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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS
ACADEMIA DE BIOTECNOLOGÍA
MANUAL DEL LABORATORIO DE INGENIERÍA GENÉTICA
ELABORADO POR:
Dr. Jesús Agustín Badillo Corona
Dra. María del Carmen Oliver Salvador
Dr. Claudio Garibay Orijel
IBt. César Agustín Jiménez Sierra
IBt. Hector Molina Jiménez
México D. F. Agosto 2009
Instituto Politécnico Nacional
Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología
Laboratorio de Ingeniería Genética Relación de prácticas
Titulo
Sesiones*
Transformación genética de plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) utilizando
Agrobacterium tumefaciens
13
1.
Preparación de material y medios de cultivo
2.
Cultivo de Agrobacterium en medio sólido
3.
Cultivo de Agrobacterium en medio líquido
4.
Preparación de Agrobacterium y modificación genética de N. tabacum
5.
Transferencia de explantes a medio de selección
6.
Preparación de material y medios de cultivo
7.
Transferencia de explantes a medio de selección fresco
8.
Transferencia de transformadas a medio para formar raíces
9.
Diseño de primers
10. PCR confirmatoria de la inserción del transgén
11. Análisis de productos de PCR en gel de agarosa
12. Análisis de resultados
13. Presentación y discusión de resultados
Análisis de la expresión de un gen exógeno en E. coli
a.
Preparación de medios de cultivo y material para la práctica
b.
Preparación de células competentes de E. coli BL21
c.
Transformación de las células de E.coli BL21 con el vector pET16b y
comprobación de la inserción de este
d.
Selección de células transformadas
e.
Inducción del gen gfp
f.
Separación de las proteínas en gel de poliacrilamida
g.
Análisis de resultados
h.
Presentación y discusión de resultados
8
*La sesiones necesarias para la realización de cada práctica no son necesariamente continuas.
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Jiménez Sierra y Hector Molina Jiménez
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Laboratorio de Ingeniería Genética Práctica 1
Transformación genética de plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) utilizando
Agrobacterium tumefaciens
1. INTRODUCCION
La modificación genética de plantas tiene varios objetivos, entre los que se encuentran: la
generación de especies resistentes a condiciones de estrés (sequía, estrés osmótico, etc.),
la mejora nutricional de la especies (aumento en el contenido de aminoácidos o
precursores de vitaminas, etc.), obtención de plantas para fitoremediación (remoción de
metales pesados), la obtención de variedades con flores de color no convencional, la
producción de alguna proteína o metabolito con propiedades terapéuticas (vacunas,
anticuerpos, alcaloides, etc.).
Esta última es de gran interés para los Ingenieros Biotecnólogos ya que la producción de
metabolitos y proteínas en plantas presenta varias ventajas en comparación con el resto
de los sistemas de producción. Algunas de estas ventajas son: el costo de producción es
en muchos casos menor, hay una mayor facilidad de escalamiento, proteínas más
complejas (anticuerpos, proteínas con varios enlaces disulfuro, proteína que requieren un
procesamiento postraduccional, etc.) pueden ser producidas. Adicionalmente, las semillas
y granos pueden ser utilizados como sitio de almacenamiento.
La modificación genética de plantas puede llevarse a cabo utilizando diferentes métodos
los cuales pueden ser químicos, físicos o biológicos. Entre los métodos químicos se
encuentra el método mediante el cual se permeabiliza la membrana con polietilenglicol
(PEG) con lo cual se facilita la introducción del material genético. Sin embargo, el
tratamiento con PEG tiene la desventaja de que requiere de protoplastos en lugar de
células con pared celular intacta (los protoplastos responden de manera menos eficiente
en cultivo in vitro). Entre los métodos físicos se encuentran principalmente la
microinyección y el bombardeo de micropartículas (también conocido como biobalística).
Este último, que consiste en la introducción del material genético al interior del núcleo
utilizando micropartículas aceleradas de oro o tungsteno, ha cobrado particular
importancia en la última década, a pesar del costo elevado, debido a que es altamente
efectivo y reproducible.
