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INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
SECRETARIA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS
SECCION DE POSGRADO
MUTACIONES ESPECIFICAS EN HEMOFILIA A
TESINA
QUE PARA OBTENER EL DIPLOMA DE:
ESPECIALIZACIÓN EN HEMATOPATOLOGÍA
PRESENTA
QFB. ALMA ROSA LUNA GASPAR
Director de tesina:
M en C. Martha Lilia Cassani Galindo
CONTENIDO
INDICE DE TABLAS
INDICE DE FIGURAS
ABREVIATURAS
RESUMEN
OBJETIVO Y JUSTIFICACION
I. INTRODUCCION
1.1 Descripción general de la hemofilia
1.2 Antecedentes históricos de la hemofilia
1.3 Herencia
1.4 Clasificación de la hemofilia
1.5 Incidencia
1.6 Manifestaciones clínicas
1.7 Inhibidores
1.8 Estructura de la proteína del Factor VIII
1.9 Síntesis del Factor VIII
1.10 Características bioquímicas y moleculares del
gen del Factor VIII
1.11
1.12
1.13
1.14
II.
Activación del Factor VIII
Fisiología de la hemostasia secundaria
Modelo actual de la coagulación
Fisiología de la hemofilia
MUTACIONES MAS FRECUENTES EN EL GEN
DEL FACTOR VIII
III. MUTACIONES ASOCIADAS CON HEMOFIL IA A
SEVERA
IV.
METODOS DE PCR PARA DIAGNOSTICAR
MUTACIONES RELACIONADAS CON
HEMOFILIA
4.1 Reacción en Cadena de la Polimerasa
PCR
4.2 Técnicas de Southern Blot
V. CONCLUSIONES
VI.
BIBLIOGRAFIA
i
ii
iii
1
2
2
2
4
4
4
5
6
7
8
8
9
10
10
11
13
19
21
21
23
25
26
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Base de datos de mutaciones puntuales
21
Tabla 2. Base de datos de mutaciones en el gen del
VIII relacionadas con el grado de severidad
y desarrollo de inhibidores.
23
i
INDICE DE FIGURAS
Páginas
Figura 1. Transmisión la hemofilia
4
Figura 2. Sitios más frecuentes de hemorragias en el enfermo
Hemofílico
6
8
Figura 3. Unidad funcional del factor VIII.
9
Figura 4. Estructura del gen del Factor VIII
10
Figura 5. Fisiología de le hemostasia secundaria
11
Figura 6. Esquema del mecanismo de la coagulación
12
Figura 7. Generación de macrodosis de trombina
Figura 8. Esquema de la inversión 22 en el gen de FVIII.
20
Figura 9. Esquema de los pasos de la Reacción en Cadena de la
Polimerasa
23
ii
OBJETIVO GENERAL
Revisar los aspectos generales asociados con la hemofilia, así como las
mutaciones más frecuentes relacionadas con el gen del FVIII.
JUSTIFICACION:
En México, la hemofilia representa un problema de salud pública
importante, la gravedad de éste padecimiento está altamente relacionada con
el tipo de mutación presente en el gen del FVIII. Por lo que se hace necesario
hacer una revisión más amplia de las mutaciones asociadas a la hemofilia A.
iii
RESUMEN
La
hemofilia
constituye
una
enfermedad
hemorrágica
hereditaria,
caracterizada por la deficiencia funcional o cuantitativa del factor VIII coagulante
(FVIII:C), causante de la hemofilia A y factor IX coagulante (FIX:C), causante de
la hemofilia B. La hemofilia se presenta debido a un defecto en el gen del factor
VIII o del factor IX, ambos se localizan en el brazo largo del cromosoma X.
Clínicamente
se
manifiesta
por
episodios
hemorrágicos
recurrentes
especialmente en músculo y articulaciones, de intensidad variable de acuerdo con
la concentración circulante del factor afectado. La localización de las hemorragias
otorga a la hemofilia un patrón clínico particular que potencialmente puede
producir discapacidad.
En México la Federación Mexicana de Hemofilia tienen registrados
aproximadamente 3000 casos de hemofilia.
El gen del FVIII presenta una tasa de mutación del orden de 1 X10 -5. Se
caracteriza por presentar mutaciones con una gran variedad en el tipo y
distribución a lo largo del gen, por lo que se considera altamente heterogéneo. Se
han descrito alteraciones en los 26 exones y en algunos intrones de éste gen. Las
mutaciones puntuales son los defectos más comunes, hasta Enero de 2007 se
han reportado 1221 de éstas alteraciones, de los cuales 48% son mutaciones de
cambio de sentido,11% son mutaciones sin sentido, 16% y 11% corresponden a
pequeñas y grandes deleciones, respectivamente, 8% son mutaciones en sitios
de empalme y 7% son inserciones. El exón 14 es el que presenta el mayor
número de alteraciones (104/14%) y esta altamente relacionado con hemofilia
severa.
1
I. INTRODUCCION
1.1
Descripción general de la hemofilia
La hemofilia es una coagulopatía hereditaria de carácter recesivo ligada al
cromosoma X, se caracteriza por la deficiencia funcional o cuantitativa del FVIII:C
o FIX:C de la coagulación. Se trata de una enfermedad crónica que persiste a lo
largo de toda la vida del enfermo (Bello, 2001).
Un paciente hemofílico no tiene la cantidad suficiente del factor VIII o IX en
el plasma circulante, lo que impide una adecuada coagulación de la sangre. Estos
enfermos
manifiestan
hemorragias
prolongadas,
particularmente
en
las
articulaciones y músculos, donde por la repetición de los procesos hemorrágicos,
produce lesiones irreversibles e invalidez debido a las artropatías (Martínez y col,
1996).
1.2 Antecedentes históricos de la hemofilia
La hemofilia probablemente existe desde que aparecieron las primeras
generaciones del hombre y se cree que fue ocasionada por una mutación de
novo, que progresivamente se fue difundiendo (Ljung y col, 1995).
En el siglo II A.C. en la obra sagrada de la ley judaica, el Talmud, de
Babilonia, los rabinos Rabbi Judah y Rabbi Simon ben Gameliet, mencionan la
ocurrencia de una hemorragia mortal, de origen hereditario
después de
practicada la circuncisión en los hijos varones (Ayalew, 2001).
En 1803, un médico norteamericano llamado John Conrad Otto, demostró
que la enfermedad estaba ligada al cromosoma X, quedando limitada a los
varones, siendo las mujeres las portadoras (Beutler y col, 2001).
