1
Download Haga clic aquí para ver el archivo - OCW-UMH
Document related concepts
Transcript
Prrácticcas [GENÉTIICA MOLEECULAR] [María R Rosa Poncce Molet] [G GRADO E N BIOTEC CNOLOGÍA A] G GENÉTICA M MOLECULAR R Área de G Genética Universiddad Migueel Hernández Departam mento de Biología Aplicada Grrado en Biotecnolog gía Curso 2012-13 NOMBRE : Grupo: Feccha: PRÁCTIC CA 1: OP PERONES Problema: Genotipo os Activid ad enzimáticca Enzima 1 Enzima 2 Con Co Sin SSin on efe ector efeector efecctor efector Tipo de opeerón: Operador: Gen estructtural (enzim a 2): Ennzima 3 Con Sin efectorr efector Gen regulador: Gen estructural (enzima 1): Gen estructura (enzima 3): Problema: Genoti pos Enzima 1 Con SSin effector efeector Tipo de opeerón: Operador: Gen estructtural (enzim a 2): Activiidad enzimáttica Enzima 2 Ennzima 3 Co Sin Con Sin on efecctor efector efectorr efector Gen regulador: Gen estructural (enzima 1): Gen estructura (enzima 3): GEENÉTICA MO OLECULAR Problema: Enzima 1 Con SSin effector efeector Genoti pos Tipo de opeerón: Operador: Gen estructtural (enzim a 2): Activiidad enzimáttica Enzima 2 Ennzima 3 Co Sin Con Sin on efecctor efector efectorr efector Gen regulador: Gen estructural (enzima 1): Gen estructura (enzima 3): Problema: Activiidad enzimáttica Enzima 1 Enzima 2 Ennzima 3 Co Sin Con Sin Con SSin on Genoti pos effector efeector efecctor efector efectorr efector Tipo de opeerón: Gen regulador: Operador: Gen estructural (enzima 1): Gen estructtural (enzim a 2): Gen estructura (enzima 3): página 3 GENÉTICA MOLECULA AR Área de G Genética Universiddad Migueel Hernández Departam mento de Biología Aplicada G Grado en Biotecnolo B ogía Curso o 2012-13 NOMBRE : Grupo: Feccha: PRÁ CTICA 2: MUTAC CIÓN Y REEPARACIÓN DEL ADN CR RONOGRAM MA 1 2 3 1.- Ensayo o de detecc ción de mu utágenos a mbientales s 1.1.- Siem mbra de las estirpes 1.2.- Anál isis de los resultados r 2.- Mecan ismos de reparación n de los d daños prod ducidos en n el DNA p por irradiación n con luz ultravioleta u a 2.1.- Siem mbra de las estirpes 2.2.- Anál isis de los resultados 3.- Mutaci ones espo ntáneas. Experiment E to de Luria y Delbrück k 3.1.- Siem mbra de las estirpes 3.2.- Anál isis de los resultados Primera pa rte: Ensayo de detección de mutágeenos ambien ntales En el ambientee existen numerosos ageentes químiccos y físicoss capaces dee alterar la información m (mutágenoss ambientale es). La acum mulación de m mutaciones somáticas a genética prroduciendo mutaciones lo largo de la vida de u un individuo es una de laas principale es causas del desarrollo de tumoress, por lo quee bilidad de un u ensayo de deteccióón de com puestos potencialmentte mutagéniicos resulta la disponib sumamentee importantee. El eensayo más u utilizado parra la deteccióón de mutággenos fue de esarrollado hhace cuatro décadas porr el profesorr estadounid dense Bruce Ames y se conoce, po or ello, como “test de Ames”. Se trata de un método sen ncillo, rápido o y barato qu ue utiliza esttirpes auxót rofas para la a histidina dee la bacteria a Salmonella a typhimurium m, portadoraas de mutacciones de pé rdida de fun nción en gen nes esencialees para la biosíntesis dee este aminoáácido (muta ciones his ‐ ). La mutagen icidad de un n compuesto o se determinna analizand do la tasa dee reversión d e la mutació ón his ‐ , analizando la cappacidad del p presunto mu utágeno de i ncrementar la aparición pe auxótrofa a de Salmonnella en med dio sin histid dina. Para ppotenciar la sensibilidad de coloniass de la estirp del ensayo, las estirpess utilizadas (BA13 y TA988, entre otraas) son también portado ras de una d deleción quee ón de nucleótidos (NER ) y a un gen n adyacentee incluye al ggen uvrB, deel sistema de reparaciónn por escisió implicado een la biosínttesis de biottina. Ademáás, la presen ncia de la mutación m rfa,, que afecta a a la pared bacteriana, incrementa la permeab ilidad de la estirpe TA98 8 a ciertos co ompuestos vvoluminosos. Un elevado por centaje de m mutágenos ssegún los ressultados de este ensayo bacteriano (que cuenta con varias versiones, entre ellass la que in cluye enzim mas de híga ado de mam mífero para simular el metabolism mo humano)), son tamb bién carcinóógenos. En esta prime era parte, eevaluaremos el efecto o mutagénico o de dos co ompuestos químicos, q la azida sódicca (NaN 3 ) y el peróxidoo de hidróggeno (H 2 O 2 ),, utilizando l as estirpes aauxótrofas de Salmonell a typhimuriu um BA13 y T TA98, portaddoras de muttaciones his ‐ que reviert en por disti ntos mecanismos. La az ida sódica s e emplea co omo conservvante de medicamentos, fungicida, herbicida y y como propelente (ggenera N 2 ) e n la fabriccación de airbags, pe ero a altass concentraciiones es tóx ica. página 4 GEENÉTICA MO OLECULAR La m mutación hiisG46 de la estirpe BA113 es una trransición TA A→CG que ssus tuye un residuo dee leucina (CT C) por otro de prolina (CCC) en la A ATP fosforrib bosiltransferasa, enzima que cataliza a la primera reacción dee la ruta dee biosíntesis de histidin a. La mutacción hisD305 52 en TA98 es una dele eción de un nucleótido que producee un cambio (desfase) e n la pauta d e lectura del ARNm del gen hisD que