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Laboratorio de Ingeniería Genética A pesar de ello, el método por excelencia para la modificación genética nuclear de
plantas es el que utiliza Agrobacterium tumefaciens. A. tumefaciens y otras especies
relacionadas como A. rhizogenes y A. vitis, son patógenos no destructivos de plantas que
tienen la capacidad de integrar establemente parte de su material genético dentro del
genoma de su hospedero. El impacto de este hallazgo ha tenido grandes aplicaciones en
diversos campos de la biología vegetal, agricultura y biotecnología [1].
Desde el año 1970 hasta la fecha se ha estudiado a detalle el mecanismo por el cual A.
tumefaciens induce la formación de tumores en plantas y el conocimiento adquirido ha
sido fundamental para su uso como herramienta en la ingeniería genética de plantas.
Durante el proceso de infección A. tumefaciens introduce en la célula vegetal una parte de
su ADN (ADN de transferencia; T-DNA) el cual es integrado dentro del genoma de la
planta. Los genes del T-DNA son expresados en su hospedero e inducen la formación de
tumores y la síntesis de aminoácidos no proteicos llamados opinas los cuales son
utilizados por A. tumefaciens como fuente de carbono y nitrógeno. El T-DNA esta
localizado en el plásmido Ti (Plásmido inductor de tumor; tumor inducing plasmid), que
además contiene los genes vir que son necesarios para la transferencia e incorporación
del fragmento de ADN en el genoma de la planta. La especie A. rhizogenes produce el
crecimiento vigoroso de las raíces infectadas mediante un mecanismo semejante al de A.
tumefaciens. En este caso el plásmido que contiene el T-DNA es llamado Ri (plásmido
inductor de raíces; root inducing plasmid).
Un hallazgo crucial que permitió el diseño de vectores para la transformación
genética de plantas mediante el uso de especies de Agrobacterium es el hecho que sólo
las secuencias borde del T-DNA son requeridas para que la transferencia se lleve a cabo.
Algunos o todos los genes bacterianos del T-DNA pueden ser removidos originando
vectores desarmados, los cuales pueden transformar células vegetales sin los síntomas
generales de la infección bacteriana [3].
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo general

Conocer y aplicar la metodología para llevar a cabo la modificación genética
nuclear de Nicotiana tabacum (planta del tabaco) utilizando Agrobacterium
tumefaciens.
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Laboratorio de Ingeniería Genética 2.2 Objetivos específicos



Conocer el principio básico de la modificación genética nuclear de plantas
utilizando un vector binario.
Conocer y llevar a cabo la metodología básica para la obtención de plántulas
modificadas genéticamente.
Conocer y llevar a cabo la metodología para la identificación de plantas
modificadas genéticamente.
3. MATERIALES
3. 1 Materiales biológicos
•
•
•
•
Plásmido pROK CRE. Este plásmido es un derivado del plásmido pBIN 19, el
cual contiene el gen CRE fusionado a la secuencia del péptido de transferencia
RbcS y se encuentra bajo el control del promotor 35S. Contiene además el gen
nptII que codifica para la enzima neomicin fosfotransferasa la cual confiere
resistencia a kanamicina en las células portadoras del gen.
Cepa de A. tumefaciens LBA4404 que contiene en plásmido binario desarmado
que porta los genes vir.
Plantas de N. tabacum cultivadas en condiciones de asepsia en un cuarto de
cultivo a 25°C durante 4-6 semanas.
Primers para la amplificación total o parcial por PCR del gen nptII.
3.2 Equipos
•
Campana de flujo laminar, autoclave, potenciómetro, balanza analítica, agitadora
orbital, incubadora a 37°C, parrilla, micro centrifuga,
3. 3 Material de laboratorio
•
Matraces Erlenmeyer, vasos de precipitados de 250 mL, juego de micropipetas,
cajas Petri desechables, algodón, bisturí, pinzas de disección, papel filtro, papel
aluminio, tubos desechables de 1.5 mL, tubos desechables de 50 mL, un
horadador de 0.5 cm de diámetro.