En 1853, nace Leopoldo el primer hijo hemofílico de la Reina Victoria de
Inglaterra, quien sufre una mutación de novo. La reina Victoria transmite la
enfermedad a gran parte de la realeza europea, de ahí deriva el término de
“enfermedad de reyes”. Leopoldo muere a los 31 años de edad por una
hemorragia cerebral después de una caída (Ingram, 1976).
En 1936, los profesores Patek y Taylor en Harvard, demostraron que el
defecto en la hemofilia se debía a la deficiencia de un factor denominado
antihemofílico. (Ljung, 1995).
2
En 1952, el profesor Armando J Quick y col; definieron a la hemofilia como
una enfermedad hemorrágica ligada al cromosoma X. La anomalía se debía a una
deficiencia de globulina antihemofílica (López y col, 1992).
En 1952, la Dra. Rose Mary Biggs y los profesores Douglas y Macfarlane
en Oxford, descubrieron la enfermedad de Christmas o hemofilia B (Bigss, 1952).
En 1965, la Dra. Judith Graham Pool, norteamericana, descubrió los
crioprecipitados que revolucionaron el tratamiento de la hemofilia (Pool, 1975).
En 1984, después de estudiar el gen del FVIII, diversos grupos de
investigadores, como los de Gitschier, Toole y Word, en diferentes estudios han
reportado algunas de las mutaciones que dan origen a la hemofilia en sus tres
variedades de presentación: leve, moderada y grave ( Gitschier y col, 1985;
Harper, 1984; Whyte, 1987).
1.2 Herencia
Los genes que codifican para los factores VIII y IX
se encuentran
localizados en el brazo largo, en la región q28 del cromosoma X. Se trata de un
trastorno ligado al sexo, por lo tanto, el varón quien es
hemicigoto (X hY)
manifiesta la enfermedad y las mujeres (XhX) son las portadoras, sin embargo, en
casos raros se pueden presentar mujeres hemofílicas. (Bello, 2001).
Las madres de los hemofílicos son portadoras en la mayoría de los casos,
excepto cuando aparecen mutaciones de novo lo cual se presenta en el 30% de
los casos. Los hijos de una mujer portadora tienen el 50% de probabilidad de ser
sano y el 50% de ser hemofílicos, mientras que la probabilidad de heredar el
estado de sano o de portadora será del 50% .31 (López y col, 1992). También se
han descrito casos aislados en los que las mujeres han desarrollado la
enfermedad.35 (Martínez y col, 2008). Por su parte los padres hemofílicos
transmitirán el trastorno a todas sus hijas pero sus hijos serán sanos (Naylor y col,
1991). (Fig.1)
3
XXY=Varón hemofílico
XX= Mujer sana
XY= Varón sano
XXX= Mujer portadora
Figura 1. Transmisión la hemofilia (tomado de http/www.wfh.org)
1.3 Clasificación de la hemofilia
La hemofilia se clasifica en dos tipos clínicamente indistinguibles: la
hemofilia A o hemofilia clásica, caracterizada por la deficiencia funcional o
cuantitativa de la globulina antihemofílica denominada FVIII:C y la hemofilia B o
enfermedad de Christmas, que se caracteriza por la deficiencia funcional o
cuantitativa del FIX:C (Butler y col, 2001).
1.4 Incidencia
La hemofilia A se presenta en 80% de todos los casos, mientras que la
hemofilia B en 20% (Martínez, 2000). Esta enfermedad
es de distribución
mundial. La hemofilia A afecta al varón con una incidencia global de 1 a 2 casos
por 10 000 varones, mientras que la hemofilia B ocurre en 1 de cada 25,000
varones (Hoyer, 1994).
La Federación Mundial de Hemofilia, cuyas siglas en inglés son WFH,
hasta Agosto del 2000 informa 105,000 casos de hemofílicos en 77 países, sin
embargo se estima que deben existir 400,000 hemofílicos en todo el mundo.
35, 52
(Martínez y col, 2008; http/www.wfg.org).
La Federación de Hemofilia de la República Mexicana A.C; tiene registrados
a 3000, hemofílicos en el país, sin embargo, se debe de considerar que de
acuerdo a la incidencia mundial, deben existir aproximadamente entre 4000 y
5000 enfermos con hemofilia A y entre 1000 y 1250 enfermos con hemofilia B. El
45% del total de enfermos hemofílicos A y B presentan hemofilia grave (2250 y
4
2812), respectivamente aunque se estima que hay más de 6000 y que en su
mayoría aún no han sido diagnosticados. (Fed de Hem Rep Mex, 2004).
1.5 Manifestaciones clínicas
Las manifestaciones clínicas de la hemofilia es la hemorragia. Según el
sitio donde se presente, puede ser invalidante, como el sangrado intra-articular o
la hemorragia intracraneana (HIC). La frecuencia y la intensidad de la hemorragia
depende del nivel plasmático del factor afectado. Los pacientes con hemofilia
severa sangran espontáneamente o por un trauma mínimo. Los pacientes con
hemofilia leve, sangran por procedimientos quirúrgicos o traumatismos graves.
Las hemorragias intra-articulares (hemartrosis) es la manifestación más común e
incapacitante del hemofílico. En la figura 2 se muestra el orden de frecuencia de
las hemartrosis. Estas articulaciones son más susceptibles de sangrar porque
soportan más peso, tienen mayor cantidad de tejido sinovial, carecen de músculo
para recubrir la articulación y contrarresten las fuerzas rotatorias y angulares a las
que se someten. La ausencia de tromboplastina tisular en el tejido sinovial impide
la activación de la coagulación y resulta insuficiente para detener la hemorragia.
Los niveles elevados de activador del plasminógeno (t-PA) intraarticular,
incrementan la fibrinólisis y destruyen el coágulo en formación. La hemorragia
muscular es el segundo tipo de hemorragia en la hemofilia severa. Las
Hemorragias intracraneanas es la principal causa de muerte y sucede en un 212% (Martínez y col, 2000), Martínez y col, 2008).
5
Figura 2. Sitios más frecuentes de hemorragias en el enfermo hemofílico
(Tomado de http/www.wfg.org)
En función de la concentración plasmática del factor deficiente y de las
manifestaciones clínicas, la hemofilia también se clasifica en: a) hemofilia de alto
riesgo o grave: mantienen en la circulación < del 1% de actividad del factor
afectado, b) hemofilia moderada: hay de 1-5% y c) hemofilia leve: hay de 6-30%
(Ayalew, 2001) ,(Bello, 2001),( Beutler y col, 2001).
