobre la utilización del aspartato como sustrato oxidativo y lipogénico
Cultivos quiescentes de astrocitos de 14 días se incubaron a 37 ºC durante 1 hora en medio Elliot que contenía 2 µCi de L[U-14C]-aspartato (4400-9400 dpm/nmol). Se comparan estadísticamente los resultados con respecto a la respiración y
lipogénesis del Aspartato (0.5 mM) en condiciones fisiológicas perinatales: Glucosa (Gluc) (5 mM); Lactato (Lac) (10.5
mM) y NAA (20 mM), y condiciones fisiológicas de adulto: Glucosa (Gluc) (2 mM); Lactato (Lac) (5 mM) y NAA (10
mM). Las velocidades de respiración se expresan como nanomoles de carbonos incorporados a CO2 por hora por millón de
células (nmol CO2/h/106de células) y para lipogénesis como nanomoles de carbonos incorporados a lípidos por millón de
células (nmol lípidos/h/106de células) y son medias ± SEM (n=5).
ASTROCITOS
Sustratos
Condiciones Perinatales
Asp (0,5 mM)
Asp (0,5 mM) + Glc (5 mM)
Asp (0,5 mM) + Lac (10,5 mM)
Asp (0,5 mM) + NAA (20 mM)
Condiciones adulto
Asp (0,5 mM) + Glc (2 mM)
Asp (0,5 mM) + Lac (5 mM)
Asp (0,5 mM) + NAA (10 mM)
Respiración
nmol CO2/h/106de células
Lipogénesis
nmol lípidos/h/106de células
1.480 ± 0.280
0.376 ± 0.062*
0.129 ± 0.025*
0.023 ± 0.004*
0.0170 ± 0.0030
0.0100 ± 0.0030*
0.0850 ± 0.0150*
0.0013 ± 0.0003*
1,580 ± 0.350
0,160 ± 0.040*
0,186 ± 0.043*
0,0360 ± 0.0100
0,0800 ± 0.0100*
0,0014 ± 0.0002*
*Presentan diferencias significativas (p<0.05) comparándolo con el aspartato
Fuente: Autor
69
Figura 7. Efecto causado por otros sustratos bajo condiciones perintales y de adulto sobre
la utilizcion de aspartato como sustrato oxidativo
Cultivos quiescentes de astrocitos de 14 días se incubaron a 37 ºC durante 1 hora en
medio Elliot que contenía 2 µCi de L-[U-14C]-aspartato (4400-9400 dpm/nmol). Se
comparan estadísticamente los resultados con respecto a la respiración de los
astrocitos utilizando el Aspartato (0.5 mM) en condiciones fisiológicas perinatales:
Glucosa (Gluc) (5 mM); Lactato (Lac) (10.5 mM) y NAA (20 mM), y condiciones
fisiológicas de adulto: Glucosa (Gluc) (2 mM); Lactato (Lac) (5 mM) y NAA (10
mM). Las velocidades de respiración se expresan como nanomoles de carbonos
incorporados a CO2 por hora por millón de células (nmol CO2/h/106de células) y son
medias ± SEM (n=5). Se presentan las diferencias significativas (p<0.05)
comparando los resultados con el aspartato (*).
Fuente: Autor
70
Figura 8. Efecto causado por otros sustratos bajo condiciones perintales y de adulto sobre
la utilizcion de aspartato como sustrato lipogénico
Cultivos quiescentes de astrocitos de 14 días se incubaron a 37 ºC durante 1 hora en
medio Elliot que contenía 2 µCi de L-[U-14C]-aspartato (4400-9400 dpm/nmol). Se
comparan estadísticamente los resultados con respecto a la lipogénesis en los
astrocitos utilizando el Aspartato (0.5 mM) en condiciones fisiológicas perinatales:
Glucosa (Gluc) (5 mM); Lactato (Lac) (10.5 mM) y NAA (20 mM), y condiciones
fisiológicas de adulto: Glucosa (Gluc) (2 mM); Lactato (Lac) (5 mM) y NAA (10
mM). Las velocidades de lipogenesis se expresan como nanomoles de carbonos
incorporados a lípidos por hora por millón de células (nmol CO2/h/106de células) y
son medias ± SEM (n=5). Se presentan las diferencias significativas (p<0.05)
comparando los resultados con el aspartato (*).
Fuente: Autor
71
Figura 9. Comparación de la utilización de aspartato con respecto a otros sustratos
metabólicos en cultivos primarios de astrocitos.
Astrocitos quiescentes de 14 días de cultivo se incubaron con los siguientes
sustratos durante 1 hora a 37ºC: lactato (Lac)(10 mM); glucosa (Glc)(2 mM):
3-Hidroxibutirato (3-HB)(2 mM); Glutamina (Gln)(2 mM); Acetato (Ace)(5
mM) y Aspartato(Asp)(0.5 mM). Para poder establecer una comparación
aproximada de la utilización de los diferentes sustratos, se estableció una
corrección y se refirió respecto a la incorporación de seis carbonos (glucosa).