3.4 Reactivos y medios de cultivos
•
•
Medio LB, Ampicilina 100 mg/mL, Carbamicilina 500 mg/mL, Kanamicina 100
mg/mL, etanol al 70%, solución de hipoclorito de sodio 5.5 % de cloro libre
(solución al 10% de cloro comercial), HCl 1.0 N, NaOH 1N, agua grado biología
molecular.
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Laboratorio de Ingeniería Genética 4. MÉTODOS
Primera sesión. Preparación de material y medios de cultivo
Preparar los siguientes materiales y reactivos (Ver anexos para composición de
soluciones y reactivos)
ampicilina 100 mg/mL
kanamicina 100 mg/mL
estreptomicina 100 mg/mL
carbamicilina 500 mg/mL
Medio LB
Medio NBM
5 cajas Petri con medio LB y antibióticos: kanamicina 25 µg/mL y estreptomicina
300 µg/mL.
5 cajas Petri con un disco de papel filtro que cubra toda la superficie
50 mL x 5 en matraces de 250 mL de medio LB liquido con antibióticos:
kanamicina 25 µg/mL y estreptomicina 300 µg/mL.
50 mL x 5 en matraces de 250 mL de medio MS0
5 cajas Petri con medio NBM sin antibióticos
5 cajas Petri con medio NBM con antibióticos: kanamicina 100 µg/mL y
carbamicilina 500 µg/mL.
Segunda sesión. Cultivo de Agrobacterium en medio sólido.
1. Tomar el stock de la cepa de A. tumefaciens LBA4404 y sembrar por estría
simple en una de las placas con medio LB con kanamicina y estreptomicina.
2. Control positivo. Inocular una cepa silvestre de Agrobacterium en otra placa con
medio LB con kan y estr.
3. Incubar ambas cajas a 28 ºC por 36-48 h.
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Laboratorio de Ingeniería Genética Tercera sesión. Cultivo de Agrobacterium en medio líquido.
1. Transferir una colonia de Agrobacterium a un matraz de 250 mL con 50 mL de
medio LB con kan 50 mg/L, estrep 300 mg/mL e incubar en agitación constante (200
rpm) a 28ºC durante 36-48 h.
Cuarta sesión. Preparación de Agrobacterium y modificación genética de N.
tabacum
1. Centrifugar el cultivo de A. tumefaciens obtenido como resultado del trabajo
experimental de la tercera sesión a 7500 rpm por 10 min a 4 ºC en un tubo de
estéril de 50 mL.
2. Decantar el sobrenadante
3. Resuspender la pastilla celular en 5 mL de MS0 (mantener en hielo).
4. Cortar 3-4 hojas de plántulas de tabaco cultivadas en condiciones de asepsia.
5. Colocar las hojas sobre el papel filtro contenido en las cajas Petri.
6. Cortar las hojas con el bisturí y pinzas (o con un horadador) para obtener
explantes de 0.5 cm x 0.5 cm aproximadamente. Realizar este paso de forma
rápida evitando dañar de manera excesiva el tejido.
7. Recuperar los explantes e incubarlos directamente en la suspensión de A.
tumefaciens agitando ocasionalmente durante 30 min.
8. Recuperar los explantes con unas pinzas, secar por contacto ligero en papel filtro
estéril.
9. Colocar en las cajas con medio NBM con la epidermis inferior hacia arriba.
Presionar ligeramente para que los explantes entren en contacto con el medio.
10. Incubar los explantes a 25 ºC con un fotoperiodo de 16 h luz durante 48 h.
Quinta sesión. Transferencia de explantes a medio de selección
1. Después de 48 h tomar los explantes (cuarta sesión) y transferirlos a las cajas de
Petri con medio NBM (kan 100 µg/mL, car 200 µg/mL). Tener cuidado de que los
explantes mantengan la misma orientación y de dañarlos lo menos posible.
2. Colocar las cajas en incubación a 25 ºC con un fotoperiodo de 16 h luz durante 34 semanas.
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Laboratorio de Ingeniería Genética Sexta sesión. Preparación de material y medios de cultivo
1. Preparar el siguiente material:
Medio NBM
5 cajas Petri con medio LB y antibióticos: kanamicina 25 µg/mL y estreptomicina
300 µg/mL.