codifica la deshidroge nasa de hist idina que cataliza las doos últimas et apas de la ru uta biosintéttica. upo recibirá seis cajas de e Petri con m medio de culltivo mínimo o suplementaado con biottina y trazass Cada gru de histidi na. Se emp plearán cultivos bacteriianos que se s encuentra an en la fa se estacionaria que see n en cajas d e Petri con la ayuda de bolitas de vidrio, v para que la distriibución de las bacteriass sembrarán sea homo génea. on 100 μl del cultivo de lla estirpe BA A13 .................................................. .......... Sembrar ttres cajas co 0 μl del cultivvo de TA98 ......................................................... .......... Sembrar otras tres c ajas con 100 eraremos ha sta que la suuperficie de las cajas de Petri se seqque, momento en el quee A contin uación, espe os las bolita s de vidrio siguiendo lass instruccion nes del profe esor ............................... .......... retiraremo s rotulará indicando el número de l grupo, la fecha y el noombre de la estirpe quee Cada ca ja de Petri se contiene: Caja Estirppe Sustancia a añadida al disco 1 2 3 4 5 6 do pinzas esttériles, se co olocará un ddisco de pap pel de filtro estéril en el centro de cada c caja dee Utilizand Petri . mo, dispensaaremos con una micropi peta las sigu uientes sustancias sobree los discos de papel dee Por últim filtro (añaadiendo cadaa sustancia a a una caja seembrada con n BA13 y a ottra caja sem brada con TA A98): 0 l de H O e estéril (contr rol) ............. ................... ................... ................... .................. 10 .......... 2 100 l de azida sódica (2,5 mg/ml) . ................................................................................. .......... da 50% (H 2 O 2 ) ........................................................................ .......... 100 l de de ag ua oxigenad s de Petri se incubarán d durante 66 h oras a 37°C en la estufa .................................... .......... Las cajas histidina? ¿Qué sig nifica que laas estirpes BA13 y TA98 son auxótro fas para la h mos un medio o En el testt de Ames, cuando probamos la capaccidad mutagénica de una sustancia, ¿ppor qué usam mínimo supleementado con n trazas de hisstidina? página 5 GENÉTICA MOLECULA AR e en las cajas qque llevan el d disco impregn nado en H2O2?? ¿Por qué aaparece un haalo de muerte o agua como ccontrol? ¿Por qué vvemos coloniaas en las cajass en las que heemos añadido mpuestos evaluados, ¿cuál o cuáles han resultado ten ner capacidad mutagénica? De los com o de mutaciones producen?? ¿Qué tipo Explica brevemente qué es un desfasse. Segunda paarte: Mecan ismos de re eparación dee los daños producidos en el ADN por irradiacción con luzz ultravioletaa e los daños produ ucidos en el La ccélulas pose en múltiples mecanismoos de reparaación para eliminar DNA por lo os diversos agentes mu utagénicos aa los que esstán expuesttas, algunoss de ellos parcialmentee redundantees. La integrridad del ma aterial genéttico depend e del funcio onamiento ccorrecto de todos estoss sistemas dee reparación y la deficiencia en alguuno de ellos se traduce e en un increm mento en la sensibilidad de la célula o el organissmo correspondiente a ddeterminado os agentes m mutagénicos. í en el La lluz ultraviolleta (UV) ess un potentee mutágeno que producce lesiones de diversa índole material geenético (prin ncipalmente, la formaciión de díme eros de pirim midinas) quee distorsionan la doblee hélice y pu uede provoccar la muerrte celular ppor colapso de la replicación. En procariotass, los dañoss provocadoss por la luz UV se reparan por los sistemas d e reparación n por fotorrreactivación y por NER, fundamentaalmente. Mucchos de los mecanismoss de reparacción están c onservados en la evolu ción, como el NER, quee en la espe cie humanaa constituye e la vía prinncipal de e liminación de d las lesioones provocadas por la arios de los ggenes de estta ruta provo ocan enferm medades gravves, como la radiación U V. Las muta ciones en va UV, por lo q ue los indiviiduos que la xeroderma pigmentosa , que produce hipersenssibilidad a laa radiación U pensos a dessarrollar cán ceres de piel cuando se exponen a la luz solar. padecen so n extremadaamente prop omparar la seensibilidad y capacidad repa aradora de la estirpe silvesstre SV3 y unaa El objetivo de esta práctica es co onella typhimu urium tras la irrradiación con n una dosis de e luz ultravioleeta de 4000 μ μJ/cm2. estirpe mutaante de Salmo upo recibirá dos cultivo os de Salmonnella typhim murium, corrrespondientees a la estirrpe silvestree Cada gru SV3 y a u una estirpe mutante, a una densid ad óptica d e 1 (medida a a 550 nm ). Esta denssidad óptica correspon nde, aproxim madamente, a a 10 9 célulass por mililitr o de cultivo .................................... .......... upo realizarrá tres diluciones suceesivas de caada cultivo,, transfirienndo a tuboss eppendorff Cada gru estériles l os volúmenees que se ind dican en la t abla: página 6 GEENÉTICA MO OLECULAR Paso Factor d de dilución Número o de célula s por ml Volume n de cultivo o (μl) o anterior del paso Volume n de med io LB (μl) Volume n total (μl) 0 1 110 9 1 10 2 10 7 2 10 