1.6
Inhibidores
Los inhibidores son inmunoglobulinas de clase IgG4, éstas van a
neutralizar la actividad procoagulante del FVIII y/o FIX. Están dirigidos contra
epitopes de la cadena ligera en los dominios A2, A3 y C2 y en los dominios A1 y
A2 de la región acídica de la molécula de estos factores coagulantes (Van den
Brink, 2000; Scandella y col, 2002). Los factores de riesgo que predisponen para
desarrollar inhibidores en el hemofílico son: a) hemofílicos cuya deficiencia del
factor afectado es menor del 1% de actividad y desarrollan inhibidores en 5 - 30%
de los casos con hemofilia A, y del 1-3% en los casos con hemofilia B, b) número
de exposiciones a los concentrados terapéuticos y c) tipo de mutación del gen del
factor afectado, siendo las mutaciones con grandes deleciones y las mutaciones
sinsentido
las
más
susceptibles
de
desarrollar
inhibidores
(Lusher,2000),(Schwaab y col, 1995). Los hemofílicos que desarrollan inhibidores
se clasifican como: a) con baja respuesta, los cuales presentan de 0.6 – 5
Unidades Bethesda (UB) y b) con alta respuesta si tienen >5 UB (Mervina, 2000).
6
Se sospecha de la presencia del inhibidor cuando el enfermo no responde
a las dosis habituales de los concentrados transfundidos, y si el reporte de TTPa
no se corrige con plasmas normales (Deitcher y col, 2002).
Aunque el desarrollo de inhibidores en los pacientes con hemofilia no
incrementa la frecuencia de sus hemorragias, si representa un problema
importante en el manejo terapéutico de las hemorragias, aunque suprimir estos
factores deficientes con la terapia de reemplazo, representa un reto para el
médico hematólogo tratante (Prowse, 1995).
La presencia del inhibidor puede ser confirmada en el laboratorio por
diferentes métodos, Oxford, Bethesda y Nijmegen (Alistair y col, 1998). Bethesda
es el más utilizado en diferentes países de EEUU, Europa y Latinoamérica. Este
método se considera como el “estándar de oro”, por ser un método sencillo,
rápido, confiable y poco costoso (Verbruggen y col, 1995)
1.7 Estructura de la proteína del Factor VIII
El factor VIII es una glicoproteína de cadena única, tiene un peso molecular
(PM) de 280 kilodaltons (Kd). La estructura del polipéptido del FVIII presenta tres
unidades peptídicas funcionales A, B,C, con aproximadamente 330, 980 y 150 aa,
respectivamente, los cuales están en el orden siguiente: NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2COOH., A1-A2-B constituyen la cadena pesada, su PM es de 210,000 kd y A3-C1C2 que constituyen la cadena ligera cuyo PM es de 80 kd (Vehar y col., 1984).
Presenta una homología aminoacídica de alrededor del 40% con 5 de las 6
unidades funcionales polipeptídicas de que también consta el FV de la coagulación,
y cuya disposición también es similar. Sin embargo, la unidad polipeptídica
funcional parece no estar relacionado (Mosesson y col, 1990). (Fig. 3). Gran parte
del FVIII circula unido al factor de von Willebrand (FvW) en forma de dos cadenas,
la pesada y la ligera, ambas cadenas unidas de forma no covalente mediante la
interacción de iones Ca2+ y Cu2+
(http://www.hemobase.com/Molecular_Hemofilia/Index.htm)
7
CADENA PESADA
NH2
A1
REGION DE UNION
A2
B
CADENA LIGERA
A3
C1
11
1
C2
COOH
Figura 3. Unidad funcional del factor VIII.
(Tomado de Mosesson MW y col y1990)
1.8 Síntesis del Factor VIII
La determinación del lugar de biosíntesis de FVIII en el organismo ha sido un
tema especialmente controvertido. Se ha demostrado la presencia de RNAm del
FVIII en diversos órganos tales como bazo, páncreas y riñón (Wion y cols., 1985).
Sin embargo, el hígado es el órgano productor de FVIII por excelencia, más
concretamente las células sinusoidales y en menor medida los hepatocitos
(Hollestelle y cols.,2001). A pesar de que el bazo y el riñón expresan cantidades
similares de RNAm por gramo de tejido, el gran tamaño del hígado lo convierte en
la principal fuente de FVIII (Wion y cols., 1985). Una clara demostración se
encuentra en el hecho de que los pacientes hemofílicos sometidos a transplante
hepático recuperan los niveles normales de FVIII (Wood y cols., 1984).
1.9 Características bioquímicas y moleculares del gen de Factor
VIII
El gen de FVIII (F8) que codifica para el factor VIII de la coagulación,
representa el 0.1% de la longitud total del cromosoma X. Se localiza en un
extremo del brazo largo del cromosoma X, en la banda q28, a una distancia de
1Mb del telómero. Consta de 26 exones y 25 intrones que se extienden a lo largo
de 186 Kb en el genoma humano y da lugar a un RNAm de 9Kb, la secuencia
codificadora tiene 7053 nucleótidos. Veinticuatro de los exones tienen un tamaño
que varía entre 69 y 262 pb, mientras que los exones 14 y 26, contienen 3106 y
1958pb respectivamente. La mayor parte del exon 26 corresponde a secuencias
transcritas y no traducidas. Algunos de los intrones son extremadamente largos:
los intrones 1,6,13,14 y 25 constan de 14 a 23 Kb y el intrón 22 tiene 32 Kb. El
intron 22 contiene dos genes transcritos intragénicos “anidados” dentro del mismo
gen del F8 conocidos cono F8A y F8B que no parecen tener ninguna vinculación
fisiológica con el gen huésped. El F8B se transcribe en la misma dirección que el
gen F8 y da lugar a un RNAm de 2.5 Kb que incluye un exón propio y los exones
8
23 a 26 del gen FVIII. Por su parte el gen de F8A no contiene intrones y se
transcribe en sentido opuesto. A 4000 Kb del telómero distal del gen F8 se
encuentran dos copias homologas al 100 % del gen F8A, cuya presencia es la
responsable de casi el
50% de las hemofilias A graves (Gitchier y cols.,
1995),(Martínez y col.,2008). (Fig. 4).