5 cajas Petri con un disco de papel filtro que cubra toda la superficie
50 mL x 5 en matraces de 250 mL de medio LB liquido con antibióticos:
kanamicina 25 µg/mL y estreptomicina 300 µg/mL.
50 mL x 5 en matraces de 250 mL de medio MS0
5 cajas Petri con medio NBM sin antibióticos
5 cajas Petri con medio NBM con antibióticos: kanamicina 100 µg/mL y
carbamicilina 500 µg/mL.
Séptima sesión. Transferencia de explantes a medio de selección fresco
a. Después de 4 semanas, transferir los explantes a medio fresco NBM con
kanamicina 100 µg/mL. Tener cuidado de mantener la misma orientación y de no
dañar el tejido. Si los explantes se han expandido mucho y son demasiado
grandes, transferirlos a dos cajas.
Octava sesión. Transferencia de transformadas a medio para formar raíces
a. Conforme vayan apareciendo, transferir los brotes resistentes a kanamicina a
medio MSB5 con kanamicina (100 mg/ml) y carbamicilina (200 mg/ml) para
favorecer la formación de raíces.
Novena sesión. PCR confirmatoria de la inserción del transgén
a. Tomar una porción de brote no mayor a 1 mm e incubarla con 20 µL de solución
(2 µL buffer 10X, µL dNTP 2mM, 2.5 µL de primer F (3pm/ µL), 2.5 µL de
primer R (3pm/ µL), 3 µL MgCl2 25mM, 1 µL Taq pol 1u/µmol y 7 µmol agua).
Realizar estos pasos en hielo.
b. Realizar la PCR bajo las siguientes condiciones: 1 ciclo de 5 min a 94 °C, 35
ciclos de 30s a 94°C, 30 s a 55°C, 30s a 72°C y 1 ciclo de 5 min a 72°C.
c. Almacenar a -70°C o a -20°C.
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Laboratorio de Ingeniería Genética Décima sesión. Análisis de productos de PCR en gel de agarosa
a. Prepara un gel de agarosa al 1% siguiendo las instrucciones dadas por el profesor.
b. En el pozo número 1 del gel correr el marcador de peso molecular
c. Correr el producto de PCR obtenido en la novena sesión en un gel de agarosa al
1%.
d. Correr también controles negativos y positivos a la par.
e. Teñir el gel con Rojo Texas.
Undécima sesión. Análisis de resultados
Esta sesión será dedicada al análisis de resultados de forma grupal con la moderación del
profesor.
Duodécima sesión. Presentación y discusión de resultados
Presentación y discusión de los resultados por parte de los estudiantes de forma grupal.
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Laboratorio de Ingeniería Genética 5. Cuestionario y recomendaciones para el informe
1-. Mencionar 5 recomendaciones para la elaboración de primers.
2-. ¿Qué primers se utilizaron en la práctica? Y ¿cuál es el objetivo de su uso en la
presente práctica?
3-. ¿Qué es el T-DNA?
4-. Mencionar 5 componentes básicos del sistema binario de vectores utilizado en la
práctica
5-. Mencionar otros métodos de transformación de plantas así como sus ventajas y
desventajas.
6-. ¿Cuál es el objetivo de modificar genéticamente las plantas?
7-. ¿Logró transformar plántulas de N.tabacum? ¿Cómo se observan estas
fenotípicamente en comparación con las líneas silvestres? ¿Cómo se observa esto en el
gel de electroforesis?
8-. ¿Cuál es el objetivo de realizar una PCR en la práctica?, ¿podría eliminar este paso?,
¿bajo que condiciones?
El informe de la práctica debe contener los resultados de los todos los equipos y hacer la
discusión y conclusiones de los experimentos realizados.
6. BIBLIOGRAFIA.
[1] Valderrama Fonseca A. M ; Arango Isaza R. ; Afanador Kafuri L. Transformación de
plantas mediada por Agrobacterium: “Ingeniería genética natural aplicada”.