4 10 5 3 10 5 10 4 10 10 100 990 990 900 1000 1 1000 1000 Las célul as se sembr arán en las ccajas de Petrri con la ayu da de bolitas de vidrio, para que la distribución de las baccterias sea h omogénea. de Petri (sin ampicilina) con 100 μl d de la dilución n 3 de la est irpe silvestr e SV3 . Sembrarr tres cajas d r tres cajas d de Petri (con n ampicilina) ) con 100 μl de la dilució ón 3 de la est tirpe mutantte ...... Sembrar A contin uación, espeeraremos ha sta que la suuperficie de las cajas de Petri se seqque, momento en el quee os las bolita s de vidrio siguiendo lass instruccion nes del profe esor ............................... .......... retiraremo s rotulará indicando el número de el grupo, la fecha, f el noombre de la estirpe quee Cada caj a de Petri se o: contiene yy el tratamieento recibido Caja Estirrpe Tratamiento 1 Nin guno (se incuba a 37°C).. SV3 Luz u ltravioleta (4000 μJ/cm 22 ). SV3 Se cubre inmediatamente con pa pel de 2 nio alumin y se incuba a 37°C. Luz u ltravioleta (4000 μJ/cm 22 ). 3 ne a luz visible durante 11 hora SV3 Se expon y se incuba a 37°C. 4 ante Nin nguno (se inccuba a 37°C) Muta Luz u ltravioleta (4000 μJ/cm 22 ). ante Muta Se cubre inmediatamente con pa pel de 5 nio alumin y se incuba a 37°C. Luz u ltravioleta (4000 μJ/cm 22 ). 6 ante ne a luz visible durante 11 hora Muta Se expon y se incuba a 37°C. úmeros 1 y 4)) si los cultivoos iniciales ( a a partir de loss ¿Cuántas colonias espeerarías observvar en las cajaas control (nú nían 109 célulaas por mililitro o? cuales se hicieron las dilucciones) conten página 7 GENÉTICA MOLECULA AR e los cultivos expuestos a luz visible y los irradiados s sólo con luz ultravioleta?? ¿Se apreccia alguna difeerencia entre ¿Qué mecanismo de reparación podría ser el respon sable de la differencia observada? Razonna tu respuestta. ¿Se obserrva alguna difeerencia entre las cajas de laa estirpe silvesstre SV3 y las de la estirpe mutante? q explique los resultadoos observado os. ¿Qué enzima podría esstar dañada en la estirpee Propón un hipótesis que mutante? Glosario es pañol‐ingléss nada agua oxigen ATP fosforr ibosiltransfeerasa auxótrofo ( adjetivo) auxótrofo ( sustantivo) azida sódicaa biotina cambio en lla pauta de llectura, desffase carcinógeno o deshidroge nasa pirimidinas dímero de p ensayo de A Ames fotoliasa fotorreactivvación hígado hipersensib bilidad histidina leucina mamífero medio míni mo mutación so omática mutación mutación p untual mutagénico o mutágeno prolina reparación por escisión n de nucleótiido reversión ruta biosinttética página 8 hydrogen peeroxide A ATP phospho oribosyltransferase auxotrophicc auxotroph sodium azid de biotin fframeshift carcinogen dehydrogen ase pyrimidine d dimer A Ames test photolyase photoreactivvation liver hypersensitiivity histidine leucine mammalian minimal me dium somatic muttation mutation point mutat ion mutagenic mutagen proline nucleotide eexcision repa air reversion biosyntheticc pathway GEENÉTICA MO OLECULAR Área de G Genética Universiddad Migueel Hernández NOMBRE : Departam mento de Biología Aplicada Graado en Bio otecnologíía Curso o 2012-13 Grupo: Feccha: PRÁCTIC CA 2: MU UTACIÓN N Y REPARACIÓN DEL ADN N (cont.)) Tercera parte: M utacione es esponttáneas. Exxperimen nto de Luuria y Delbrück. La eestirpe SV3 de Salmonella typhimurrium es porttadora de una mutaciónn en el gen araD que la incapacita para catalizzar la conversión de LL‐ribulosa‐5‐‐fosfato a D‐xilulosa‐5‐ D fosfato, en la ruta dee n de la araabinosa. La acumulaciónn de la L‐riibulosa‐5‐fossfato es tóxxica para la a bacteria y y degradación provoca su muerte celu ular, por lo q que SV3 es ssensible a laa presencia d de arabinosaa en el medio de cultivo o c se inocula un eelevado núm mero de células en meedio con arrabinosa, see (Ara S ). Sin embargo, cuando nias resistenttes (Ara R ). E l fenómeno se debe a la a aparición, een la muestrra inicial, dee observan allgunas colon mutantes q ue han perd dido la sensibilidad a araabinosa y, e n consecuen ncia, puedenn crecer en ssu presencia y originar c olonias. o un punto de vista neo odarwinista, las mutacio ones que confieren resi stencia se producen p dee Bajo forma aleattoria y espon ntánea, inde ependientem mente de la p presencia o ausencia dee arabinosa e en el medio. El cultivo een presenciaa de arabino osa sólo eviddencia la exxistencia de los mutantees resistentes, que dan lugar a collonias. Los partidarios de la adapttación here ditaria postulada por LLamarck, intterpretación hubiesen sosstenido que las bacteriaas adquieren la resistenccia a la arabinosa, y porr opuesta a l a anterior, h otro compuesto, como coonsecuencia de la presencia de éstaa en el medio o de cultivo,, extensión aa cualquier o transmitien ndo a sus desscendientes la resistenc ia. Luriia y Delbrü ck publicaron en 19433 un sencil lo experime ento que prrueba la va alidez de la interpretac ión neodarw winista y que constitu ye el motivvo de la presente prááctica. No hay h ninguna pretación, y su gran traascendencia se puso dee evidencia eexperimenta l posterior que refute dicha interp manifiesto al otorgarlee a los dos investigadoores el Prem mio Nobel de d Fisiologíaa o