Así las velocidades de oxidación se multiplican por 3/6 para Lac; 4/6 para el 3HB; 5/6 para Gln; 2/6 para el Ace y 4/6 para Asp. Las velocidades lipogénesis
se multiplican por 3/6 x 3/2 para el Lac; 4/6 para el 3-HB; 5/6 para Gln; 2/6
para el Ace y 4/6 para Asp (Medina et al., 1996; Tovar y Salazar, 2005).
Fuente: Autor
72
A.
B.
Figura 10. Curvas de calibración utilizadas para la determinación
de la actividad enzimática.
A. Curva de calibración para proteína por el método de Bradford ( = 595 nm). En la
curva de proteína total se muestra la línea de tendencia y la correlación entre la
absorbancia y concentraciones crecientes de albumina ( g) (Bradford,). B. Curva de
calibración de nicotinamida adenindinucleotido reducido (NADH) ( = 340 nm). En
la curva de NADH se muestra la línea de tendencia y la correlación entre la
absorbancia y concentraciones crecientes de NADH (mM).
73
Tabla 4. Actividad enzimática de la aspartoacilasa (ASPA) en cultivos
primarios de astrocitos en presencia de sustratos metabólicos en condiciones perinatales y de adulto.
Se utilizaron cultivos quiescentes de astrocitos (tipo I y tipo II) de 14 DIV que fueron cosechados e incubados a 37°C por
2 horas en presencia de NADH (1.5 mM), -cetoglutarato (30 mM), malato deshidrogenasa NADH dependiente (MDH)
(10 l) y aspartato aminotransperasa (ATT) (5 µl) preparados en una solución buffer Tris-HCl 0.1 M pH 8.0. Se
determino el efecto sobre la actividad de la aspartoacilasa II (ASPA) (nmol/min/mg proteína) con diferentes sustratos en
concentraciones fisiológicas perinatales y de adulto y son medias ± SEM (n=5).
ASTROCITOS
Absorbancias (340nm)
Inicio
Final
0 min.
120 min.
Solución Patrón (NADH 1,5
mM)
Control (homogenado)
Medio de cultivo
NAA (2 mM)(referencia)
Sustratos
Condiciones Perinatales
NAA (20 mM)
Asp (0,5 mM) + NAA 2 mM
Glc (5 mM) + NAA (2 mM)
Lac (10,5 mM) + NAA (2 mM)
Condiciones Adulto
NAA (10 mM)
Glc (2 mM) + NAA (2 mM)
Lac (5 mM) + NAA (2 mM)
Actividad especifica
(nmoles de Asp/min/mg proteína)
2.405 ± 0.003
0.165 ± 0.015
0.118 ± 0.023
1.822 ± 0.126
0.121 ± 0.014
0.105 ± 0.023
0.524 ± 0.132
0.135 ± 0.021 B
0.165 ± 0.017 B
3.111 ± 0.151 A
1.310 ± 0.456
1.993 ± 0.474
0.115 ± 0.016
0.116 ± 0.016
0.469 ± 0.110
0.538 ± 0.111
0.077 ± 0.005
0.103 ± 0.020
2.720 ± 0.582 A
2.964 ± 0.688 A
0.056 ± 0.003 C
0.021 ± 0.001 D
1.402 ± 0.407
1.802 ± 0.257
0.108 ± 0.002
0.411 ± 0.275
0.682 ± 0.179
0.079 ± 0.0012
2.673 ± 0.362 A
2.688 ± 0.469 A
0.058 ± 0.011 C
Valores con la misma letra no presentan diferencias significativas (p<0.05)
Fuente: Autor
74
B
A
A
A
C
D
B
A
A
A
C
Figura11. Actividad enzimática de la aspartoacilasa (ASPA) en cultivos
primarios de astrocitos en presencia de sustratos metabólicos en condiciones
perinatales y de adulto.
Se utilizaron cultivos quiescentes de astrocitos (tipo I y tipo II) de 14 DIV que fueron
cosechados e incubados a 37°C por 2 horas en presencia. A partir de los cuales se
determino el efecto sobre la actividad de la aspartoacilasa II (ASPA) (nmol/min/mg
proteína) con diferentes sustratos en concentraciones fisiológicas perinatales y de adulto y
son medias ± SEM (n=5).Se utilizo el control y el NAA (2Mm) como valores de
referencia.
Fuente: Autor
75
6. DISCUSIÓN
El metabolismo cerebral depende principalmente de la utilización de glucosa. Sin embargo,
durante el breve periodo de prelactancia la disminución de la disponibilidad de glucosa
favorece la utilización de otros sustratos como el lactato, el 3-hidroxibutirato, la glutamina
y el acetato que permiten mantener la respiración y la síntesis de lípidos, procesos
metabólicos que son críticos en este periodo. Trabajos previos con acetato (Tovar &
Salazar, 2005), un sustrato derivado principalmente de la hidrólisis del N-acetilaspartato
(NAA), han permitido postular que el otro producto de esta hidrólisis, el aspartato puede ser
utilizado como sustrato oxidativo y lipogénico por los astrocitos durante esta etapa.