Rev.Fac.Nal.Agr.Medellín.Vol.58, No.1.p.2569-2585.2005.
[2] Tzfira, t.; Vaidya, m. and Citovsky, V. Increasing plant susceptibility to
Agrobacterium infection by overexpression of the Arabidopsis nuclear protein VIP1.
Proceedings of the Natural Academy of Sciences USA. Vol. 99, No.16 (2002); p.1043510440.
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Laboratorio de Ingeniería Genética [3] Garfinkel, D. J. et al. Genetic analysis of crown gall: fine structure map of the TDNA
by site-directed mutagenesis. Cell. Vol. 27 (1981); p. 143-153.
[4]Bioline. HyperLadder I. Bandas de referencia para un gel de 1% agarosa.
www.bioline.com/images/guides/ladderguide/HL1_PopUp.jpg Consulta: 14/Junio/2009
[5] Hansen, G. and Chilton, M-D. Lessons in gene transfer to plants by a gifted microbe,
in Current Topics in Microbiology and Immunology (Vol. 240), Plant Biotechnology
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Análisis de la expresión de un gen exógeno en E. coli
1-. INTRODUCCION
La producción de proteínas para diversas aplicaciones ha ido en aumento, pasando de la
escala experimental hasta la industrial, en algunos casos. Para ello se han estudiado y
desarrollado diversos sistemas de expresión. De todos estos, los sistemas de expresión
bacterianos son los más atractivos debido a su rápido crecimiento con alta densidad en
sustratos de bajo costo, genomas ampliamente caracterizados y un creciente número de
vectores y cepas hospederas mutantes (Terpe 2006).
E. coli y sistema de expresión T7
El sistema bacteriano más utilizado es el que emplea a Escherichia coli, en especial E.
coli BL21 la cual es usada principalmente para la producción de proteínas dado que es
una cepa ampliamente estudiada, además posee algunas características en su genotipo
que la hacen idónea para dicho propósito, dentro de las que destacan las siguientes:
 lon: deficiente en esta proteasa que degrada las proteínas heterólogas
 ompT negativa degrada proteínas extracelulares
 F- incapaz de generar una sola hebra de DNA
 gal: deficiente en el metabolismo de galactosa
 dcm: deficiente en metilación de citocinas
 Posee un gen de RNA pol T7
Con las propiedades antes mencionadas y aprovechando la expresión de la RNA pol T7
se puede emplear en conjunto con esta cepa un vector que posea un promotor del mismo
bacteriófago (T7), por lo cual el sistema de vectores pET son la opción adecuada para
introducir transgenes de interés.
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Laboratorio de Ingeniería Genética Vectores pET
Es una familia de vectores derivada del plásmido pBR322. Poseen una secuencia
consenso de alta afinidad a la T7 Pol, y de muy baja afinidad a la polimerasa de E. coli.
El gen de interés esta clonado después de esta región promotora, por lo que su expresión
en cepas que carecen de la polimerasa del bacteriófago T7 es sumamente baja.
Cuando se conjuga una cepa como BL21 y un plásmido de la familia pET se tiene alto
control sobre la expresión de la proteína de interés pues esta solamente es inducida
cuando se añade al medio de cultivo un inductor del operón lac. Generalmente se utiliza
un inductor “gratuito” como el IPTG.
2-. OBJETIVOS
2.1-. General:
•
Expresar un gen exógeno en una cepa de E. coli BL21.
2.2-. Específicos:
•
•
•
•
•
Preparar células competentes de E. coli BL21
Transformar células competentes con el plásmido pET16b
Seleccionar células transformadas por cultivo en medio con penicilina
Inducir la expresión de transgén.
Detectar la proteína de interés en PAGE.
3-. MATERIAL
3.1-. BIOLOGICOS:
Cepa E.coli BL21, vector pET16b con el gen de la proteína verde fluorescente gfp de
Aquea victoria.
