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PRÁCTICAS DE LABORATORIO CURSO DE BIOQUÍMICA SEGUNDO AÑO Lic. José Manuel Arriaga UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA CENTRO UNIVERSITARIO DE OCCIDENTE DIVISIÓN DE CIENCIAS DE LA SALUD CARRERA DE MÉDICO Y CIRUJANO PRÁCTICA 9 Perfil Lipídico I. INTRODUCCIÓN En esta práctica se realizarán las determinaciones de colesterol (Col), colesterol HDL y de triacilgliceroles (TAG) mediante métodos enzimáticos colorimétricos y la comparación con un patrón de concentración conocida. La formación de un sustrato coloreado permite medir su absorbancia, que es directamente proporcional a la concentración de reactivo. Finalmente se discutirá la importancia de dichas determinaciones en la Bioquímica Clínica, puesto que muchas enfermedades metabólicas cursan con alternaciones en los niveles plasmáticos de TAG y/o Col. II. FUNDAMENTO TEORICO a) Los triacilgliceroles, el colesterol y las lipoproteínas plasmáticas Los triacilgliceroles (TAG) constituyen la primera reserva energética del organismo; se almacenan en grandes vacuolas en los adipocitos del tejido adiposo. La degradación metabólica de 1 g de TAG produce 9 kcal, mientras que 1 g de Glc sólo suministra 4 kcal; además, el depósito de TAG no está hidratado (a diferencia del glucógeno) y no ejerce presión osmótica. Esta reserva energética se puede emplear para generar energía química en forma de ATP, o bien para generar calor, como es el caso del tejido adiposo pardo. Por otra parte, el tejido adiposo también tiene una función de aislante térmico y de protección mecánica, como sucede en los riñones. A su vez, el colesterol desempaña muchas funciones biológicas, como dar fluidez a las membranas biológicas y ser el precursor de ácidos biliares, hormonas esteroideas y de la vitamina D. El metabolismo del colesterol está relacionado con enfermedades cardiovasculares ( E C V ) y con la aparición de cálculos biliares. Debido al carácter hidrofóbico de estos compuestos, no se encuentran libres en plasma sanguíneo, sino que son transportados por las proteínas. Existen diversas clases de lipoproteínas, clasificadas en base a su densidad, el lípido que transportan y las apoproteínas que conforman su estructura. En las tablas de abajo se muestran la clasificación, función y composición de las lipoproteínas: Distribución y Función de las Principales Apoproteínas Distribución Función HDL, Qn Estructural, activa de la lecitina-colesterol-acil-transferasa (LCAT) HDL, Qn Estructural, activa de la lipasa lipoprotéica-1 (LPL1) HDL, Qn Activa LCAT VLDL, IDL, LDL Estructural, ligando para R Qn, Qr Estructural HDL, Qn Activa LCAT HDL, Qn Activa LPL1 HDL, Qn Inhibe LPL1 VLDL, IDL, LDL Transporte de lípidos Qn, Qr Ligando para R Apoproteína AI AII AIV B-100 B-48 CI CII CIII D E Composición química de las lipoproteínas (expresada en %) Lipoproteina Apoproteinas (APO) % APO Quilomicrones VLDL IDL LDL HDL 2 20 20 25 50 AI,AII,AIV,B-48,C,E B-100,C,E B-100,C,E B-100 AI,AII,AIV,C,D,E Total 98 90 80 75 50 Lípidos Colesterol TAG 4 18 35 60 36 90 62 35 10 14 Fosfolípidos 6 20 30 30 50 b) El perfil lipídico El estudio clínico del perfil lipídico es un procedimiento analítico básico en el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de enfermedades metabólicas. Generalmente se solicita el análisis del los niveles de TAG, Col-total y Col-HDL. Los niveles de Col-LDL se calculan mediante la Fórmula de Friedewald. Los valores de referencia son los siguientes: 150–200 mg/dL (1.7–2.29 mM) Riesgo promedio (requiere tratamiento) COLESTEROL TOTAL < 200 mg/dL (5.2 mM) Concentración deseable Bajo riesgo de E C V 200–240 (5.2–6.2 mM) Niveles ligeramente elevados Riesgo moderado de ECV > 200 mg/dL (2.29 mM) Niveles elevados [> 875 mg/dL (10 mM) riesgo de pancreatitis] > 240 mg/dL (6.2 mM) Niveles elevados Alto riesgo de E C V TRIACILGLICEROLES < 150 mg/dL (1.7 mM) Concentración deseable 1. COLESTEROL HDL < 40 mg/dL (1 mM) Niveles bajos Alto riesgo de E C V COLESTEROL LDL 40-60 mg/dL (1-1.6 mM) Riesgo promedio de ECV 100–160 mg/dL (2.6–4.1 mM) Niveles ligeramente elevados Riesgo promedio de E C V > 60mg/dL (1.6 mM) Niveles altos Riesgo bajo Factor protector contra ECV > 160 mg/dL (4.1 mM) Niveles altos Elevado riesgo de E C V < 100 mg/dL (2.6 mM) Niveles óptimos Colesterol HDL (CHO-HDL) y Colesterol LDL (CHO-LDL) Los niveles de Col-total < 100 mg/dL (2.6 mM) se relacionan con estados patológicos, como la malnutrición, una enfermedad hepática ó cáncer. Al determinar el Col-total y el Col-HDL se puede hallar el valor de su cociente, que también se relaciona con el riesgo a de desarrollar una enfermedad cardiovascular: i. Cociente óptimo si Col-total/Col-HDL ≈ 3.5 ii. Cociente deseable si Col-T/Col-HDL < 5 iii. Alto riesgo de ECV si Col-T/Col-HDL > 5 Dentro de los niveles de Col-LDL se pueden fijar unos valores deseables en base a la propensión a desarrollar E C V : i. < 100 mg/dL (1.14 mM) si se padece enfermedad cardiaca ó diabetes ii. < 130 mg/dL (1.5 mM) si existen 2 factores de riesgo iii. < 160 mg/dL (1.8 mM) si existe 1 factor de riesgo Los factores de riesgo son los edad, hipertensión, bajos niveles de CHO-HDL, ser fumador y tener antecedentes de enfermedad cardiaca. III. DETERMINACIÓN COLORIMÉTRICA DE TRIACILGLICEROLES Y COLESTEROL Se utilizan métodos enzimáticos específicos y sensibles, que se basan en la formación de peróxido de hidrógeno. Esta reacción se acopla con una reacción redox catalizada por una peroxidasa, de modo que se produce un sustrato coloreado. El sustrato coloreado presenta un máximo de absorbancia a 500 nm. Aplicando la ley de Beer-Lambert, y teniendo en cuenta que la intensidad del color desarrollado es directamente proporcional a la concentración de sustrato inicial, es posible determinar la concentración inicial de triacilgliceroles o de colesterol en la muestra. Para ello es necesario determinar la absorbancia de una solución patrón (ó estandar), o bien realizar una recta patrón con diferentes concentraciones. Para que las determinaciones de los componentes lipídicos del plasma, o suero, tengan valor clínico, deben realizarse bajo las siguientes condiciones consideradas óptimas: a) La muestra de sangre ha sido extraída luego de un ayuno de 14 a 16 horas b) El paciente no ha variado sus hábitos alimenticios en las últimas tres semanas c) Su peso corporal es estable d) No haber consumido alcohol en las setenta y dos horas previas a la extracción de sangre El ayuno apropiado, el cual consiste en no ingerir ningún alimento desde la cena hasta el momento de la extracción de sangre, es importante en las determinaciones de triacilgliceroles. La ingesta de agua y café negro no endulzado no afecta los resultados. Dado que los niveles de triacilgliceroles se elevan dentro de las dos primeras horas post absorción y alcanzan un máximo entre las cuatro y seis horas, las muestras tomadas sin haber respetado el ayuno no son apropiadas para el análisis; debido a que no se podrá diferenciar entre hipertrigliceridemia post absorción y la secundaria a algún trastorno en el metabolismo de los lípidos, o la debida a errores congénitos del metabolismo. Aunque el ayuno puede influir en los niveles de colesterol en un pequeño porcentaje de individuos, no es tan importante para las mediciones de colesterol y fosfolípidos; aunque sí recomendable. Por otro lado, es importante tomar en cuenta que hay ciertos factores relacionados con hipertrigliceridemia que interfieren con las determinaciones