Medicin na en 1969,, o. fundamentaalmente por este trabajo PROTOCO OLO Tress días ante s del comie enzo de la práctica se toma con un asa de cultivo una colonia dee Salmonella typhimurium m SV3 de una u caja de Petri y se resuspende en 5 ml dde tampón Tris‐sales. T A A ón, se prepa ra una serie e de dilucionnes: 50 μl de e esta suspensión de cé lulas se dilu uyen hasta 5 5 continuació ml, nuevam mente con taampón Tris‐sales; despuéés se toman 0,2 ml de e esta segundaa suspensión n, se inocula con ellos 1000 ml de me dio mínimo (tampón Tri s‐sales, gluccosa y requerimientos) yy se agita. La mitad de la suspensión (50 ml) se divide en 16 6 tubos (“cuultivos peque eños”), y la otra mitad se coloca en n un matrazz (“cultivo gr ande”). Los 17 recipientes se incubaan con agitacción, durante 3 días, a 3 7°C. upo de alum mnos recibirá á un tubo epppendorf co on 1,2 ml de el cultivo grrande (50 ml) y 4 tuboss Cada gru eppendorff con 0,4 ml m de cada uno u de los cultivos peq queños. Usa ando bolitass de vidrio, cada grupo o sembrará:: on 100 μl deel cultivo graande) ............................................... .......... 4 caajas de Petri (cada una co on 100 μl dee un cultivo p pequeño distinto) ........................... .......... 4 caajas de Petri (cada una co Las cajas dee Petri conti enen medio mínimo sóliido supleme ntado con arabinosa y ccon glicerina en lugar dee glucosa. La suspensión de células d debe extendeerse uniform memente sob bre la superfficie de las ccajas, que see nte tres días.. incubarán aa 37°C duran página 9 GENÉTICA MOLECULA AR Notta: Como co ntrol de la sensibilidad s a la arabino osa de la estirpe SV3, see puede sembrar en una caja de Pet ri con medio o mínimo con arabinosa y glicerina y en otra co on medio mínnimo con só ólo glicerina. or estría una colonia en ccada una de las dos cajas de Petri. Para ello see siembra po upo de alum nos realizará á el recuentoo de las colo onias de las cajas de Pettri, indicando el número o Cada gru de coloniaas resistentees que han aparecido en las cajas se mbradas a p partir de los cultivos peq queños y del cultivo graande. Los re sultados se anotarán enn la Tabla 1 .......................................................... .......... entes de loss A contin uación se caalculará por separado laa media y laa varianza de los recuenntos procede del grande, ccombinando los resultad dos obtenido os por cuatroo grupos disstintos (A‐D) cultivos p equeños y d ........ Tabla 1.‐ Número de colonias resistentes presentes en las cajas d e Petri Cultivos C Cultivo Grup Grup Número de Número de grande o o colonias pe equeños colonias 1 A B 16 cajas 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 A B C C D página 100 2 D 15 16 Media Media Varianzaa Varianza GEENÉTICA MO OLECULAR Área de G Genética Universiddad Migueel Hernández Departam mento de Biología Aplicada G Grado en Biotecnolo B ogía Curso o 2012-13 NOMBRE : Grupo: Feccha: PRÁCT TICA 3: M MUTAGÉN NESIS DIR RIGIDA Crronogram ma 1 Mutagénessis dirigida d del fragmentto lacZα del gen de la β‐‐galactosidasa 1.‐ Síntesis de las caden nas mutante es 2.‐ Prepara ción de un ggel de agarossa y electrofforesis de loss productos de la reaccióón 3.‐ Digestio on de las mo léculas parentales con D Dpn I 4.‐ Transforrmación de lla estirpe DH H5α 5.‐ Siembraa en placas d de Petri de la as células so metidas a trransformació ón 6.‐ Análisis de los resulttados obten idos 2 3 4 DÍA 1 da del fragm mento lacZα del gen de la a β‐galactossidasa Primera pa rte: Mutagé nesis dirigid Durrante buena parte del siglo XX la dissección gené ética de la fu unción de lo s genes ha ttenido como o punto de partida la inducción i y el aislamieento de mu utantes. En las últimass tres décadas se han desarrollad o procedimiientos, basados en la Inngeniería ge nética, que permiten assignar una función a un gen, alteran ndo de form ma específica a su secuenccia y estudiaando el feno otipo asociaddo a la pertu urbación. La mutagénes is dirigida se lleva a cabo c in vitrro, sobre m oléculas de ADN clonaadas, por métodos m quee permiten e stablecer el número y la a posición dde los nucleó ótidos que serán modificcados. La PC CR ha hecho o relativamen nte sencilla yy versátil estte tipo de m utagénesis. En eesta prácticaa, realizarem mos un expe rimento de mutagénesiss dirigida ba sado en el p protocolo dee un kit comeercial (QuikC Change Site‐D Directed Muutagenesis), d de la empresa estadoun idense Strattagene, quee emplea la t écnica de la PCR para introducir mu taciones en la secuencia a de un plásm mido. Para llevar a cabo o la mutagén esis se utilizza una polim merasa term oestable co n actividad exonucleasaa 3’→5’ y un na pareja dee cebadores (oligonucleó ótidos sintétticos) compl ementarios entre sí, qu ue contienenn la mutació ón deseada. Las molécu las que sirveen de molde e (parentaless) pueden diistinguirse de las sinteti zadas por la a polimerasa (mutantes) porque lass primeras están metiiladas con el patrón característicco de Esche erichia coli, organismo d del que se o btuvo el plá smido. Esta característicca se emplea a para la elim minación de las cadenass parentales, utilizando l a restrictasa a DpnI que