Figura 4. Estructura del gen del Factor VIII (imagen tomada de:
http://www.hemobase.com/Molecular_Hemofilia/Index.htm)
1.10 Activación del Factor VIII
La activación proteolítica del FVIII es necesaria para la generación del
complejo de activación del FX en el sistema de coagulación in vitro. El FVIII puede
ser activado por el FXa (factor X activado) y por la trombina. La activación por
trombina se asocia a una ruptura en la cadena pesada en el residuo Arginina
(Arg) 372, así como en la posición Arg 740 (a nivel de la unión A2B) que libera al
dominio B. En la cadena ligera a nivel de la Arg 1689 existe otra ruptura que
contribuye a incrementar su actividad de cofactor y a liberar el FVIII del Factor de
von Willebrand (FvW). La actividad del cofactor en el complejo Xasa se obtiene
por la ruptura en Arg 372. Las rupturas específicas para generar el FVIIIa (Factor
VIII activado) son a nivel de Arg 740 y 372. (Gaucher C y col., 1989),( Whyte y
col., 1987).
El factor VIII presenta una vida media de 8-12 horas, se sintetiza
principalmente en las células endoteliales de los hepatocitos, bazo, ganglios
linfáticos y riñón. Circula normalmente en el plasma como un gran complejo unido
al factor de von Willebrand a una concentración de 0.1 mg/mL. (Beutler E y
cols.,2005)
9
1.11 Fisiología de la hemostasia secundaria
El sistema de la coagulación o hemostasia secundaria es la primera línea
de defensa contra traumas del sistema vascular. En una herida la coagulación
sanguínea rápidamente forma un coágulo sanguíneo cesando la hemorragia en
un tiempo promedio de 2-5 minutos sí el sistema está funcionando correctamente.
Las propiedades de la coagulación sanguínea tienen como características que los
componentes de las reacciones sean localizadas, amplificadas y moduladas.
Actualmente se conoce la importancia que tienen las superficies celulares
(plaquetas, células endoteliales, fibroblastos, monocitos, remanentes celulares o
micropartículas) en la interacción y acoplamiento molecular que dan lugar a la
coagulación sanguínea. La vasoconstricción inicial, la función de las células
endoteliales y la formación del coágulo plaquetario, juegan un papel importante en
la hemostasia primaria, sin embargo, la formación del coágulo de fibrina a través
de una serie de reacciones bioquímicas en el que se involucran enzimas,
cofactores y superficies celulares, son esenciales para la formación de
un
coágulo insoluble en la hemostasia secundaria (Martínez y col., 2008). (Fig. 5)
Figura 5. Fisiología de la hemostasia secundaria
(Tomado de Martínez MC y cols, 2000)
1.12 Modelo actual de la coagulacion
El modelo actual de la coagulación consiste en una serie de mecanismos
que inicia cuando existe la lesión vascular. La exposición del FT en la sangre y la
unión del factor VII (FVII) son los iniciadores del sistema de
hemostasia
secundaria. Primero se expresa el FT de fuentes extravasculares, de células
inflamatorias o del endotelio, esta exposición del FT tiene dos funciones
principales; 1. Activación del factor X (FX) y 2. Activación del factor IX (FIX). El
10
FX a su vez activa al FV y el complejo formado por FXa/FVa genera pequeñas
cantidades de trombina. El inhibidor de la vía del FT (IVFT) inhibe el complejo
FT/VIIa/Xa, evitando que se formen grandes cantidades de trombina. Sin embargo
con la pequeña dosis de trombina (1%) (fase de iniciación), es suficiente para
activar plaquetas, FVIII; quien se disocia de factor de von Willebrand (FvW),
(proteína que lo protege de la degradación enzimática), FV y FXI. Por otro lado el
complejo FT/FVIIa activa también al FIX (FIXa), una vez activado se une a su
cofactor el
FVIIIa, formando el complejo FVIIIa/FIXa, quien es 10 5- 106 más
activo que el FIXa solo y 50 veces más eficiente que el complejo FT/VIIa para
activar al FX, por lo tanto, la mayor parte del FXa es producido por el complejo
FVIIIa/FIXa. El FXa se une a su cofactor FVa sobre la superficie de la plaqueta,
formando el complejo protrombinasa (IIasa), generando grandes cantidades de
trombina (99%) ( fase de amplificación ). El complejo protrombinasa es 300 000
veces mas activo en catalizar la activación de la protrombina que el FXa (Martínez
y cols., 1996), (Martínez y col., 1998) ( (Fig. 6).
Figura 6. Esquema del mecanismo de la coagulación
1.13 Fisiología de la hemofilia
La deficiencia cuantitativa o funcional del FVIII:C o FIX:C se traduce como
un defecto en el mecanismo de activación de la coagulación. Cuando existe una
11
lesión vascular se expone al FT extravascular, que se une inmediatamente al
FVII formándose el complejo FVII:C/FT y activará al FX:C y FIX:C, ambos factores
participan en la fase de sostén y mantenimiento de la coagulación, sin embargo,
el complejo FVII:C/FT tiene predilección por la activación del FX:C, también
llamado complejo Xasa. Los hemofílicos sangran porque el complejo FVII:C/FT
que activa al FXC
es cuantitativamente insuficiente para proporcionar la
hemostasia in vivo, debido a que al formarse el complejo FVII:C/FT
inmediatamente se libera un inhibidor de la vía del factor tisular (IVFT), que inhibe
al FT y degrada la pequeña cantidad de trombina generada, por lo que resulta
insuficiente sostener la hemostasia. Se requiere la acción de de la vía
complementaria que activa al FXI (FXIa), quien activará al FIX (FIXa), que junto
con el FVIII formará el complejo FVIIIa/FIXa, formándose cantidades suficientes
de trombina; contribuyendo a la amplificación y propagación de la formación del
coágulo de fibrina. La deficiencia de los factores VIII:C y IX:C se traduce en un
retardo en la formación del coágulo, considerando que la fase inicial de la
activación de la coagulación dependiente del complejo FVII/FT, se encuentra
bloqueado por el inhibidor de la vía del factor tisular (IVFT), esto provoca que la
formación del polímero de fibrina se realice de manera tardía y, clínicamente
predisponga al enfermo a hemorragias. En el paciente hemofílico se encuentra
dañada la amplificación y propagación de la coagulación al afectarse el complejo
Xasa y generar poca cantidad de trombina (Martínez y cols., 2000), ( Martínez y
col., 1996),(Martínez y col., 2008).
Figura 7. Importancia de la vía alterna formada por
FVIIIa, FIXa y FIXa en la generación de macrodosis
de trombina. (Martínez M. C y col, 2000).