3.2-. EQUIPOS
Autoclave, cámaras para electroforesis en gel de agarosa, centrifuga, agitadora de
matraces, incubadora a 37°C
3.3-. MATERIAL DE LABORATORIO
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Laboratorio de Ingeniería Genética Matraces, micropipetas y puntas, cajas petri, tubos eppendorf de 0.5 mL y de 1.5 mL,
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Laboratorio de Ingeniería Genética 4. METODOLOGÍA
Sesión 1. Preparación de medios de cultivo y material para la práctica.
Preparar el siguiente material:
•
•
•
•
4 matraces de 250 mL con 50 mL de medio LB
2 tubos de 25 mL con 5 mL de medio LB
500 mL de Cloruro de Calcio 0.1 M.
Tubos de 1.5 mL y de 0.5 mL y puntas estériles de 200 µL y 1000 µL
Sesión 2. Preparación de células competentes de E. coli BL21
Uno de los pasos cruciales en cualquier metodología de Biología Molecular es la
obtención de células competentes, listas para poder amplificar plásmidos o para sobre
producir proteínas de interés. El método para hacer células competentes por cloruro de
calcio es uno de los más rutinarios y eficientes, además de ser extremadamente barato.
1. Incubar E. coli a 37°C por 16 h en placas de agar LB
2. Transferir una colonia de E. coli a 5 mL de medio LB e incubar a 37°C con agitación
a >200 rpm durante toda la noche (12-16 h).
3. Transferir 0.5 mL del cultivo a 50 mL de medio LB e incubar a 37°C con agitación,
hasta que la densidad óptica a 590 nm sea de 0.3 a 0.4 (aproximadamente 3-4 horas)
4. Transferir 50 mL de células a un tubo de propileno frío y estéril y mantenerlo por 10
min a 4°C.
5. Centrifugar a 6000 rpm por 10 min
6. Decantar el sobrenadante
7. Resuspender el paquete celular en 25 mL de CaCl2 estéril (0.1 M, frío)
8. Colocar el tubo en hielo durante 10 min a 4°C.
9. Centrifugar a 6000 rpm por 10 min a 4°C.
10. Decantar el sobrenadante
11. Con la ayuda de una pipeta pero con extremo cuidado, resuspender el paquete celular
en 1-2 mL de CaCl2 estéril (0.1 M, frío).
12. Las células competentes pueden ser usadas inmediatamente o almacenadas por 24-48
h a 4ºC.
13. Para periodos de almacenamiento más largos, guardar en alícuotas de 100 µL en
tubos estériles de 1.5 mL.
14. Guardar la células competentes a -70ºC. Las células se mantienen viables por
aproximadamente 3 meses.
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Laboratorio de Ingeniería Genética Sesión 3. Transformación de las células de E.coli BL21 con el vector pET16b y
comprobación de la inserción de este.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Tomar una alícuota de células competentes y dejar descongelar en hielo.
Manteniendo las células en hielo, adicionar 1-5 µL del vector.
Mezclar suavemente con la punta de la pipeta.
Mantener en hielo por 5-10 min.
Opcional: Transferir el tubo a un baño de agua a 42°C por 30 s.
5 a. Adicionar 1 mL de medio rico en nutrientes SOC.
5 b. Incubar por 1 h a 37°C con agitación suave.
Tomar 100 µL de las células competentes y sembra por extensión con varilla en
medio LB suplementado con el antibiótico adecuado.
Si se realizó el paso 5, tomar 50, 100 y 200 µL y sembrar igual que en el paso 6.
Incubar las cajas a 37°C durante toda la noche (12-16 h).
Llevar a cabo los controles correspondientes
Sesión 4. Selección de células transformadas.
1.
2.
3.
4.
Hacer observaciones de las cajas Petri. Poner especial atención a los controles.
Almacenar las cajas a 4°C hasta el momento de usarlas
Tomar una colonia y transferirla a un tubo con 5 mL de medio LB con ampicilina
100 µg/mL.
Incubar los tubos en agitación durante toda la noche (12-16 h) con agitación
constante (>200 rpm) a 37°C
Sesión 5. Inducción del gen gfp
1. Transferir 0.5 mL del cultivo obtenido en la sesión 4 a 50 mL de medio LB (Amp
100 µg/mL) en matraces de 250 mL.