colorimétricas de muchos metabolitos, incluso con las fracciones lipoprotéicas: a) Hipertrigliceridemia mayor a 2000 mg/dl b) Aunque transitorias, el consumo de alcohol provoca elevaciones agudas de triacilgliceroles 1. Determinación de triacilgliceroles Muchos de los métodos actuales para la medición de triglicéridos emplean comúnmente el acoplamiento de enzimas en cuatro reacciones básicas. a) Rompimiento de los triacilgliceroles por la enzima lipasa: Lipasa 𝑇𝑇𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟 → 𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔 + á𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔 b) Fosforilación del glicerol, en reacción catalizada por la enzima glicerol cinasa: 𝐺𝐺𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙 + ATP Glicerol cinasa → 𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔 − 3 − 𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓 + 𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 c) Oxidación del glicerol-3-fosfato por la enzima glicerol fosfato oxidasa para formar dihidrociacetona fosfato y peróxido de hidrógeno: 𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺 − 3 − 𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓 + O₂ Glicerol fosfato oxidasa → 𝑑𝑑𝑑𝑑ℎ𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖 + 𝐻𝐻₂𝑂𝑂₂ d) Oxidación del peróxido de hidrógeno, por catálisis de la enzima peroxidasa, a un radical libre de oxígeno, el cual oxida a un cromógeno reducido para producir un compuesto coloreado: Peroxidasa 𝐻𝐻₂𝑂𝑂₂ + cromógeno reducido → 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐ó𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔 𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜 + 𝐻𝐻₂𝑂𝑂 La absorbancia, en el rango visible, del compuesto coloreado depende del cromógeno utilizado en la reacción. 2. Determinación de colesterol total La determinación del colesterol total incluye las formas libres y esterificadas del lípido. Los métodos enzimáticos para el colesterol se desarrollan en tres etapas. a) Hidrólisis de los ésteres de colesterol por la enzima colesterol esterasa, produciendo colesterol libre y ácidos grasos libres: É𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠 𝑑𝑑𝑑𝑑 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 Colesterol esterasa → 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 + á𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔 b) Oxidación del colesterol libre por la enzima colesterol oxidasa, en presencia del oxígeno, a colestat-4-en-3-ona (colestenona) y peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ): Colesterol Colesterol oxidasa → 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 − 4 − 𝑒𝑒𝑒𝑒 − 3 − 𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜 + 𝐻𝐻₂𝑂𝑂₂ c) Oxidación del peróxido de hidrógeno por la enzima peroxidasa, para producir un radical de oxígeno que oxida un cromógeno reducido (4-aminofenazona), en presencia de un compuesto fenólico, a su forma oxidada (quinoneimina): 𝐻𝐻₂𝑂𝑂₂ + 4 − 𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎 + 𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓𝑓 Peroxidasa → 𝑞𝑞𝑞𝑞𝑞𝑞𝑞𝑞𝑞𝑞𝑞𝑞𝑞𝑞𝑞𝑞𝑞𝑞𝑞𝑞𝑞𝑞𝑞𝑞 + 𝐻𝐻₂𝑂𝑂 La quinoneimina cual es un compuesto coloreado que tiene un pico de absorción a 500 nm y es medido espectrofotométricamente. La intensidad del color formado es directamente proporcional a la concentración de colesterol en la muestra; es decir que a mayor intensidad de color mayor concentración de colesterol. 3. Determinación de colesterol HDL Se utiliza el ácido fosfotúngstico y MgCl 2 para precipitar las LDL y las VLDL, de manera que las HDL son las únicas lipoproteínas que permanecen en solución. Posteriomente, se determinan los niveles de CHO en el sobrenadante tal y como se ha indicado anteriormente. 