12
II. MUTACIONES MÁS FRECUENTES EN EL GEN DEL FVIII
El gen del FVIII presenta una tasa de mutación del orden de 1 X10-5 por
gameto/generación considerada en el rango de mutación altas en genes
eucarióticos. Se caracteriza por presentar mutaciones con gran heterogeneidad
alélica, es decir, una gran variedad en el tipo y distribución de las mutaciones a lo
largo del gen. Se han encontrado regiones donde se concentra la incidencia de
mutaciones, denominada sitios calientes “hot spot”. (Guizar, 2001)
A partir de la clonación del gen del FVIII en 1984, diversos grupos iniciaron
la búsqueda de mutaciones responsables de la hemofilia A moderada y leve
(Higuchi y col., 1991). Naylor en 1992, basándose en RT-PCR a partir de sangre
periférica, obtuvo amplificaciones de los exones 1 al 22 y 23 al 26, pero no pudo
obtener amplificaciones de los exones 22 y 23. Más tarde Lakich y col., 1993, y
Naylor
y col., 1993 mediante técnicas de Southern Blot comprobaron que el
patrón de bandas del intrón 22 se comportaba diferente con respecto a las bandas
encontradas en el resto de los exones del gen de FVIII.
Las mutaciones puntuales son las más comunes de los defectos en el gen
del factor VIII. Éstas se agrupan de acuerdo, a la presencia o no de sitios CG, en
el que ocurre una transición, se conoce que son sitios ampliamente mutables
cambiándose el nucleótido T por C y A por G. El 30% de las mutaciones están
relacionadas con alteraciones en los sitios CG y están asociadas a hemofilia
moderada, el 70% restante no esta relacionado con los sitios CG (Naylor y cols.,
1992).
Las mutaciones puntuales relacionadas con la hemofilia son: a) deleciones
(en la secuencia de nucleótidos hay pérdida de uno o mas nucleótidos en el gen).
Se dividen en grandes deleciones (pérdida >50pb) y pequeñas deleciones
(pérdida <50pb), b) inserciones (en la secuencia de nucleótidos se añaden uno o
más nucleótidos en el gen), tanto en las deleciones como en las inserciones
tienen como consecuencia la formación de proteínas no funcionales y c)
rearreglos como inversiones, éstos se han encontrado tanto en genes del factor
VIII
como
genes
de
factor
IX
(www.hemobase.com/molecular
hemophilia/Index.htm)
Tuddenham y col,
1991 y 1994 publican la primera base de datos
relacionada con las mutaciones en el gen del FVIII asociadas a hemofilias
13
severas, moderadas y leves. Describe que están relacionadas principalmente con
mutaciones puntuales tales como sustituciones, deleciones e inserciones
(http:pubmedcentral.nhi.gov/articlerender.fcgi?artid=328775)
Actualmente Kemball CG, Tuddenham G.D, han recopilado y actualizado
una base de datos en línea web, conocida como Haemophilia A mutations,
Search, Test and Resource Site (HAMTeRS) en donde se reportan todas la
mutaciones encontradas relacionadas con hemofilia A severa, moderada y leve
(http://www.genomic.unimel.edu.au/mdi/mutnomen),
(http://nar.oxfordjournals.org/cgi/content/full/25/1/128).
En el cuadro 1, se muestra una resumen de la base de datos descrita por
HAMTeRS, hasta Enero de 2007, de un total de 1221 mutaciones puntuales
encontradas en el gen del FVIII. En 135(11%) corresponde a grandes deleciones
con la pérdida de 1kb a 210 kb, lo que provocará una recombinación nucleotídica
no homóloga. Se ha reportado que 5% de los casos de hemofilia A severa, es
debida a esta causa (Woods-Samuels y col, 1991). Algunos reportes de hemofilia
moderada están relacionados con alteraciones en el empalme del RNAm por
deleciones en el exón 22 (Youssoufian y col, 1987), exón 23-24 (Wehnert y col,
1989; Lavergne y col, 1992) provocando baja actividad del FVIII debido a la
carencia del aminoácido. Con relación a las pequeñas deleciones, se ha
encontrado que 197(16%) corresponden a éstas con la pérdida desde 1pb
hasta 86pb, y están asociadas a hemofilia severa debido a la ausencia de
expresión de la proteína del FVIII. Con respecto a las inserciones, se distinguen
80 diferentes inserciones que corresponden a un 6%, éstas abarcan desde 1pb a
2.1Kb y 3.8Kb en la que se ve involucrada la familia LINE (Kazazian y col, 1988).
La mayoría de las inserciones de un solo tipo de base, la cual llega a repetirse 8
veces, por ejemplo, una inserción con 8 nucleótido de A. El grupo de Higuchi y
col, 1991; Pineman y col, 1995; y Miller y col, 1994; estudiaron a 164 pacientes
hemofílicos A severos, 69 (42%) se relacionan con inversiones, el 90% de éstas
ocurrieron en la zona distal y proximal del gen del FVIII. Tizzano y col, 1994.,
reporto 39% de inversiones en 92 pacientes estudiados; 36% desarrollaron
inhibidores. Goodeve y col,. 1994., reportó 48% de inversiones en 23 pacientes
estudiados. Collins y col, 1994., y Ljung, 1994 encontraron el 45% de inversiones
en
85
pacientes
y
46%
en
41
pacientes
(http//www.hemobase.com/Molecular hemophilia(Index.htm).
14
respectivamente
En las mutaciones de cambio de sentido: se produce un codón alterado
que conlleva a codificar para un aminoácido diferente, que puede alterar las
propiedades de la proteína, o incluso convertirla en no funcional. La severidad de
la hemofilia va a depender en gran parte de la modificación que sufra el tipo de
aminoácido con respecto al original tomando en consideración aspectos tan
importantes como la estructura, polaridad o hidrofobicidad, así como la ubicación
de éste. Si el aminoácido modificado, no esta afectado de manera importante con
relación a las características antes citadas, la hemofilia se presentará menos
severa, mientras que en los casos en que la región alterada del aminoácido sea
estructural y funcionalmente diferente, entonces se producirá una proteína
modificada de forma importante e
inestable estructuralmente dando como
resultado una hemofilia moderada o severa. (Bowen y cols., 2002). En la tabla
1se reportan 583(48%) de mutaciones con cambio de sentido.