Adicionalmente, los aminoácidos son importantes en el cerebro, no solo porque están
involucrados en la síntesis de proteínas sino también por el papel que pueden tener como
neurotransmisores, su participación en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos y síntesis de
precursores de otras sustancias (Datta & Mukherjee, 1985).
6.1. UTILIZACIÓN DEL ASPARTATO
Los primeros resultados obtenidos para respiración y para lipogenesis respectivamente
(tabla3, figura7 y figura8) evidencian la existencia de transportadores específicos para este
sustrato. La liberación de sustratos energéticos de la sangre al cerebro requiere de un
sistema de transporte entre las células endoteliales involucradas en la barrera
hematoencefálica y las membranas celulares de los astrocitos (Baud et al., 2002). Por otro
lado, para el transporte de aminoácidos se han descrito anteriormente tres sistemas de
transporte, A, Asc y L, según su carácter acido, neutro o básico. En los astrocitos, en la
membrana plasmática, ha sido reportado previamente un transportador GLAST, de alta
afinidad para L-glutamato, L-aspartato y D-aspartato. Este transportador depende de las
concentraciones de sodio y es independiente de cloro y su expresión se ve aumentada
principalmente en el día 1 postnatal (Liu et al., 2008). La existencia del transportador
GLAST a nivel de membrana plasmática en los astrocitos asegura la entrada del aspartato
76
exógeno que puede ser utilizado por diferentes vías. Por otra parte, se ha encontrado que el
L-aspartato es rápidamente transportado en los cultivos de astrocitos, en experimentos
llevados a cabo con L-aspartato (1-1000µm), la absorción de este aminoácido a una
concentracion de 500 µmol tiene una duración de 15 seg (Bender, 1997). Esto sugiere que
los astrocitos poseen un sistema de transporte muy a fin a este aminoácido, lo cual permite
que sea rápidamente metabolizado y utilizado en estas células.
Adicionalmente, en la membrana mitocondrial, también han sido reportados otros dos tipos
de transportadores, que son antiportes de glutamato/aspartato denominados SLC25A12
(Aralar1) y SLC25A13 (Citrin) y dependen de las concentraciones de Ca+2. Estos sistemas
de transporte facilitan la entrada del aspartato al mitosol de los astrocitos para que pueda
ser metabolizado por estas células. Suplementariamente, se pudo evidenciar con la
elaboración del mapa de isotopomeros (figura12) el posible destino de los carbonos
provenientes de la utilización de L-[U-14C]-aspartato en los astrocitos, demostrando que
este aminoácido es una fuente para la reconstitución de los reservorios de oxaloacetato
(OAA) y síntesis de otros intermediarios metabólicos, contribuyendo así con la continuidad
del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA). En el mapa se muestran las
descarboxilaciones evidenciadas a partir del marcaje de carbonos (14CO2), se dan a partir de
cuatro importantes reacciones que involucran: el complejo piruvato deshidrogenasa
(CPDH), el complejo isocitrato deshidrogensa (IDHC), el complejo α-cetoglutarato
deshidrogenasa ( -KGC), la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPK) y la enzima malica
citosolica (cME).
En el citosol el L-[U-14C]-aspartato es transaminado a [U-14C]-oxaloacetato por medio de la
enzima aspartatoaminotrasnferasa (AAT) y luego a [U-14C]-malato vía la malato
deshidrogenasa citosolica (cMDH) (E.C.1.1.1.40).
77
Figura 12. Destino de los carbonos marcados a partir de L-[U-14C]-aspartato.
Se evidencian las posibles descarboxilaciones que se pueden dar se da en los astrocitos a
partir de cuatro importantes reacciones que involucran: el complejo piruvato
deshidrogenasa (CPDH), el complejo isocitrato deshidrogensa (IDHC), el complejo αcetoglutarato deshidrogenasa ( -KGC), la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPK) y
la enzima malica citosolica (cME). Tienen un papel importante las siguientes enzimas,
las cuales contribuyen con la formación de otros sustratos y permiten evidenciar los
principales sustratos marcados a partir L-[U-14C]-aspartato, además de la posible
utilización de-este para la sintesisde fosfolipidos y en su minorialasintesis de acidos
grasos. Estas enzimas son: la aspartato amino transferasa (AAT), la malato
deshidrogenasa citosolica(cMDH) y la mitocondrial (mMDH),la fosfoenolpiruvato
Carboxiquinsa(PEP), la piruvatocarboxilasa (PC),la citrato sintasa,la citrato liasa ATP
dependiente(ATPCL).
Fuente: Autor
78
El [U-14C]-malato puede atravesar la membrana interna mitocondrial hasta la matriz
mitocondrial a través del acarreador de malato/α-cetoglutarato. Así, el [U-14C]-malato entra
a hacer parte de los intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxìlicos y da lugar al
isotopomero [U-14C]-oxaloacetato por la malato deshidrogenasa mitocondrial (mMDH).
Otra vía de utilización del malato citosólico es vía enzima málica (cME), la actividad de
esta isoforma es muy activa en los astrocitos (Mckenna etal., 1995; Voegel et al., 1998),
por lo tanto, el [U-14C]-malato también puede ser convertido a [U-14C]-piruvato, donde el
(4-14C) del L-[U-14C]-malato es descarboxilado, dando lugar a 14CO2.