a ctúa específficamente so obre el ADN metilado. Cada grupo realizzará dos exp perimentos dde mutagéne esis dirigida, empleandoo cada alumn no del grupo o un plásmid o distinto, el pBluescript II SK(‐) yy el pWhite escript‐4.5 kb, que derivva del primero. Amboss contienen eel fragmento o lacZ del ggen lacZ, cuyya expresión puede inducirse mediannte la adición de IPTG al medio de ccultivo. El g en lacZ cod difica la enz ima ‐galacctosidasa, qu ue catalizaráá in vitro una reacción colorimétricca, convirtieendo el gala actósido X‐G Gal, que es incoloro, en n un produccto de colorr azul. En el primer expeerimento, see introducirá á una mutacción en el pl ásmido pBlu uescript II SKK(‐) con el propósito p dee inactivar el fragmento lacZα. En el segundo ex perimento sse intentará revertir la m mutación que inactiva el fragmento lacZα del plásmido p pW Whitescript‐44.5 kb. Se e mpleará la estirpe DH55α de E. coli, capaz dee producir la complemen tación con n el productoo del fragme ento lacZ del plásmido.. página 1 1 GENÉTICA MOLECULA AR o en cuenta que el plásm mido pBluesccript II SK(‐) porta una ccopia funcionnal del fragm mento lacZα α Teniendo (véase el m apa del Apé ndice 1), utiilizado tradiccionalmente e en la seleccción blanco‐‐azul de transformantes,, ¿qué color tendrán las colonias de la estirpe D DH5α transfo ormadas con n pBluescrippt II SK(‐) si se siembran en presenciia de IPTG y X‐Gal? mos el fragm ento lacZα m mediante muutagénesis dirigida? ¿De qué color serán las colonias si inactivam do pWhitesccript‐4.5 kb porta una copia c inactivva del fragm mento lacZα,, ¿qué colorr Dado qu e el plásmid d la estirp pe DH5α traansformadass con pWhitescript‐4.5 kb si se siembran en tendrán lass colonias de presencia d de IPTG y X‐G Gal? nias si reverrtimos la mutación m del fragmentoo lacZα pressente en el ¿De quéé color seráán las colon plásmido pW Whitescript‐‐4.5 kb mediante mutagéénesis dirigid da? Para inactivvar el fragm mento lacZα del gen de la β‐galacto osidasa, pressente en el plásmido pBluescript II SK(‐), utilizaaremos los ssiguientes ce ebadores: pBS‐1: 5´‐C CCATGATTAC CGCCAAGCGCGTAATTAA ACCCTCAC‐3´ pBS‐2: 5´‐G GTGAGGGTTTAATTACGCG GCTTGGCGTA AATCATGG‐3 3´ bador pBS‐1 hibrida co on la repressentada en la Figura 1 o con su Indica s i la secuen cia del ceb ntaria. ¿Existte alguna differencia entrre la secuen cia del cebad dor pBS‐1 y la del plásmido? complemen bador pBS‐2 hibrida co on la repressentada en la Figura 1 o con su Indica s i la secuen cia del ceb complemen ntaria. ¿Existte alguna differencia entrre la secuen cia del cebad dor pBS‐2 y la del plásmido? ebador pBS‐ 2? ¿Qué rel ación existe entre la seccuencia del ccebador pBS ‐1 y la del ce 1 con ayuda a de la tablaa del código genético (A Apéndice 2). ¿Qué pauta a de lectura Complet a la Figura 1 debe corre sponder al producto del fragmentto lacZα? ¿Q Qué tipo de e mutación introducirem mos con loss cebadores p pBS‐1 y pBS‐‐2? página 122 GEENÉTICA MO OLECULAR Fig ura 1.‐ Secu uencia parcia al del plásm ido pBluescrript II SK(‐), ccorrespondieente a la reggión que codifiica el fragme ento lacZα 5'‐ C A G G G A A A C A G C T A T G A C C A T G A T T A C G C C A A G C ‐3 ' 5'‐ G C G G C A A T T A A C C C T C A C T A A A G G G A A C A A A A G C ‐3 ' 5'‐ T G G G A G C T C C A C C G C G G T G G C G G C C ‐3' nte en el p lásmido pW Whitescript‐4 4.5 kb, utilizzaremos loss siguientess Para reverttir la mutacción presen cebadores: pWS‐1: 5´‐‐CCATGATTA ACGCCAAGCG GCGCAATTAA ACCCTCAC‐3 3´ pWS‐2: 5´‐‐GTGAGGGTTTAATTGCGC GCTTGGCGTTAATCATGG‐ 3´ or pWS‐1 hibbrida con la secuencia re epresentadaa en la Figura 2 o con su Indica si la secuenciaa del cebado complemen ntaria. ¿Existte alguna differencia entrre la secuen cia del cebad dor pWS‐1 yy la del plásm mido? or pWS‐2 hibbrida con la secuencia re epresentadaa en la Figura 2 o con su Indica si la secuenciaa del cebado complemen ntaria. ¿Existte alguna differencia entrre la secuen cia del cebad dor pWS‐2 yy la del plásm mido? ¿Qué rel ación existe entre la seccuencia del ccebador pWSS‐1 y la del ccebador pWSS‐2? página 1 3 GENÉTICA MOLECULA AR 2 con ayuda de la tabla del código genético (Apéndice 2). ¿Qué tipo de d mutación Complet a la Figura 2 contiene laa secuencia del plásmiido pWhitesscript‐4.5 k b? ¿Qué am minoácido i ntroducirem mos con loss cebadores p pWS‐1 y pW S‐2? 5'‐ C Figu ura 2.‐ Secu encia parcia al del plásmiddo pWhitesccript‐4.5 kb, correspondiiente a la región que contiene una m mutación en el fragmentto lacZα A G G G A A A C A G C T A T G A C C A T G A T T A C G C C A A G 5'‐ G C G G T A A T T A A C C C T C A C T A A A G G G 5'‐ T G G G A G C T C C A C C G C G G T G G C G G C C ‐3' C ‐3 ' A A C A A A A G C ‐3 ' 1.