En las mutaciones sin sentido: el cambio del nucleótido sucede con un
codón de terminación de la cadena, se afecta de manera importante la
información de los exones, con la interrupción de la síntesis de la proteína, por lo
tanto el producto será una proteína incompleta y no funcional, provocando
hemofilia severa. El mecanismo de intercambio de CG es el mismo que se explicó
en el párrafo anterior (Bowen y cols., 2002.
En el cuadro 1 se presentan
131(11%) de mutaciones sin sentido.
Cambios en los sitios de empalme en el RNAm: se eliminan o alteran
sitios de empalme en RNAm, esto es debido a la transcripción y procesamiento
incorrecto del RNAm, afectándose de manera importante fragmentos grandes en
regiones de exones en los sitios de empalme del RNAm del FVIII, alterando la
proteína
y
dando
lugar
a
hemofilia
severa.
(http://europium.csc.mrc.ac.uk/WebPages/PublicFiles/SmallDeletions.htm ),
(http://www.genomic.unimelb.edu.au/mdi/mutnomen/), (Tavassoli y cols., 1998)
15
En la tabla 1 se presentan 95(8%) de éste tipo de mutaciones. También se
muestra en este cuadro que todos los exones del gen de FVIII presentan alguna o
varias alteraciones. Además se puede observar que las mutaciones con cambio
de sentido predominan 583(48%), con respecto a las mutaciones sin sentido
131(11%), mutaciones en sitios de empalme 95(8%), pequeñas deleciones
197(16%), grandes deleciones 135(11%) e inserciones 80(6.55%). El exón 14
presenta el mayor número de alteraciones: 43 mutaciones de cambio de sentido,
52 mutaciones sin sentido, 6 en sitios de empalme, 77 pequeñas deleciones y 39
inserciones.
Tabla 1. Base de datos de mutaciones puntuales registradas hasta Enero de 2007,
publicada por HAMTeRS.
Exón
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
Total
Mutaciones
con cambio
de sentido
15
10
25
35
13
11
38
27
27
10
36
20
32
43
19
26
28
34
16
8
9
19
30
13
13
26
583
Mutaciones
sin sentido
2
1
0
7
1
2
5
6
3
3
1
5
3
52
2
7
3
5
1
1
5
5
1
5
2
3
131
Mutaciones puntuales
Mutaciones
Pequeñas
en sitios de deleciones
empalme
4
2
5
8
6
5
4
1
10
4
6
4
4
8
1
8
5
7
3
5
4
2
4
2
2
7
6
77
3
4
2
7
2
6
1
5
8
4
0
2
1
0
4
3
4
7
4
3
2
7
0
9
95
197
Grandes
deleciones
Inserciones
Na
Na
Na
Na
Na
Na
Na
Na
Na
Na
Na
Na
Na
Na
Na
Na
na
Na
Na
Na
Na
Na
Na
Na
Na
Na
135
1
4
0
1
1
2
1
1
3
0
1
1
3
39
0
0
5
4
4
2
1
1
0
2
3
0
80
En la tabla 2 también se observa que el exón 14 es el que presenta
mayores alteraciones (104/14%) del total (751), observamos que éste mismo exón
16
esta altamente asociado a hemofilia A severa (18.4%) y los exones 5 y 20 son los
menos relacionados (4 casos). El exón 8 esta altamente relacionado con el
desarrollo de inhibidores (27%), en los exones 2,4,5,6,14,15 y 25 el desarrollo de
inhibidores sucede en 1% , mientras que en los exones 1,4,6, y 20
no hay
evidencias que estén asociados al desarrollo de inhibidores. Con respecto a los
intrones se observa que son muy poco afectados, están poco relacionados con
hemofilia severa y poco relacionados con el desarrollo de inhibidores, solo en el
intrón 14 se ha reportado un caso con inhibidor.
17
Tabla 2. Base de datos de las mutaciones encontradas en el gen del FVIII y los
casos reportados relacionado con el grado de severidad y el desarrollo de inhibidores.
Exón o
Intrón
afectado
No. de
alteraciones
en el
exón/intrón
Tipo de mutaciones puntuales
Promotor
Exon 1
Intron 1
Exon 2
Intrón 2
Exón 3
Exón 4
Intrón 4
Exón 5
Intrón 5
Exón 6
Intrón 6
Exón 7
Exón 8
1
18
1
12
0
30
47
2
14
2
13
2
44
34
Cambio
de
sentido
16
NA
11
NA
30
40
NA
13
NA
11
2
39
28
Exón 9
Intrón 9
Exón 10
Exón 11
Intrón 11
Exón 12
Intrón 12
Exón 13
Exón 14
Intrón 14
Exón 15
Intrón 15
Exón 16
Exón 17
Exón 18
Exón 19
Exón 20
Exón 21
Exón 22
Exón 23
Exón 24
Exón 25
Intrón 25
Exón 26
31
1
16
39
1
27
2
39
103
1
27
1
38
34
45
19
9
15
24
35
18
20
1
30
28
NA
0
38
NA
21
NA
36
43
NA
24
NA
29
30
40
17
8
9
19
32
15
18
NA
27
Codón de
terminación
polimorfismo
Grados de severidad de
Hemofilia A
Inhibidor
Sever
a
modera
da
Leve
NR
Si
No
2
NA
1
NA
0
7
NA
1
NA
2
0
5
6
10
0
9
1
15
24
1
4
1
8
1
17
19
3
1
2
0
7
11
0
3
0
2
1
8
5
1
5
0
0
0
6
11
1
7
0
1
0
16
7
0
0
0
0
0
2
1
0
0
1
2
0
3
3
0
0
0
0
1
1
0
2
0
0
0
1
26
15
3
NA
0
1
NA
6
NA
3
58
NA
3
NA
9
3
5
2
1
6
5
3
3
3
NA
3
15
¿
5
12
¿
18
0
15
66
1
12
1
18
20
14
8
4
7
12
11
6
8
1
14
5
¿
4
11
¿
2
1
9
7
0
4
0
8
5
9
2
1
3
4
8
4
2
0
7
10
¿
5
13
¿
4
1
14
15
0
10
0
12
7
20
7
4
2
7
14
5
7
0
7
1
1
2
3
¿
3
0
1
15
4
¿
1
2
¿
2
¿
3
12
1
2
¿
6
3
5
4
0
1
4
4
4
3
0
5
23
¿
11
27
¿
25
¿
28
66
0
20
¿
24
0
30
12
5
10
13
24
9
8
1
20
2
1
18
1
0
0
2
2
2
3
1
2
3
3
0
2
10
1
19
40
2
6
1
11
1
33
3
NR
¿
3
¿
2
0
10
6
6
1
2
1
10
5
4
¿
4
10
¿
10
¿
8
25
0
5
¿
8
6
10
3
4
4
7
7
5
9
0
5
III.