El [U-14C]-piruvato puede tomar tres vías: la conversión a [U-14C]-lactato, la conversión a
[U-14C]-alanina o ser descarboxilado por medio del complejo de la piruvato
deshidrogeranasa (CPDH), donde el carbono (3
14
C) se pierde y se forma-[U-14C]-acetil-
CoA, esta reacción es irreversible y además se ha encontrado que la actividad del CPDH
aumenta después del nacimiento (Cullingford etal.,1994). El [U-14C]-acetil-CoA entra en el
TCA por acción de la citrato sintasa (CS), que también aumenta su actividad, es convertido
a [1,2-14C]-citrato si se combina con oxaloacetato frio (sin marcar), pero si se combina con
[U-14C]-oxaloacetato se puede tener el isotopomero uniformemente marcado [U-14C]citrato. El citrato puede tomar dos vías: continuar en el TCA donde serán descarboxilados
los carbonos (14CO2) a través de los complejos isocitrato deshidrogenasa (IDHC) y αcetoglutarato deshidrogenasa ( -KGC) , o salir al citosol a través de un transportador de
tricarboxilatos y vía ATP-citrato liasa (ATP-CL) ser hidrolizado en [U-14C]-acetil-CoA y
[U-14C]-oxaloacetato. Este [U-14C]-acetilCoA puede ser utilizado para la síntesis de ácidos
grasos o esteroles y sirve como indicador de la lipogénesis.
Por otra parte, es posible que el [U-14C]-piruvato obtenido a partir de L-[U-14C]-malato, se
convierta directamente a oxaloacetato en la mitocondria, a través de una reacción de
fijación de carbono llevada a cabo por la piruvato carboxilasa (PC) enzima especifica de los
astrocitos. A medida que el L-[U-14C]-aspartato pasa a través de los intermediarios
metabólicos, la radioactividad específica va disminuyendo por dilucion, puede haber un
79
intercambio entre los oxácidos y los aminoácidos, donde puede haber escapes de 14C partir
del α -[U-14C]-cetoglutarato que es precursor de [U-14C] -glutamato y [U-14C]- glutamina
(Abe, 2006).
Con base en los resultados obtenidos se evidencia que el L-[U-14C]-aspartato no es un buen
precursor lipogénico y que si se hubiese utilizado por la vía de cME se esperaría un
aumento más acentuado en la lipogénesis, no obstante, si se tiene en cuenta que una
disminución del aspartato citosólico causa un incremento en la oxidación del citrato, se
vería disminuido el aporte de este sustrato como precursor lipogénico (Rafalowska et al.,
1975). No obstante, el [U-14C]-oxaloacetato citológico puede tomar la vía de la
fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPK), producir [U-14C]-fosfoenolpiruvato que sería
precursor del [U14C]-glicerol-3-fosfato utilizado para la síntesis de fosfolípidos y que
explicaría la pequeña contribución del aspartato en la lipogénesis. En el cerebro el 85% de
los fosfolípidos está constituido en gran parte por fosfatilcolina, fosfatidilserina y fosfatidil
etanolamina.
6.2. COMPARACIÓN DE LA UTILIZACIÓN DEL ASPARTATO CON OTROS
SUSTRATOS METABÓLICOS EN CONDICIONES PERINATALES
La comparación evidencia una utilización del aspartato similar a la utilización del acetato
como sustrato oxidativo, que comparado con los demás sustratos, su contribución es muy
baja y estaría destinado principalmente para ayudar a soportar el reservorio de oxalacetato
en la mitocondria vía aspartato aminotransferasa. Por otro lado, la comparación resalta la
baja contribución del aspartato como sustrato lipogénico durante la prelactancia,
posiblemente como ya se explico, por el incremento del TCA causado por la baja
concentración de este sustrato (Rafalowska et al., 1975), y la activación de la vía
gluconeogénica para la síntesis de glicerol-3-fosato necesario para la construcción de
fosfolípidos.
80
6.3. EFECTO SOBRE LA UTILIZACIÓN DE ASPARTATO COMO SUSTRATO
METABÓLICO
EN
PRESENCIA
DE
OTROS
SUSTRATOS
BAJO
CONDICIONES PERINATALES Y DE ADULTO
Al investigar si la variación las concentraciones de glucosa, lactato, NAA tenían un efecto
en la utilización del aspartato en los astrocitos, se encontraron diferencias que se discutirán
de acuerdo a si están en condiciones perinatales o de adulto (Tabla 3 y Figuras 7y8).