2. Incubar los matraces en agitación durante 4-5 h con agitación constante (>200
rpm) a 37°C.
3. Después de 4-5 h tomar una muestra de 1 mL
a. Centrifugar por 5 min a 7500 rpm a temperatura ambiente
b. Desechar el sobrenadante
c. Congelar la pastilla celular a -20°C hasta su uso posterior
4. Después de tomar la muestra, adicionar IPTG 1 mM y continuar incubando los
matraces en agitación durante 6 h con agitación constante (>200 rpm) a 37°C.
5. Tomar y procesar muestras cada hora como se describe en el paso 3.
6. Después de 6 h esterilizar y desechar el cultivo
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Laboratorio de Ingeniería Genética Sesión 6. Separación de las proteínas en gel de poliacrilamida
1. Preparar el gel de poliacrilamida siguiendo las instrucciones recibidas.
2. Adicionar 5-10 µL del buffer de carga directamente a las muestras congeladas.
3. Mezclar suavemente y hacer un orificio en la tapa del tubo
4. Incubar por 5-10 min a 95°C en un baño de agua o en un termobloque
5. Retirar del calor y colocar inmediatamente en hielo durante 10-15 min.
6. Centrifugar brevemente para colectar la muestra en el fondo del tubo.
7. Cargar en los pozos del gel.
8. Correr el gel a 70 mA hasta que el buffer de carga llegue casi a la base del gel.
9. Desmontar el equipo
10. Colocar el gel en una solución de azul de Coomassie durante toda la noche.
Sesión 7. Análisis de resultados
Esta sesión será dedicada al análisis de resultados de forma grupal con la
moderación del profesor.
Sesión 8. Presentación y discusión de resultados
Presentación y discusión de los resultados por parte de los estudiantes de forma
grupal.
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Laboratorio de Ingeniería Genética 5-. CUESTIONARIO Y RECOMENDACIONES PARA EL INFORME ESCRITO
1. ¿Qué características tiene la cepa de E.coli BL21
2. Mencione como funciona el sistema de vectores PET y que ventajas tiene en
comparación con otros vectores
3. ¿Cuál es el peso molecular de la proteína codificada?
4. ¿Qué es el IPTG?
5. Una vez que adicionó IPTG a la muestra, ¿Qué paso con la biomasa?, aumento,
diminuyó, permaneció igual ¿cómo puede confirmarlo?
6. Incluir en su informe, al menos un artículo, reciente, sobre el tema
7. ¿Cuál sería el comportamiento observado en el gel, si se continuara con la cinética?
En una producción de una proteína recombinante X, cuyo material genético es insertado a
la célula por un sistema de vectores PET, según lo experimentado ¿cuál es el tiempo
recomendado para inactivar a las células? ¿Porqué?
6. BIBLIOGRAFÍA
1-. Terpe Kay (2006). Overview of bacterial expresión systems for heterologous protein
production: from molecular and biochemical Fundamentals to comercial systems.
Microbiol Biotechnol.
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Laboratorio de Ingeniería Genética ANEXO I
Medio Luria Bertani (LB) .
Extracto de Levadura 5 g/L
Triptona de Caseína 10 g/L
Cloruro de Sodio 10 g/L
pH 7.0
Medio SOC
Extracto de Levadura 5 g/L
Triptona de Caseína 20 g/L
Cloruro de Sodio 0.5 g/L
Cloruro de potasio 2.5 mM
pH 7.0
Después de esterilizar adicionar 20 mL/L de glucosa 1 M (filtrado 0.22 µm).