MUTACIONES ASOCIADAS CON HEMOFILIA A SEVERA.
Una alteración genética de gran relevancia en la hemofilia A es la
presencia de la inversión 22 dentro del gen del FVIII responsable de 40-50% de
casos de hemofilia severa.
El primer paso en el diagnóstico molecular directo de la hemofilia A severa
consistió en el análisis de la presencia de la inversión 22 del gen del FVIII.23
Naylor y col., 1992, utilizando en técnicas de RT-PCR sugirieron
la
existencia de una alteración poco común entre los exones 22 y 23. Años antes
Gitschier y col., 1985, habían hallado, en individuos sanos, en el interior del intrón
22 a 32 kb, dos genes que denominaron F8A y F8B, en aquellos momentos éstos
autores pensaron que éstos genes dentro del intrón 22 eran los primeros
descubiertos en el genoma humano. El F8A presentaba además dos copias
altamente homólogas en la porción telomérica distal a unas 400 Kb del gen de
FVIII, a los que denominaron F8A´ y F8A´´, ambos genes tienen un tamaño de
9Kb y una homología cercana al 100%. Naylor y Gitschier presentaron como
hipótesis la posibilidad de que se hubiera producido una recombinación homóloga
desigual entre el gen del F8A y sus genes F8A´ y F8A´´, que era causante de
más de 40% de la hemofilia severa y cuya mutación no había podido ser
identificada. Si esto ocurría, el gen de FVIII quedaría dividido en dos mitades muy
distanciadas una de la otra, orientadas en sentido opuesto y explicaría los
transcritos inconexos que había encontrado Naylor. En 1993 Lakich y col., y
Naylor y col., empleando técnicas de Souther Blot, la digestión de DNA genómico
con BclI y su posterior transferencia e hibridación utilizando una sonda marcada
correspondiente a una región del intrón 22 del gen FVIII, da lugar a un patrón de
bandas que permite discriminar entre ausencia/ presencia del reordenamiento
(Lakich y cols., 1993), Comprobaron que, efectivamente, el patrón de bandas era
diferente en los individuos problema con respecto a los individuos sanos control
(Prowse y cols, 1995)
El proceso que da lugar a la inversión en el intrón 22 requiere que se lleve
a cabo la torsión del extremo del brazo largo del cromosoma X, para permitir el
encuentro de las regiones homólogas y que se pueda producir la recombinación
de material génico. La frecuencia estimada para que esto suceda es de 4X10-6.
Cuando la recombinación involucra al gen del F8A´, el producto se llama
19
inversión proximal o de tipo 1 y sucede en el 78% de los casos. Si la
recombinación implica al gen F8A´´, la inversión será distal o de tipo 2 y sucede
en el 19%. Se ha descubierto una tercera variante minoritaria (3% de los casos),
que ocurre en individuos portadores de tres copias extragénicas del gen F8A
(Rossiter y col., 1994). Los efectos fenotípicos de los tres tipos de inversiones
son, idénticos (Prowse y cols., 1995), Rossiter y cols, 1994).
En la figura 7 se muestra en forma esquemática el proceso que da lugar a
la inversión del intrón 22.
Figura 8. Esquema de la inversión 22 en el gen de FVIII. (Imagén tomada de:
http://www.hemobase.com/Molecular_Hemofilia/Index.htm)
A partir de que fue posible caracterizar el defecto genético del gen de la
hemofilia, varios investigadores se han dado a la tarea de realizar estudios
moleculares para detectar las diferentes alteraciones en el gen del FVIII. Jenkins y
col., 1994, con él método de Southern Blot, estudió a 85 pacientes con hemofilia
severa, 47% presentaron inversión 22, 80% fueron de tipo distal.
Deutz-Terlow
y col., 1995 con técnicas de hibridación estudió 177 pacientes Italianos con
hemofilia A, 57% presentaron la inversión 22 y fueron hemofílicos severos, el
resto fueron hemofílicos moderados y leves. El 85% de las inversiones son
distales, mientras que el 15% restante son proximales. Ljung R y col., 1995, con
método de Souther Blot estudió 49 pacientes suizos con hemofilia A, 22(45%)
20
presentaron la inversión 22. Gaucher C. y col., 1995, con método de Souther Blot
estudió 98 pacientes franceses con hemofilia A, 38 (48%) presentaron la inversión
22 y fueron hemofílicos A severos, 79% fueron de tipo distal y el resto fueron
proximales. Jayandharan G y col., 2005 con PCR multiplex, de 109 pcientes
Indúes estudiados, 51% presentaron el intrón 22 y 2% el intrón 1. Mantilla
Capacho JM y col, 2007 analizaron 138
pacientes Mexicanos, 94 pacientes
provenientes de 65 familias fueron analizados para detectar la inversión 1 y no se
encontró ningún caso con ésta alteración, de 44 pacientes provenientes de 33
familias con hemofilia severa, 14 (45%) fueron positivos para la inversión 22. De
31 pacientes 28 de ellos con inversión 22 se les buscó la presencia de
inhibidores, resultando que 8(29%) fueron positivos. Abu Amero KK y col., 2008
estudió 20 pacientes Árabes, 11(55%) presentaron la inversión 22 (Abu Mero KK
y cols.,1998)
IV.
METODOS DE PCR PARA EL DIAGNOSTICO DE
MUTACIONES RELACIONADAS CON LA HEMOFILIA.
El diagnóstico molecular de la hemofilia fue posible a partir de la clonación
y caracterización del los genes de la hemofilia. Gracias al diagnóstico molecular
del gen del FVIII se ha logrado identificar una gran variedad de mutaciones
relacionadas con hemofilia severa, moderada y leve. Se han empleado diferentes
métodos de PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) para identificar las
mutaciones descritas en los párrafos anteriores.´
4.1 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
La PCR es una técnica de biología molecular descrita en 1986 por Kary
Mullis. Este método tiene como objetivo amplificar un fragmento de DNA.