6.3.1. Comparación en condiciones perinatales.
6.3.1.1. Efecto de la glucosa.
Se evidenció que la glucosa en concentraciones fisiológicas perinatales (5 mM) influye
sobre la utilización del L-[U-14C]-aspartato significativamente (p<0.05), disminuyendo así
la utilización de este como fuente de carbonos en el TCA. La explicación de este evento es
que están entrando mas carbonos fríos procedentes del piruvato obtenido por vía
glucolítica, que producirían mas acetil-CoA fría y oxalacetato (OAA) frio que el que podría
aportar el aspartato. Estos resultados indican que el incremento de las concentraciones
citosolícas de piruvato estarían modulando la actividad de la enzima málica citosólica
(cME) y que el incremento de las concentraciones de OAA mitocondrial estaría modulando
la actividad de la lanzadera del aspartato/malato. Paralelamente esto se puede corroborar a
partir de estudios que se han realizado con cultivos primarios de astrocitos, en donde se han
utilizado concentraciones de glucosa en el orden de 6 a 7 mM, que las tasas de respiración
celular se ven incrementadas (Hertz et al., 2007).
Esto puede explicarse debido a que la glucosa es uno de los principales sustratos
metabólicos precursores de piruvato mitocondrial. El piruvato es transportado por un
transportador de monocarboxilatos hacia la mitocondria y puede ser utilizado para la
síntesis de uno de los primordiales constituyentes del TCA, el OAA vía piruvato
carboxilasa (E.C 6.4.1.1) expresada exclusivamente en las mitocondrias astrociticas. De
esta forma se puede incrementar el OAA mitocondrial, favoreciéndose la actividad
81
oxidativa del TCA. Como consecuencia, bajo estas condiciones los astrocitos no requieren
de la síntesis metabólica de malato citológico proveniente de la transaminación del
aspartato, vía aspartato aminotransferasa (ASPA). Se puede decir que a estas
concentraciones de glucosa la actividad de ASPA se ve disminuida.
Adicionalmente estos resultados también están reflejando el estado metabólico de los
astrocitos, demostrando así que en presencia de glucosa (5 mM), se incrementan las tasas
de oxidación en estos y por tanto la respiración desde la utilización de aspartato no es muy
relevante en presencia de estas concentraciones de glucosa. Paralelamente esto se puede
corroborar a partir de estudios que se han realizado con cultivos primarios de astrocitos, en
donde se han utilizado concentraciones de glucosa en el orden de 6 a 7 mM, y las tasas de
respiración celular se ven incrementadas (Hertz et al., 2007).
Por otro lado, disminución significativa (p<0,05) en la utilización del L-[U-14C]-aspartato
como sustrato lipogénico en presencia de glucosa (5 mM), corroboran los resultados de
respiración, indicando que efectivamente la vía del citrato no es una ruta lipogénica a partir
del aspartato, sin embargo, la disminución de los lípidos marcados vía glicerol-3-fosfato se
ve influenciada por la contribución al reservorio de este sustrato por vía glucolítica.
6.3.1.2. Efecto del lactato.
Los resultados obtenidos a partir de concentraciones fisiológicas perinatales de lactato (10.5
mM), presentaron una disminución significativa (p<0.05) en la utilización del L-[U-14C]aspartato como sustrato oxidativo y corroboran los resultados obtenidos con glucosa (5
mM) en el sentido que, al verse favorecido un incremento de piruvato se ven reguladas las
vías de la cME y la lanzadera aspartato/malato. En el citosol el lactato es convertido a
piruvato por la acción catalizadora de la lactato deshidrogenasa (E.C1.1.1.27) y de esta
forma el piruvato puede entrar por el transportador MCT1 a la mitocondria (Gladden, 2004;
Schurr, 2006). Adicionalmente, el lactato que es rápidamente absorvido por los astrocitos
82
en estas condiciones puede ser utilizado más rápidamente para la síntesis del OAA vía
piruvato carboxilasa (PC) que el piruvato procedente de la glucosa.
Aun cuando su utilización disminuye notablemente, esta no alcanza a ser nula y se
evidencia que algo de aspartato podría ser utilizado endógenamente. Estos resultados
demuestran que las tasas de oxidación en los astrocitos durante esta etapa de prelactancia
no solo se ven inducidas e incrementadas principalmente por el lactato presente en el
medio, sino que también este es utilizado mayormente como un sustrato directo de energía
y proveedor de esqueletos de carbonos para la síntesis de intermediarios del TCA. El hecho
de que el lactato se acumule en la sangre del feto durante las últimas etapas de gestación y
se consuma rápidamente durante la prelactancia, además de aumentar su permeabilidad en
la barrera hematoencefalica, corrobora lo mencionado anteriormente (Medina et al., 1996).
Por otro lado, el incremento significativo (p<0,05) en la utilización del L-[U-14C]-aspartato
como sustrato lipogénico en presencia de lactato (10.5 mM), señala el incremento de las
necesidades de glicerol-3-fosfato procedentes del aspartato para la síntesis de fosfolípidos,
ya que el lactato estaría siendo utilizado preferentemente para la síntesis de ácidos grasos,
necesarios para la formación de membranas que en este periodo esta incrementado. En los
astrocitos, se ha demostrado que el lactato es uno de los principales precursores de lípidos
durante el periodo neonatal temprano (Tabernero et al., 1993; Medina et al., 1996)
6.3.1.3. Efecto del N-acetilaspartato (NAA).
Los resultados obtenidos a partir de concentraciones fisiológicas perinatales de Nacetilaspartato (NAA) (20 mM), presentaron una disminución significativa (p<0.05) en la
utilización del L-[U-14C]-aspartato como sustrato oxidativo, Estos resultados están
reflejando una alta actividad de la aspartoacilasa II (ASPA) que hidroliza el NAA
citológico a aspartato y acetato, incrementando así los reservorios de aspartato y acetato
frio en el citosol. Este incremento de aspartato refleja que el NAA induce la activación de
esta enzima, adicionalmente, el aspartato producido a partir de NAA (20 mM) es mucho
83
mayor al aspartato marcado utilizado en las incubaciones (0,5 mM). El aspartato frio
proveniente de la hidrólisis de NAA es transaminado por la aspartato aminotransferasa,
citosolica (ATT) formando así OAA frio que daría más malato frio que entraría al TCA
produciendo CO2 sin marcar.