‐ Síntesis de las cade nas mutante es Cada estudiante preparará una reaccióón de sínte sis, eligiend do uno de los moldes [10 ng del plásmido pW Whitescript‐‐4.5 kb o de el plásmido pBluescript II SK(‐)] y lo os cebadoress correspondientes. Lass reacciones se llevarán a cabo en un volumen dde 20 l, en un tubo de pared fina dde 200 l. Se e utilizará la polimerasa PfuTurbo, que q se suministra a unna concentraación de 1 U/l. El tam mpón de la polimerasa PfuTurbo deebe diluirse 10 veces, da ado que se eencuentra a una concenttración 10x. Las concenttraciones dee los cebadorres y del mo lde se expresan en esta práctica en ng/l. Cada estudiante caalculará, en prrimer lugar, loos volúmeness necesarios p para obtener llas concentraciones finaless indicadas en n la tabla sigu uiente. No se e iniciará el eexperimento hasta h que loss cálculos hayyan sido corregidos por ell profesor. e 1,5 ml: Mezcla een un tubo e ppendorf de Compon nente Volumen ( l) Concen ntración finaal página 144 Tampón n 10x (sin MggCl 2 ) Mezcla de dNTP 10xx Mezcla de cebadore es 25 ng/l Plásmid o (molde) 5 ng/l Polimer asa PfuTurbo o 1 U/l H 2 O (ha sta 20 l) Total 1x 1x 2,5 ng/l 2 l 0,05 U/l 20 GEENÉTICA MO OLECULAR 0,2 ml . .......................... .......... Transfierre la mezcla de reacción a un tubo dde PCR de paared fina de 0 Coloca e l tubo en el termociclador, con el sigguiente proggrama: 95° C, 30 s 12 cciclos: 95°C, 30 s; 55°C, 1 min; 72°C,, 5 min (1 miin/kb) 4°C , ∞ Las reaccio ones serán recogidas r po or el professor y se co nservarán en un congeelador a ‐20 0°C hasta la siguiente seesión de labo oratorio. polimerasa coon actividad exxonucleasa 3’→5’? ¿Por qué ees necesario eemplear una p mplementaria?? ¿Qué cadeena se sintetiizará a partir del cebador ppBS‐1 (o pWS‐1), la mostrada en las figuuras o su com ¿Qué cadenaa se usará com mo molde? mplementaria?? ¿Qué cadeena se sintetiizará a partir del cebador ppBS‐2 (o pWS‐2), la mostrada en las figuuras o su com ¿Qué cadenaa se usará com mo molde? ón debe enco ontrarse el pplásmido uti lizado como molde? Razzona tu respuesta ¿En qué conformació es (molde) y y las sintetizzadas por la polimerasa ¿Existe aalguna difereencia entre las molécul as parentale PfuTurbo? mentará el núm mero de molé culas durante e la reacción? Razona tu resspuesta. ¿A qué rittmo se increm DÍA 2 2.‐ Prepara ción de un ggel de agarosa y electrofforesis de lo os productoss de la reaccción Pesar 0,55 g de agaro sa y depositarlos en un matraz de 2 50 ml . ............................................. .......... t de electroforeesis (TAE 1xx, preparado a partir de una Añadir 550 ml de tampón disolució ón madre 50 0x) ........................................................................................................... .......... p calentam miento en unn horno miccroondas. De ebe interrum mpirse el Disolver la agarosa por calentam miento cada vez que la d disolución enntre en ebulllición ............................................... .......... bar que la agarosa a se ha h disuelto completame ente y que no se han fformado Comprob burbujass en la disolu ución ....................................................................................................... .......... arosa durantte 5 minutoss a temperattura ambientte ........................ Dejar en friar la disol ución de aga Sellar los s portageles s con cinta ad dhesiva ................................................................................. .......... página 1 5 GENÉTICA MOLECULA AR Colocar eel peine sob re el portageles . ...................................................................................... .......... Añadir 1 ,25 l de SaffeView a 50 ml de la disoolución de a garosa . ............................................ .......... uavemente l a disolución n y verterla en el portaggeles, en do onde polime rizará al Agitar su enfriarsee ................ .................. ............................................................................................. .......... n gel consisttente, se rettirarán con ccuidado el peeine y la Una vez que se hayaa formado un cinta ad hesiva ........ .................. ............................................................................................. .......... on tampón d de electroforresis . .................... Introduc ir el portageeles en la cubeta, cubrie ndo el gel co Tra s la solidificcación del ge el, se preparrarán muest ras de 12 l por pocillo . Para cada muestra, see mezclarán, en un tubo eppendorf de 1,5 ml: 100 l de la meezcla de reacción, ..................................................................................... .......... l de tampó n de carga 6 6x . .......................................................................................... .......... 2 mezcla de re eacción (10 l) se mante endrá en hielo . ................................ .......... El resto de la m odas las mu uestras y el marcador dde peso mol ecular en su us corresponndientes Cargar to pocillos del gel, ano tando cuidadosamente eel número d e cada pocillo y el conteenido de las muesstras (véase el patrón de bandas deel marcador de peso mo olecular en laa página siguientee) ............... .................. ............................................................................................. .......... Calle Muestra 1 Marcado or de peso m molecular 2 Reacción n con pBluesscript II SK(‐ ) (grupo 1) 3 Reacción n con pWhit escript‐4.5 kkb (grupo 1) 4 Reacción n con pBluesscript II SK(‐ ) (grupo 2) 5 Reacción n con pWhit escript‐4.5 kkb (grupo 2) 6 Reacción n con pBluesscript II SK(‐ ) (grupo 3) 7 Reacción n con pWhit escript‐4.5 kkb (grupo 3) 8 Reacción n con pBluesscript II SK(‐ ) (grupo 4) 9 Reacción n con pWhit escript‐4.5 kkb (grupo 4) nte de alimeentación, collocando el de color rojo (ánodo; Conectarr los electro dos a la fuen +) en el extremo opu uesto a aqué él en el que sse cargaron las muestras . .................................. .......... n marcha la fuente de a limentación,, regulándol a a un voltaje constantee de 100 Poner en V . ......... .................. .................. ............................................................................................. .......... min, se proccederá a visu ualizar el AD DN mediante e el transilum minador ultrravioleta Tras 30 m (312 nm ) de un docu umentador d de geles, obtteniendo unaa fotografía del gel . ......................... .......... página 166 GEENÉTICA MO OLECULAR nte, se pegaará en esta guía la fottografía del gel, interpretándola taal como Finalmen explicaráá el profesorr . ................ ............................................................................................. .......... ¿Coincideen los tamañoss observados con los esperrados? 3.‐ Digestió ón de las mo oléculas pare entales con D DpnI Para elimin nar selectivaamente los plásmidos ppWhitescript ‐4.5 kb y pBluescript III SK(‐), utilizados como o moldes en las reaccio nes anteriores, realizarremos una digestión en nzimática coon la endon nucleasa de e restricción Dpnl. Estaa enzima reeconoce una a secuencia específica de d 4 pares de bases enn el ADN (ssu diana de e restricción)), en la que l os residuos de A están m metilados: ↓ 5’‐‐G me A T C C‐3’ 3’‐‐C T me A G G‐5’ ↑ Emp pleando la micropipeta de 20 l, se mezclaráán en un tu ubo eppendoorf de 1,5 ml, m para un volumen fin nal de 15 l,, los siguientes compon entes de la mezcla de digestión, d inddicando en cada c caso la realización de cada uno o de los paso os: 1,5 l . .......................................................... Ta mpón 10x p ara DpnI En 10 U/l) nzima (DpnI; 1 l . ............................................................. anterior) DN (del paso 10 l ........................................................... AD O l . ............................................................. H 2 TO OTAL .......... .................. ...... l damente los component es de la dige estión, . ............... cerrar el tubo y mezcclar adecuad me ediante su a gitación en ................... .......................... (vórtex), .... un agitador su centrifuga ación breve min) en una microfuga . .. .......................... (durante 1 m y s página 1 7 GENÉTICA MOLECULA AR La digestió n se incubaará durante una hora, a 37°C, en una estufa a. Los tuboss de las diggestiones see n en un conggelador a ‐20 0°C hasta la siguiente se esión de práccticas. conservarán mezcla de digestión con DpnI se inic ió a las horas y minutos. La incubaación de la m digestión finalizó a las horas yy min nutos. La incubaación de la d n las molécula as sintetizadass por la polimerasa PfuTurb bo? ¿Por qué no se digieren DÍA 3 4.- Trans sformació ón de la estirpe e DH H5α Trass la digestió ón de las cadenas c del molde, la cadenas sin ntetizadas d eben transfferirse a un hospedado r bacteriano o adecuado, tal como la eestirpe DH5 de Escheriichia coli. birá 1 tubo eppendorf e coon 150 l de e células DH H5 competeentes. Estas células han Cada grupo recib DN exógeno. sido somet idas a un trratamiento químico parra incremen tar su capacidad de inccorporar AD ormará una alícuota de células DH5 5 con los productos de la digestión n enzimática Cada estud iante transfo n el paso antterior, tal co omo se descrribe a contin nuación: realizada en r de digestión aa un tubo e ppendorf co on 50 l dee células Añadir 11 l de la reacción competeentes DH5 . .................. ............................................................................................. .......... os en hielo durante 20 m min, junto co on un tercer tubo eppenddorf con Incubar llos dos tubo 50 l dee células com mpetentes DH5 D a las qque no se haa añadido AD DN exógenoo, que se usarán ccomo contro l . ................ ............................................................................................. .......... t a un choque térm mico, mante eniéndolos durante d 90 s en un Someter todos los tubos baño a 442°C . ........... .................. ............................................................................................. .......... Incubar llos tubos en hielo duran te 5 min ................................................................................ .......... do una mic ropipeta de e 1000 l, añadir 800 l de medio líquido LB (sin Utilizand antibiótiico) a cada u uno de los tres tubos . ............................................................................... .......... los tubos a 3 37°C con agittación (225 rpm) durant e 30 min . ......................................... .......... Incubar l ambios bruscoos de temperaatura? ¿Por qué ssometemos laas células a ca C durante 30 m min en medio o LB sin antibió ótico? ¿Por qué incubamos los tubos a 37°C de Petri de la as células soometidas a ttransformación 5.