4. Determinación de colesterol LDL Para calcular el colesterol LDL se utiliza la Fórmula de Friedewald, expresada como sigue: Col − LDL = 𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶 𝑇𝑇 − 𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶 𝐻𝐻𝐻𝐻𝐻𝐻 − 𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇 5 En la fórmula, TAG/5 (triacilgliceroles ÷ 5) corresponde a la concentración de VLDL, y solamente es útil cuando la concentración de TAG es menor a 400 mg/dl (< mM). IV. MATERIALES Y REACTIVOS 1. Solución patrón de colesterol (Col-STD) de concentración 200 mg/dL (5.2 mM) 2. Solución patrón de triacilgliceroles (TAG-STD) de concentración 200 mg/dL (2.29 mM) 3. Reactivo para la determinación de colesterol total 4. Reactivo para la determinación de triacilgliceroles 5. Solución de sulfato de dextrán y Mg++ (reactivo precipitante de Col-VLDL y Col-LDL) 6. Tubos de ensayo 7. Gradillas 8. Pipetas semiautomáticas para la medición de volúmenes de 10 µl y 100 µl 9. Espectrofotómetro 10. Sueros problema III. PROCEDIMIENTO PRÁCTICO Para realizar esta práctica, las determinaciones se realizarán con reactivos comerciales y se emplearán sueros con valores normales y sueros alterados, donde los valores de triacilgliceroles y colesterol son patológicos. 1. Triacilgliceroles a) Rotular sendos tubos como B (blanco), St (patrón) y M b) Agregar a cada tubo 1 ml de reactivo de triacilgliceroles c) Al tubo St agregarle 10 µl de solución patrón de triacilgliceroles d) Al M agregarle 10 µl de muestra e) Mezclar suavemente los tubos y dejar en reposo 20 minutos a temperatura ambiente f) Leer la absorbancia del contenido de los tubos St, M a 546 nm, poniendo el fotómetro en cero de absorbancia con el blanco de reactivos (B) g) Anotar las absorbancias respectivas como Ast para el patrón, Am h) Realizar los cálculos de concetración de triacilgliceroles con la fórmula siguiente: 𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇 (𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇) = i) 𝐴𝐴mx 𝑋𝑋 200 𝑚𝑚𝑚𝑚/𝑑𝑑𝑑𝑑 𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 Donde Amx es la absorbancia de la muestra y ASt es la absorbancia del patrón. Registrar los resultados 2. Colesterol total a) Rotular sendos tubos como B (blanco), St (patrón) y M b) Agregar a cada tubo 1 ml de reactivo de colesterol c) Al tubo P agregarle 10 µl de solución patrón de colesterol d) Al M agregarle 10 µl de muestra e) Mezclar suavemente los tubos y dejar en reposo 20 minutos a temperatura ambiente f) Leer la absorbancia del contenido de los tubos St y M 546 nm, poniendo el fotómetro en cero de absorbancia con el blanco de reactivos (B) g) Anotar las absorbancias respectivas como ASt para el patrón y Am h) Realizar los cálculos de concentración de colesterol con la fórmula siguiente: 𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶 𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡 (𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶 𝑇𝑇) = i) 𝐴𝐴mx 𝑋𝑋 200 𝑚𝑚𝑚𝑚/𝑑𝑑𝑑𝑑 𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 Donde Amx es la absorbancia de la muestra y ASt es la absorbancia del patrón. Registrar los resultados 3. Colesterol HDL (Wiener Lab) a. Separación por precipitación del Colesterol-HDL de Colesterol-VLDL Y Colesterol-LDL a) Rotular un tubo P-HDL b) Agregar al tubo 500 µl de suero c) Agregar 50 µl de reactivo precipitante d) Dejar en reposo por 15 minutos en agua de hielo a 2°C-10°C (30-40 minutos si es en refrigeradora) e) Centrifugar por 10 minutos a 3500 rpm b. Determinación de Colesterol-HDL a) Rotular tres tubos como B (blanco), St (patrón) y M-HDL b) Agregar a cada tubo 1 ml de reactivo de colesterol c) Al tubo St agregarle 10 µl de solución