Antibióticos
Estreptomicina
Kanamicina
300 mg/ml
25 mg/ml
Ampicilina
100 mg/ml
Carbamicilina
200 mg/ml
Medio Base Murashigue y Skoog (MS)
MS I ( Macronutrientes )
mg/L
NH4NO3
1650
KNO3
1900
CaCl2.2H2O
440
MgSO4.7H2O
370
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Laboratorio de Ingeniería Genética KH2PO4
170
MS II ( Micronutrientes )
IK
0.83
H3BO3
6.2
MnSO4.4H2O
22.3
ZnSO4.7H2O
8.6
NaMoO4.2H2O
0.25
CuSO4..5H2O
0.025
CoCl2.6H2O
0.025
MS III ( Fe- EDTA )
EDTA
37.3
FeSO4.7H2O
27.8
MS0
Medio Base MS
Sacarosa
pH
30 g/L
5.5
MSB5
Medio MS0
Inositol
Piridoxina
Tiamina
Ácido Nicotínico
pH
1 mg/L
0.1 mg/L
2 mg/L
0.1 mg/L
6
NBM
Medio MSB5
Ácido Naftalen Acético (NAA)
0.1 mg/L
Benzil Aminopurina (BAP)
1 mg/L
pH
5.9
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Laboratorio de Ingeniería Genética ANEXO II
PROCEDIMIENTOS DE SEGURIDAD
En Biología Molecular se emplean algunos reactivos químicos peligrosos, por esta razón
el frasco que contiene el reactivo, deberá llevar una etiqueta que describa la naturaleza de
riesgo y los procedimientos de seguridad que deberán seguirse, cuando se trabaja en un
laboratorio con técnicas de Biología de Molecular.
Los químicos peligrosos se pueden clasificar en tres categorías:
Solventes orgánicos. Uno de los disolventes orgánicos más peligroso, que se emplea en
Biología Molecular, es el fenol. Este es altamente corrosivo y puede causar quemaduras
severas; cuando se emplee este reactivo se deben utilizar guantes y lentes de seguridad,
su manejo debe hacerse en campana de extracción.
Mutágenos y carcinógenos. La mayoría de los químicos que se unen al DNA son
mutágenos y/o carcinógenos. Un ejemplo es el bromuro de etidio empleado para la
detección del DNA en geles de agarosa.
Químicos tóxicos. En el laboratorio de Biología Molecular se emplea la acrilamida, este
compuesto puede tener efectos neurotóxicos (si hay contacto con la piel o por inhalación.
Otro químico con el que se debe tener sumo cuidado es el laurel sulfato de sodio (SDS).
Al pesar SDS se recomienda usar una mascara al terminar de pesar limpiar bien la
balanza, ya que los cristales se dispersan fácilmente.
El manejo adecuado de cualquier compuesto tóxico reduce notablemente su peligrosidad.
Por lo que se recomienda usar siempre guantes; al medir soluciones con pipeta, nunca
deberá hacerse con la boca, para este fin se recomienda el uso de una propipeta y si por
accidente se tiene contacto con alguno de estos compuestos en la piel, el área afectada
debe lavarse con agua en abundancia y se informará de inmediato al encargado del
laboratorio.
Los desperdicios conteniendo los químicos peligrosos mencionados se deben depositar en
contenedores apropiados y no mezclarse con los desechos comunes. Y se debe tomar en
cuenta las siguientes indicaciones:
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Laboratorio de Ingeniería Genética 1. Es importante usar un sistema para el manejo adecuado de residuos contaminados con
bromuro de etidio (EtBrom) tanto sólidos o líquidos. No se deben desechar junto con los
demás desechos. Y sobre todo es importante jamás calentar el bromuro de etidio. El
buffer de electroforesis se puede re usar pero jamás usar este para preparar la agarosa
pues ya contiene EtBrom. Se recomienda usarlo únicamente cuando sea estrictamente
necesario. Y en lugar de este, usar otros reactivos para tinción de DNA en geles como:
SYBR
Green,
SYBR
Safe,
Gel
Red
o
Syber
Gold.
2. La disposición de la acrilamida debe de ser en forma similar. Y de preferencia la
acrilamida que se compre debe de ser ya disuelta, en una solución al 30 % que solo
requiere ser diluida. Con lo que se ahorran todos los problemas de pesarla cuando esta en
polvo y disminuye los riesgos de toxicidad. Aun ya polimerizada hay siempre residuos
que son tóxicos, por lo que jamás debe de ser tocada con las manos.
Bibliografía
Sambrook, J. & D. Russel 2001. Molecular Cloning Book 1. 3ra. ed., Cold Spring Harbor
Laboratory Press USA
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