Por otra parte, en presencia de NAA (20 mM),se evidencia una disminución significativa
(p<0,05) en la utilización del L-[U-14C]-aspartato como sustrato lipogénico. Esto esta
reflejando un efecto similar al encontrado con los resultados de respiración, en donde se ve
reflejada actividad de la aspartoacilasa II (ASPA) que estaría causando un incremento del
reservorio de OAA frio y de acetil-CoA, generando una disminución en la disponibilidad de
[U-14C]-glicerol-3-fosfato para la síntesis de fosfolípidos.
6.3.2. Comparación en condiciones adulto.
6.3.2.1. Efecto de la glucosa.
Los resultados obtenidos para respiración reflejan que a concentraciones de glucosa en
condiciones fisiológicas de adulto (2 mM) no tienen ningún efecto en cuanto la utilización
del L-[U-14C]-aspartato como sustrato oxidativo (Tabla 3, Figura 7 y Figura9). Esto sugiere
que en estas condiciones, la síntesis de piruvato no es suficiente para mantener el reservorio
de OAA por medio de la piruvato carboxilasa (PC), demostrándose que efectivamente la
actividad de esta enzima está condicionada por el suplemento de piruvato. Por lo tanto, se
activa la lanzadera aspartato/malato que contribuye a suplementar el reservorio de OAA en
la mitocondria que se ve favorecida en el adulto. Igualmente, refleja la necesidad del apoyo
del lactato para el mantenimiento del reservorio de OAA.
Por otro lado, el incremento significativo (p<0,05) en la utilización del L-[U-14C]-aspartato
como sustrato lipogénico en presencia de glucosa (2 mM), refleja un incremento de la
actividad de la aspartato aminotrasferasa citosólica que incrementaría el reservorio de [U14
C]-oxaloacetato que, como ya se ha sostenido, sería un precursor de [U-14C]-glicerol-3-
fosfato, sin embargo, los astrocitos en condiciones de adulto no tienen incrementada su
84
necesidad de síntesis de fosfolípidos, este resultado puede estar indicando que en estas
condiciones se activa la cME que favorecería la síntesis de ácidos grasos.
6.3.2.2. Efecto del lactato.
Los resultados obtenidos para respiración reflejan que a concentraciones de lactato en
condiciones fisiológicas de adulto (5 mM) influyo significativamente (p<0,05) causando
una disminución en cuanto la utilización del L-[U-14C]-aspartato como sustrato oxidativo.
Este resultado evidencia la importancia del lactato no solo a en condiciones fisiológicas de
adulto, sino también, en condiciones fisiológicas perinatales como un sustrato clave para
mantener los reservorios de OAA, necesarios para el TCA. Lo que demuestra es que a estas
concentraciones de adulto, el lactato sigue siendo un buen precursor de piruvato y como
consecuencia la síntesis de OAA no se ve disminuida como para utilizar otros sustratos
como el aspartato para la formación de este.
Igualmente, los resultados indican que la presencia de lactato influyo significativamente
(p<0,05) causando un incremento en cuanto la utilización del L-[U-14C]-aspartato como
sustrato lipogénico indicando que en estas condiciones, se activa la cME, que favorecería la
síntesis [U-14C]-acetil-CoA como precursor de ácidos grasos y se ve limitada la actividad
de la lanzadera aspartato/malato.
6.3.2.3. Efecto del N-acetilaspartato (NAA).
El NAA en concentraciones de (10 mM) influyo significativamente (p<0,05) causando una
disminución en cuanto la utilización del L-[U-14C]-aspartato como sustrato oxidativo. Sin
embargo, los resultados evidencian que a estas concentraciones se activa la lanzadera
aspartato/malato permitiendo que entre más L-[U-14C]-malato para suplir las necesidades
de OAA mitocondrial.
En cuanto al efecto del NAA en concentraciones de (10 mM) influyo significativamente
(p<0,05) causando una disminución en cuanto la utilización del L-[U-14C]-aspartato como
85
sustrato lipogénico. Estos resultados reflejan la actividad de la aspartoacilasa II (ASPA)
que causa un incremento del reservorio de OAA frio y por lo tanto de malato frio.
