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Vetmadrid 2015- XXXII Congreso Anual de AMVAC – Sistema hemolinfático, inmunología y enfermedades infecciosas
SEVERA HEMOFILIA B EN UN FILA BRASILEÑO CAUSADA
POR UNA DELECCIÓN EN EL GEN DEL FIX QUE INCLUYE
EXÓN 4 Y SECUENCIAS INTRÓNICAS ADYACENTES
Alcaraz Rodríguez, P.1, Kehl, A.1, Mueller, E.1, Mischke, R.2
1LABOKLIN
GmbH & CO. KG. Steubenstraße 4, 97688, Bad Kissingen, Germany
2Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Hannover, Germany
Objetivo
El objetivo de este estudio fue identificar la mutación responsable de
hemofilia B en un perro fila brasileño mediante el análisis del gen que
codifica el factor IX de la coagulación (FIX).
La comparación de la secuencias intrónicas adyacentes al exón 4 del gen
del FIX con el wild type permitió identificar una deleción de 3761 pares de
bases. La deleción fue localiza desde el nucleótido 10190 al nucleótido
13950 del gen que codifica para el FIX, englobando exón 4, 601 pares de
bases del intrón 3 así como 3046 pares de bases del intrón 4 (ver figura 2).
Intrón4
Intrón 3
Base 10189 Base 13951
Material y métodos
El estudio incluyó ADN genómico procedente de un perro fila brasileño
macho de 3 meses de edad (tabla 1) diagnosticado con una forma severa
de hemofilia B en el Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine
Hannover.
Tabla 1: síntomas y hallazgos laboratoriales relevantes en un perro macho
con hemofilia B
Síntomas
Hallazgos laboratoriales
relevantes1
Debilidad
Hematoma tras inyección subcutánea
Hemorragias espontáneas
Edema en extremidades posteriores
Líquido en cavidad torácia
Pápulas generalizadas
1=
aPTT prolongado: 56,4s
Actividad FIX reducida: 1%
Discursion
valores de referencia: aPTT<13,5 s; FIX: 75-140%
Para identificar la mutación genética responsable de esta deficiencia en la
actividad del FIX se analizó, mediante PCR, electroforesis y secuenciación,
la región codificadora del gen del FIX, así como las secuencias intrónicas
adyacentes al exón 4. Las secuencias obtenidas fueron comparadas con el
wild type (NM_001003323.2).
Adicionalmente ADN genómico obtenido de tres filas brasileños sanos y de
10 perros sanos elegidos al azar fue analizado como control.
Resultados
Los productos de PCR obtenidos tras la amplificación de cada uno de los
exones que codifican para el FIX en el fila brasileño mostraron el tamaño
esperado, salvo en el caso del exón 4 en donde no se observó ninguna
banda tras su análisis en electroforesis en gel de agarosa (ver figura 1 A).
M
A.
FB
C
Figura 2: resultados de la secuenciación del
exón 4 y regiones intrónicas adyacentes del
gen del FIX en un fila brasileño con hemofilia B
M
C
FB
C
B.
Resultados del análisis de la región codificadora y las regiones intrónicas
adyacentes al exón 4 del gen del FIX en el fila brasileño con una forma
severa de hemofilia B, reveló una c.10190-13950del en el exón 4 y parte de
las regiones intrónicas adyacentes. Deleciones en el gen que codifica para
el FIX representan aproximadamente el 50% de las mutaciones
identificadas como responsables de hemofilia B en perro, siendo, en
humanos, el segundo tipo de mutación más común. En humanos, una
deleción del exón 4 y regiones intrónicas adyacentes ha sido descrita
previamente como responsable de una forma severa de hemofilia B (Hsu et
al. 2007). Exón 4 codifica para el dominio EGF de la proteína del FIX
(Evans et al. 1989), el cual contiene importantes centros de unión al calcio
(Axelrod et al. 1990). En humanos el dominio EGF1 parece jugar un papel
estructural importante proporcionado la orientación adecuada durante la
unión del FIX con FVIIIa en el complejo tenasa intrínseco y en la unión al
complejo FVIIa-TF durante la coagulación (Schmidt et al. 2003), así como
incrementando la actividad del dominio catalítico del FIX durante la
activación del FX (Celie et al. 2002). Debido a la elevada similitud proteica
entre ambas especies (Evans et al. 1989) nosotros sugerimos que la
mutación identificada en el gen del FIX resulta en una proteína carente de
38 codones del dominio EGF. La carencia de 38 codones del dominio EGF
del FIX sugiere que la unión con el complejo FVIIa-TF y con FVIIIa en el
complejo tenasa intrínseco durante la coagulación estaría alterada, lo cual
explica el fenotipo severo, es decir, la gravedad de los síntomas y la
actividad residual del FIX (1%), observado en el fila brasileño.
Conclusión
Figura 1: electroforesis en gel de agarosa del
exón 4 (A) y de las regiones intrónicas
adyacentes al exón 4 (B) del gen del FIX en un
fila brasileño con hemofilia B. Marcador (M), control
(C), fila brasileño con hemofilia B (FB)
El hecho de que la amplificación del exón 4 en tres filas brasileños y en diez
perros sanos usados como control, revelara una banda de 114 pares de
bases correspondiente al exón 4 del gen del FIX, permitió confirmar la
deleción del exón 4 en el fila brasileño.
La amplificación mediante PCR del exon 4 y las regiones intrónicas
adyacentes al exon 4 del gen que codifica para el factor IX en el hemofílico
fila brasileño, reveló una banda de aproximadamente 4 Kb, claramente
menor a la obtenida en los animales usados como control (ver figura 1B).
Los resultados de este estudio muestran con suficiente claridad que la
mutación identificada es responsable de la forma severa de hemofilia B
diagnosticada en el fila brasileño, siendo la primera mutación descrita en
esta raza como responsable de hemofilia B.
Referencias
Axelrod JH, Read MS, Brinkhous KM, Verma IM. Phenotypic correction of FIX deficiency
in skin fibroblasts of hemophilic dog. Proc.Natl.Acad.Sci. 1999 Jul;87(13):5173-7.
Celie PH, Van Stempvoort G, Fribourg C, Schurgers LJ, Lenting PJ, Mertens K. The
connecting segment between both epidermal growth factor-like domains in blood
coagulation factor IX contributes to stimmulation by factor VIIIa and its isolated A2
domain. J.Biol.Chem. 2002 Jun 7;277(23):20214-20.
Evans JP, Watzke HH, Ware JL, Stafford DW, High KA. Molecular cloning of a cDNA
encoding canine factor IX. Blood. 1989 Jul;74(1):207-12.
Hsu TC, Nakava SM, Thompson AR. Severe haemophilia B due to a 6 Kb factor IX gene
deletion including exon 4: non-homologous recombination associated with a shortened
transcript from whole blood. Thromb.Haemost. 2007 Feb;97(2):176-80.
Schmidt AE, Bajaj SP. Structure-function relationship in factor IX and factor IXa.
Trends.Cardiovas.Med. 2003 Jan;13(1):39-45.