‐ Siembraa en placas d Trass la incubaciión de los cu ultivos del a partado ant erior, cada g grupo recibi rá 2 placas d de Petri quee contienen m medio LB só ólido. El medio de las pplacas de Pe etri está sup plementado con ampicilina, IPTG y y X‐Gal, que se utilizarán n para la se elección de colonias blaancas/azules. Se utilizarrán como co ontroles una ntada con am mpicilina y ootra que no ccontiene este antibióticoo. placa de Pe tri suplemen página 188 GEENÉTICA MO OLECULAR na de las placcas de Petri cuya compo osición se inddica en la Ta abla: Cada mu estra se ino culará en un Ampiccilina IPTG X‐Gal Muestra SÍÍ SÍ 500 l dell cultivo de ccélulas some etidas a tran sformación con la reacción 1 SÍ SÍÍ 500 l dell cultivo de ccélulas some etidas a tran sformación con la reacción 2 SÍÍ NO 300 l dell cultivo de ccontrol (célu ulas no someetidas a tran sformación) NO O NO 300 l dell cultivo de ccontrol (célu ulas no someetidas a tran sformación) do una micr opipeta de 1000 l, aññade a cadaa placa de Petri P el voluumen de Utilizand SÍ SÍ NO NO inóculo o indicado en e la tabla anterior, y sigue las i nstruccioness del professor para esparc irlo uniform memente sob bre la super ficie del me edio de cultiivo empleanndo para olitas de vidrrio estériles .............................................................................................. .......... ello bo u estufa a 37°C, dejjándolas Tras su inoculación , coloca lass placas dee Petri en una ue se evapor e el agua co ndensada en n la tapa ....................... .......... entrea biertas para permitir qu después e in cúbalas boc a abajo a 37°C. . ............................... .......... Cierra la s cajas de Peetri 15 min d DÍA 4 6.‐ Anális is de los re esultados obtenidoss Exa mina los cul tivos inocula ados el día aanterior y re sponde las ssiguientes prreguntas: de DH5α en la placa de ccontrol que no contiene ampicilina?? ............................. ¿Apareceen colonias d ¿Qué pu ede concluirrse de la obsservación de la placa de control que no contienee ampicilina?? de DH5α en la placa de ccontrol que contiene am mpicilina? . ..................... ............. ¿Apareceen colonias d mpicilina? ¿Qué pu ede concluirrse de la obsservación de la placa de control que contiene am o trras las transsformaciones con las ddigestiones enzimáticas, e , Para el rrecuento dee colonias obtenidas divide c ada una de las placas de Petri qu e contienen n ampicilina, IPTG y X‐G Gal, en cuattro sectoress e colonias bllancas y azu les presente es en cada unno: circularees y cuenta eel número de página 1 9 GENÉTICA MOLECULA AR Apéndic e 1: Map pa del vecctor pBlu escript II SK(‐) (Reproducid do de: http:///www.geno omics.agilentt.com/files/M Manual/212205_A01.pd f) Primera posición página 200 G Cy ys (C) Cy ys (C) Stop S Trp p (W) Arrg (R) Arrg (R) Arrg (R) Arrg (R) Se er (S) Se er (S) Arrg (R) Arrg (R) Gly (G) Gly (G) Gly (G) Gly (G) U C A G U C A G U C A G U C A G Tercera posición Apéndice 2 : El código ggenético estándar Se gunda posic ión U C A Phe (F) Ser (S) Ty r (Y) Phe (F) Ser (S) Ty r (Y) U Leu (L) Ser (S) Sttop Sttop Leu (L) Ser (S) Leu (L) Pro (P) Hiss (H) Hiss (H) Leu (L) Pro (P) C Gln n (Q) Leu (L) Pro (P) Gln n (Q) Leu (L) Pro (P) Ile (I) Asn n (N) Thrr (T) Asn n (N) Ile (I) Thrr (T) A Lyss (K) Ile (I) Thrr (T) Lyss (K) Met (M) Thrr (T) Val (V) Ala (A) p (D) Asp Asp p (D) Val (V) Ala (A) G Glu u (E) Val (V) Ala (A) Glu u (E) Val (V) Ala (A) Glosario es pañol‐ingléss (palabras n nuevas) site‐direected mutag enesis mutagénesiis dirigida metilado methylaated exonucleease exonucleasaa GEENÉTICA MO OLECULAR Área de G Genética Universiddad Migueel Hernández NOMBRE : Departam mento de Biología Aplicada G Grado en Biotecnolo B ogía Curso o 2012-13 Grupo: Feccha: PRÁCTIC CA 3: SUPUESTO Se d desea introd ducir una mutación en la secuenciaa mostrada en e la figura,, que corressponde a un fragmento d del gen araD D de Salmone ella typhimuurium. Dispo nemos para ello de los ssiguientes ce ebadores: araaD‐1: ATAATCGACGCCGG GACGGCTAAA ATCACCAGTA ACG araaD‐2: CGTACTGGTGATTT AGCCGTCCG GGCGTCGATT TAT n ayuda de l a tabla del código genéético estánd ar, debe determinarse: (a) la pauta a de lectura Con que corres ponde a la proteína AraD, A (b) la posición de d la proteíína donde ddeseamos in ntroducir la ación sobre lla secuencia de la proteíína. mutación, yy (c) el efect o de la muta página 2 1 GENÉTICA MOLECULA AR 5'‐ T A A A G C G A A G C G C C A T C C G G C A G G G A G A A A A A C A A ‐3 3' 5'‐ T G TT T G A A A G A T C T C A A A C G C C A G G T A C T G G A A G ‐ 3' 5'‐ C T A A A T C T G G C G C T G C C A A A A C A C A A CC C T G G G T C A ‐3' ‐ 5'‐ C C C C T T A C C T G G G G T A A C G T T A G C G C C G T C G A T C ‐3 3' 5'‐ G C G G A A C G C G G C G T A C T G G T G A T T A A G G C C G T T C C G ‐3' ‐ 5'‐ G C G G T C G A T T A T A G C G T C A T G A C C G C T G A C G A T A ‐3 3' 5'‐ T G G G T G G T G G T C A G C C T G G A G A G C G G T G A A G G T C G ‐ 3' 5'‐ T T G G A A G G T C A T A A G A A A C C G T C G T C CC G A T A A C G C ‐3 3' 5'‐ C A A A C C C A A C C G T T C T G T T G T A C C A G G C A TT T T C C C G A ‐3' página 222 GEE NÉTICA MO O LECULAR página 2 3