6.4. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA ASPARTOACILASA (ASPA) EN
CULTIVOS
PRIMARIOS
DE
ASTROCITOS
EN
PRESENCIA
DE
SUSTRATOS METABÓLICOS EN CONDICIONES PERINATALES Y DE
ADULTO
En el sistema nervioso central, la enzima encargada de catalizar la deacetilación de NAA es
la aspartoacilasa II (ASPA; E.C.3.5.1.15), produciendo acetato y aspartato. Estudios
previos han demostrado que la actividad de esta enzima se incrementa en el cerebro de ratas
durante el desarrollo postnatal en cultivos primarios de astrocitos (Bhakoo, 2001). Los
resultados obtenidos (Tabla4 y Figura11) demuestran no solo la presencia de esta enzima
en los astrocitos, sino que también fue posible determinar el efecto sobre su actividad con
variaciones en las concentraciones de glucosa, lactato y NAA en condiciones perinatales y
de adulto.
6.4.1. Modificaciones al protocolo de referencia.
En los resultados obtenidos a partir del ensayo enzimático se tomo como valor de referencia
el NAA (2 mM), principalmente porque esta concentración fue reportada anteriormente por
Bhakoo et al., 2001 quienes determinaron la actividad de la aspartoacilasa II (ASPA) en
cultivos de astrocitos tipo I y astrocitos tipo II, adicionalmente, también reporta la
diferencia en la actividad enzimática en astrocitos tipo I reportando un máximo de actividad
a los 14 días de incubación in vitro. El protocolo se adapto para determinar la actividad
enzimática con algunas diferencias: primero para la determinación de proteína se empleo el
método de Bradford a diferencia del método de Lowry empleado por Bhakoo et al., 2001,
porque es un método que se puede utilizar para trabajar concentraciones de proteínas entre
de 10-100μg (Bradford, 1976) (figura10); en segundo lugar Bhakoo et al.2001 realizo los
cultivos de astrocitos tipo I y tipo II respectivamente a partir de astrocitos corticales de
ratas adultas, mientras que los cultivos de astrocitos realizados para este trabajo, provienen
86
de neonatos de ratas de 1dia de vida posnatal y por último, los resultados sobre la actividad
enzimática, según Bhakoo et al., 2001, están reportados a partir de cultivos de astrocitos
tipo I (0.643 ± 0.172, nmol de aspartato/min/mg proteína) y astrocitos tipo II (2.832 ±
0.785, nmol de aspartato/min/mg proteína) (tabla4) los cuales, en suma dan un actividad de
3.475 de nmol de aspartato/min/mg proteína, en este trabajo, se realizaron cocultivos de
astrocitos (mezcla de astrocitos tipo I y II) el cual muestra una actividad específica de 3.111
± 0.151 de nmol de aspartato/min/mg proteína en presencia de NAA (2 mM). Este ultimo
resultado es comparable con la suma de las actividades específicas reportadas por Bhakoo
et al., 2001 e indican que se hizo una buena adaptación del protocolo reportado.
6.4.2. Control de células y medio de cultivo.
Para el experimento se realizo una curva de calibración de NADH a partir de una solución
de concentración inicial de 1.5 mM (figura12), con el fin de tener una curva de referencia.
Por otra parte los resultados obtenidos con el control de células indican en el homogenado
de los astrocitos hay una alta concentración de oxalacetato (OAA) que consumió el NADH
rápidamente cuando se le adiciono la malato deshidrogenasa (MDH), por lo tanto, las
reservas de OAA disponibles en los astrocitos esta incrementada después de dos horas de
incubación lo que refleja una alta actividad de la aspartato aminotransferasa (ATT).
Posteriormente, cuando se hizo la incubación final con ATT los resultados indican que
efectivamente había una baja concentración de aspartato libre. Los resultados iníciales y
finales de absorbancia para el medio de cultivo reflejan lo mismo, una alta concentración de
oxalacetato en la primera incubación y una baja concentración de aspartato en la incubación
final.
6.4.3. Comparación de las variaciones de concentración del NAA y Aspartato.
El NAA por ser el sustrato específico para la aspartoacilasa II (ASPA) aparentemente no
tiene una función reguladora sobre esta y por lo tanto la variación de la concentración de
éste sustrato no influye sobre su actividad específica. Comparando las tres concentraciones
empleadas para NAA (2, 10 y 20 mM) se evidencio que la actividad específica de la
87
aspartoacilasa II no varió significativamente (p<0.05). Los valores iníciales de absorbancia
de la incubación inicial para cada una de estas soluciones sugieren una baja concentración
de OAA y la incubación final demuestra una alta concentración de aspartato tanto en
condiciones perinatales (20 mM) como en adulto (10 mM). Estos resultados evidencian que
hay una diferencia en el tamaño de los reservorios de OAA y aspartato en los astrocitos. No
se puede asumir que una alta concentración de aspartato produzca una alta concentración de
OAA ya que este proceso depende la actividad de ATT. Adicionalmente, cuando se incluyo
aspartato (O,5 mM) tampoco se evidencio una variación significativa en la concentración
de aspartato ni en la actividad de la enzima. Los resultados indican que no hay efecto sobre
la actividad de la enzima cuando se tienen variaciones de la concentración de NAA en
condiciones perinatales y en adulto.
