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CAPÍTULO 4. APLICACIÓN DE LAS “ÓMICAS” EN LA MEJORA GENÉTICA
DESARROLLO DE MARCADORES MOLECULARES EN
LA ADORMIDERA (Papaver somniferum L.)
Laguna I.1, Bachiller J.2, Sanz A.1, Gálvez L.1, Orellana J.1, Fernández-Calvín B.2
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Unidad de Genética. Departamento de Biotecnología. E.T.S.I. Agrónomos Universidad Politécnica de Madrid,
28040, Madrid.
Unidad de Genética, Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, c/ Darwin 2, Campus de Cantoblanco,
Universidad Autónoma de Madrid, 28049, Madrid.
Palabras clave: variación molecular, metabolismo alcaloides, Papaver somniferum L.
INTRODUCCIÓN
La adormidera Papaver somniferum L. (2n=22) es una planta medicinal que se ha usado
desde la antigüedad debido a sus propiedades analgésicas y euforizantes. Las propiedades
medicinales de la adormidera residen en la presencia de determinados alcaloides que pueden
extraerse directamente como la morfina, la codeína y la noscapina. (Hagel et al., 2010).
La biosíntesis de opioides sigue una ruta bastante compleja, con múltiples bifurcaciones,
que en la actualidad no está totalmente establecida en la que intervienen más de 30 enzimas,
dando lugar a 13 productos finales. La amplia variedad de este tipo de alcaloides se origina
mediante diferentes modificaciones de la (S)-reticulina, que ocupa una posición central en la
ruta. Existen evidencias de que hay rutas parcialmente análogas en mamíferos (Kempe et al.,
2009) y también en humanos (Boettcher et al., 2005).
Los estudios moleculares de P. somniferum todavía son muy escasos. Se dispone de un
número limitado de ESTs y de información parcial de la secuencia de aproximadamente 2/3 de
los genes que intervienen en la biosíntesis de alcaloides (Frick et al., 2007; Ziegler et al., 2009;
Hagel et al., 2010).
El objeto de este trabajo es desarrollar marcadores moleculares que permitan llevar a cabo
selección asistida en programas de mejora. En particular, se tratará de detectar variabilidad para
la secuencia de genes implicados en la biosíntesis de alcaloides y tratar de correlacionar dicha
variación con la producción de diferentes alcaloides.
MATERIAL Y MÉTODOS
Para este estudio se utilizaron tres variedades de adormidera de distinto origen.
El DNA genómico se extrajo a partir de plantas en el estado de cuatro hojas utilizando el kit
DNeasy Plant Minikit (Quiagen), siguiendo el protocolo recomendado por la casa comercial.
Para la amplificación de genes específicos se diseñaron oligonucleótidos que reconocen
diferentes regiones dentro de cada secuencia. Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen final de 50 µl con Taq polimerasa de Bioprobe y con diferentes programas de amplificación según las características de los oligonucleótidos y la longitud de las regiones amplificadas. Los productos de PCR se trataron con ExoSAP-IT (Affymetrix) para eliminar el DNA
de cadena sencilla y los oligonucleótidos no incorporados. En algunos casos algunos productos de PCR se tuvieron que clonar antes de su secuenciación.
Para la obtención de secuencias repetidas se llevaron a cabo reacciones de PCR empleando primers comerciales (para RAPDs y SSRs). Estos productos de PCR se clonaron y secuenciaron.
Para la clonación se empleó el vector pCRII en la cepa bacteriana INV!F’ (Invitrogen).
La secuenciación se llevó a cabo en el Servicio de secuenciación Secugen del Centro de
Investigaciones Biológicas (CIB) del CSIC.
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ACTAS DE HORTICULTURA N.º 62
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se han logrado secuenciar tres tipos de secuencias. Secuencias repetidas, algunas de ellas
en tándem, que muestran una gran variación y pueden utilizarse directamente como sondas
para identificar cromosomas específicos de esta especie, así como para desarrollar marcadores
que permitan diferenciar variedades muy emparentadas. Del mismo modo, se han logrado
secuenciar regiones donde existen secuencias microsatélites que pueden emplearse para
desarrollar un primer mapa genético de esta especie y que potencialmente podrán utilizarse
para llevar a cabo programas de mejora asistida por marcadores. Por último se han secuenciado siete genes implicados en la ruta biosintética de alcaloides, dos de ellos en el inicio de la
ruta, el gen de la (S)-norcoclaurina 6-O-methyltransferasa (6OMT) y el gen de la (S)-norreticuline 7-O-methyltransferase (N7OMT) implicados en la síntesis de papaverina, un gen
relacionado con la reducción de al menos tres enzimas que actúan en pasos cercanos a la (S)reticulina, la NADPH:Citocromo P450 reductasa (P450R), y cuatro de ellos en la bifurcación
que da lugar a los opioides relacionados con la síntesis de morfina como el correspondiente a
la 7(S)-salutaridinol 7-O-acetyltransferasa (SalAT), el gen que codifica para la codeinona
reductasa (COR), el gen responsable de la codeine O-demethylase (CODM), el gen de la thebaina 6-O-demethylasa (T6ODM). Como cabría esperar la variabilidad encontrada entre las
variedades más emparentadas fue muy escasa. Sin embargo, se han encontrado un gran número de cambios, incluso en las regiones codificantes entra las variedades utilizadas para la producción de paja de adormidera y las variedades dedicadas a la extracción de opio. Este hecho
permitirá establecer si existe o no alguna relación entra la variación molecular de cada uno de
estos genes y la acumulación de alcaloides en la capsula.
REFERENCIAS
Boettcher, C., Fellemeier, M., Bottcher, C., Dräger, B., Zenk, M. B. 2005. How human neuroblastoma
cells make morphine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(24), 8495-8500.
Frick, S., Kramell, R., Kutchan, T. 2007. Metabolic engineering with a morphine biosynthetic P450 in
opium poppy surpasses breeding. Metabolic Engineering 9, 169-176.
Hagel, J.M., Facchini, P.J. 2010. Dioxygenases catalyze the O-demethylation steps of morphine biosynthesis in opium poppy. Nature Chemical Biology Volume:6, 273-275.
Kempe, K., Higashi, Y., Frick, S., Sabarna, K., Kutchan, T. 2009. RNAi suppression of the morphine
biosynthetic gene salAT and evidence of association of pathway enzymes. Phytochemistry 70,
579-589.
Ziegler, J., Brandt, W., Geissler, R. & Facchini, P. J. 2009.Removal of substrate inhibition and increase
in maximal velocity in the short chain dehydrogenase/reductase salutaridine reductase involved in
morphine biosynthesis. J. Biol. Chem. 284, 26758-26767.
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