El proceso de PCR común por lo general consiste en una serie de 20 a 35
cambios repetidos de temperaturas llamados ciclos; cada ciclo suele involucrar 23 pasos de temperatura. Los ciclos de la PCR a menudo están precedidos por un
choque térmico (llamado “zonas calientes” ) a alta temperatura (>90 oC), seguido
de otro hold al final del proceso para la extensión del producto final. Las
temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo depende de factores
como: el tipo de enzima utilizada para la síntesis de DNA, la concentración de
21
iones divalentes, tipo de dNTPs en la reacción y de la temperatura de unión de
los iniciadores o cebadores. La reacción de PCR consiste en los siguientes
pasos: a) inicialización: se lleva la reacción hasta una temperatura de 94o·-96 o
·C (ó 98oC si se usa una polimerasa termoestable extrema) b) desnaturalización:
consiste en separar las dos hebras de DNA a temperaturas de 94o - 95
o
C, la
temperatura para la desnaturalización dependerá de factores como: la
concentración de G+C que tenga la hebra de DNA y del largo de la misma. Para
la desnaturalización suelen emplearse sales o agentes químicos, c) alineación o
unión del cebador: se producirá la hibridación del cebador, es decir, este se
unirá a su secuencia complementaria en el DNA molde. Para ello se baja la
temperatura a 50o -65o C durante 20-40 segundos, permitiendo así la alineación.
La polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el cebador empieza a sintetizar
DNA. Los cebadores indicarán la terminación de la síntesis de DNA que va a ser
amplificada, d) extensión o elongación de la cadena: la polimerasa sintetiza
una nueva hebra de DNA complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTP´s
complementarios en dirección 5´→3´, uniendo el grupo 5´-fosfato de los dNTP´s
con el grupo 3´-hidroxilo del final de la hebra de DNA que se esta extendiendo. La
temperatura para este paso depende de la DNA polimerasa que se use. Para la
taq polimerasa, la temperatura de máxima actividad es de 75o-80oC (comúnmente
72 oC). El tiempo de extensión depende de la DNA polimerasa empleada y de la
longitud del fragmento de DNA que se quiere amplificar, e) elongación final: se
lleva a cabo a 70-74·C de temperatura, durante 5-15 minutos tras el último ciclo
de PCR. Con ello se asegura que cualquier DNA de cadena simple restante sea
totalmente amplificado, f) conservación: este paso generalmente se lleva a cabo
a 4o -15oC, para conservar la reacción a corto plazo.
Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de interés se emplea la
electroforesis: que separa los fragmentos de DNA producidos dependiendo de la
carga iónica, de la longitud y del tamaño del fragmento amplificado. Los geles de
agarosa son más comúnmente usados para separar fragmentos grandes y los
geles de poliacrilamida se usan para fragmentos más pequeños.
El tamaño de los productos de la PCR están determinados por un marcador de
peso molecular de DNA de tamaño conocido, que se corre en el gel junto con los
productos de PCR problema (Fig. 8).
22
Figura 9. Esquema de los pasos de la Reacción en Cadena de la Polimerasa
4.2 Transcriptasa reversa y reacción en cadena de la
polimerasa (RT PCR)
RT-PCR: Consiste en usar un molde inicial de RNA utilizando una enzima
transcriptasa inversa, para realizar la conversión de RNA (tanto RNAm como RNA
total) a DNA llamado DNAc (DNA complementario).
4.2 Técnica de Souther Blot
Esta técnica fue desarrollada por Edward M Souther en el año 1975 .Es
una técnica que permite la identificación (presencia o ausencia), y localización de
secuencias específicas de una mezcla DNA de diferentes fuentes, con éste
método se identifica el tamaño del fragmento de restricción que contiene la
secuencia. Consta de los siguientes pasos. 1) digestión: se digiere el DNA con
una o mas enzimas de restricción, las cuales cortan en puntos específicos de la
secuencia, generando fragmento de DNA de varios tamaños, 2) electroforesis:
los fragmentos obtenidos se separan, de mayor a menor tamaño mediante
electroforesis en gel de agarosa, los de menor tamaño migran mas rápido que los
de mayor tamaño. Una vez terminada la electroforesis, los fragmentos de DNA se
23
trasfieren a una membrana de nitrocelulosa o de naylon. Este paso de
transferencia es esencial y muy importante en la técnica, 3) marcado de sondas:
para detectar el fragmento de interés en la membrana se utiliza otro fragmento de
DNA o RNA, llamadas sondas, que contienen la secuencia complementaria del
fragmento de DNA o RNA que queremos identificar y que estarán marcadas con
un isótopo radiactivo, se incuban por varias horas tanto la membrana con la
muestra problema y la sonda marcada, se adhiere al fragmento de DNA a través
del reconocimiento de secuencias complementarias. Para detectar la posición de
la marca radiactiva, la membrana de nitrocelulosa se cubre con una película
fotográfica o de rayos x. Después del revelado, la posición de las sondas
marcadas son visibles. La cantidad de DNA necesaria para la técnica depende del
tamaño y actividad específica de la muestra. Las muestras cortas tienden a ser
más específicas.
24
V. CONCLUSIONES
 Las mutaciones relacionadas con hemofilia A son las mutaciones
puntuales
tales
como:
pequeñas
y
grandes
deleciones,
inserciones (inversiones), mutaciones con cambio de sentido,
mutaciones sin sentido, mutaciones en los sitios de empalme
 Se ha encontrado que en los 26 y solo en algunos intrones como
el 2, 4, 5, 6, 9, 11, 12, 14, 15 y 25 presentan algún tipo de
alteración en el gen.
 El exón y el intrón14 es el que presenta mayor número de
alteraciones (mutaciones de cambio de sentido 43, mutaciones
sin sentido 52, en sitios de empalme 6, pequeñas deleciones 77 e
inserciones 39). presenta sin sentido.
 El exón 8 y 14 son los que están más relacionados con el
desarrollo de inhibidores.
 La inversión en el intrón 22, esta relacionado con la hemofilia A
severa en un 45-50% y con el desarrollo de inhibidores hasta en
un 12%.
25
VI. BIBLIOGRAFIA
1. Alistair R M, Alaine King, Gary Moore. Chromogenic vs One Stage
Measurement of residual factor VIII Activity in the Bethesda Assay:
Metodological Comparison. Blood, 1998;11:82b.
2. Abu Amero KK, Hellani A, Al Mahed M, Al Sheikh I. Spectrum of factor
VIII mutations in Arab patients with severe haemophilia A..Haemophi lia.
2008;14(3):484-8
3. Ayalew Tefferi. Primary hematology .Ed Humana Press.USA;2001
4. Bello GA, Márquez VJL, Enfermedades de la coagulación hereditarias.
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