patrón de colesterol d) Al tubos M-HDL agregarle 50 µl de sobrenadante del tubo P-HDL e) Mezclar suavemente los tubos y dejar en reposo 20 minutos a temperatura ambiente f) Leer la absorbancia del contenido de los tubos St y M-HDL a 546 nm, poniendo el fotómetro en cero de absorbancia con el blanco de reactivos (B) g) Anotar las absorbancias respectivas como ASt para el patrón y Am h) Realizar los cálculos de concentración de colesterol con la fórmula siguiente: 𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶 𝐻𝐻𝐻𝐻𝐻𝐻 (𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶 𝐻𝐻𝐻𝐻𝐻𝐻) = i) 4. Donde Amx es la absorbancia de la muestra y ASt es la absorbancia del patrón. Registrar el resultado Colesterol VLDL a) Calcular la concentración de colesterol VLDL dividiendo la concentración triacilgliceroles entre 5: b) Registrar el resultado 5. 𝐴𝐴mx 𝑋𝑋 45.74 𝑚𝑚𝑚𝑚/𝑑𝑑𝑑𝑑 𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶 𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉 (𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶 𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉) = Colesterol LDL a) Calcular la concentración de colesterol LDL utilizando la fórmula de Friedewal: b) Registrar el resultado 𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶 𝐿𝐿𝐷𝐷𝐷𝐷 (𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶 𝐿𝐿𝐿𝐿𝐿𝐿) = 𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶 𝑇𝑇 − 𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶 𝐻𝐻𝐻𝐻𝐻𝐻 − 𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶 𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉 IV. RESULTADOS 1. 𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇 5 Registrar las absorbancias obtenidas en el siguiente cuadro: Absorbancias TAG Col T Col HDL Patrón (St) Muestra 1 (M1) 2. 3. Realizar cada uno de los cálculos correspondientes para determinar las concentraciones de las fracciones lipídicas (dejar constancia de ello) Registrar las concentraciones de cada una de las fracciones en el cuadro siguiente: TAG Concentración (mg/dl) Col T Col HDL Col VLDL Col LDL Muestra V. DISCUSIÓN DE RESULTADOS 1. Compare los resultados obtenidos en su sección con los valores de referencia establecidos, ¿están dentro o fuera de los valores de referencia? 2. ¿Qué riesgos presenta cada uno de los pacientes? 3. En estos casos, ¿es válida la aplicación de la fórmula de Friedewald para el cálculo del colesterol LDL? VI. CUESTIONARIO 1. ¿Cuál es la función de la lipasa pancreática y de la colipasa? 2. ¿Cuáles son las principales lipoproteínas? ¿Cómo se clasifican, en qué características difieren entre sí y cuáles son sus principales funciones? 3. Indique la localización tisular, función y regulación la actividad de la lipoproteínlipasa 4. Indique la localización tisular, función y regulación de la actividad de la enzima Lecitinacolesterol aciltransferasa (LCAT) 5. Indique cuáles son los mecanismos involucrados en la captación de lípidos mediada por receptor a partir de las lipoproteínas 6. Señale las características del receptor de LDL (localización, ligandos, función) 7. ¿Cuáles son las diferencias entre el quilomicrón naciente, el maduro y el remanente? 8. ¿Qué se entiende por transporte reverso de colesterol? 9. Haga revisión de la correlación clínicopatológica de cada una de las clases de lipoproteínas VII. REFERECIAS Anderson, S. C. (2003). Clinical Chemistry. Concepts and Applications (First ed.). New York, New York, United States of America: The McGraw-Hill Companies, Inc. Bishop, M., Fody, E., & Schoeff, L. (2007). Química Clínica. Principios, Procedimientos y correlaciones (Quinta ed.). (C. A. Francisco Sánchez Fragoso, Trad.) Ciudad de México, México, México: McGraw Hill Interamericana. Recuperado el 20 de Julio de 2015