6.4.4. Comparación de las variaciones de concentración de la glucosa.
Los resultados señalan que a concentraciones de adulto de glucosa (2 mM) no hay un efecto
significativo (p<0,05) sobre la actividad de la enzima. Sin embargo, cuando las
concentraciones de glucosa se ven incrementadas como en el periodo perinatal (5 mM) la
actividad de la enzima si se ve afectada significativamente. Estos resultados indican que la
concentración de glucosa si afecta la actividad de la enzima, y que en concentraciones
perinatales de glucosa se ve inhibida la absorción del NAA por los astrocitos para favorecer
la utilización del NAA por los oligodendrocitos como sustrato lipogénico.
6.4.5. Comparación de las variaciones de concentración de lactato.
El efecto sobre la actividad enzimática en presencia de lactato en concentraciones
perinatales (10.5 mM) y lactato adulto (5mM) es muy similar a las encontradas con glusosa
5 mM. Las concentraciones de lactato inhiben significativamente (p<0.05) la actividad de la
enzima. Estos resultados indican que si los reservorios de lactato son grandes no existe la
necesidad por los astrocitos de suplementar el reservorio de OAA mitocondrial critico en
estos dos estados del desarrollo.
88
Adicionalmente, durante el periodo de prelactancia la demanda energética y oxidación de
sustratos en los astrocitos se evidencia que es mucho mayor , razón por la cual las células se
ven en la necesidad de estar sintetizando intermediarios que sirvan de precursores de otros
sustratos para abastecer sus requerimientos metabólicos y el de otras células como las
neuronas..Esto mismo puede ser corroborado por los resultados obtenidos, ya que se
evidencio que a estas concentraciones de glucosa se promueve la utilización de aspartato en
los astrocitos para lograr mantener la respiración.
89
7. CONCLUSIONES
Se demostró que los astrocitos en condiciones perinatales también pueden utilizar el
aspartato como un sustrato metabólico alternativo. Sin embargo, su utilización en estas
células está orientada principalmente para mantener la continuidad del ciclo de los ácidos
tricarboxilicos (TCA) y a su vez la síntesis de intermediarios metabólicos. Mientras que su
utilización para la síntesis de lípidos no es muy relevante y su contribución puede estar
relacionada con la síntesis de glicerol-3-fosfato, constituyente principal de fosfolípidos.
En los astrocitos la utilización de aspartato se ve condicionada por la presencia de otros
sustratos metabólicos y la concentración de estos en el medio. La actividad metabólica y la
demanda energética puede ser modificada por la presencia de sustratos metabólicos como la
glucosa, el lactato y el NAA tanto en condiciones perinatales como de adulto.
Se pudo corroborar la presencia en los astrocitos de la enzima aspartoacilasa II (ASPA),
demostrándose que durante el periodo de prelactancia la actividad de esta enzima es alta.
Adicionalmente, la actividad enzimática puede variar en presencia de otros sustratos como
el NAA, glucosa, lactato y aspartato, dependiendo de las condiciones si son perinatales o de
adulto. La mayor actividad se reporto en presencia de NAA aun cuando este sustrato es
especifico para esta enzima, la variación de su concentración no influye significativamente
(p<0.05) sobre la actividad de ASPA. Adicionalmente, la actividad de la enzima no es
afectada por concentraciones perinatales de aspartato (0.5 mM). Sin embargo, la actividad
de la enzima si está siendo regulada por las concentraciones perinatales de glucosa (5 mM)
y lactato (10,5 mM) y por las concentraciones de lactato (5 mM)
fisiológicas de adulto.
90
en condiciones
8. RECOMENDACIONES
Con el fin de profundizar un poco más sobre el metabolismo del aspartato y su utilización
en los astrocitos deberían ser realizados otros estudios complemenatarios enfocados
principalmente a la utilización del N-acetilaspartato (NAA) como sustrato oxidativo y
lipogénico específicamente durante la prelactancia, ya que este sustrato es una de las
principales fuentes de aspartato y la disponibilidad de NAA también determina la
concentración de aspartato en las células.
Con respecto al ensayo enzimático realizado en este estudio también se podría analizar en
conjunto la actividad de la aspartato aminotransferasa (ATT), ya que de la actividad de esta
enzima depende la formación de oxaloacetato desde aspartato y de esta forma se podría
evidenciar como el aspartato podría estar regulando la actividad de esta y a su vez la
formación de unos de los principales constituyente del ciclo de los acidos tricarboxilicos
(TCA).
Por otra parte, otra fuente principal de aspartato es el aminoácido asparagina y la enzima
enrcargada de su hidrólisis es la L-asparginasa (ASP; L-asparaginasa-amidohidrolasa). La
hidrólisis de este aminoácido forma aspartato y ión amonio. Teniendo en cuenta que la
isoforma de esta enzima denominada GLIAP ya ha sido reportada anteriormente en cerebro
de ratas principalmente en el citosol de los astrocitos, se podría profundizar sobre su
actividad y la síntesis de aspartato enfocándose primordialmente en el periodo de
prelactancia y así determinar qué papel tiene esta enzima y de qué forma se ve regulada
durante esta etapa en los neonatos.
91
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