Download Licenciatura en Bioquímica. Curso 2005-2006. Genética

Licenciatura en Bioquímica. Curso 2005-2006. Genética microbiana.
Examen final. 14 de Febrero de 2006.
Nombre..............................................................
Contesta cada pregunta en los espacios reservados, utilizando letra
clara escrita con tinta (no a lápiz). No utilices abreviaturas. Puedes
emplear los reversos de cada hoja como borrador. No desgrapes el
examen.
Puede utilizarse todo tipo de material de consulta (libros, apuntes, etc)
Calificación sobre 25 puntos totales
1) Varios investigadores están comentando la posibilidad de utilizar
el análisis genético de microorganismos en sus futuros trabajos.
Todos ellos investigan la separación de cromosomas durante la
meiosis. Uno plantea la posibilidad de realizar el análisis genético de
ese proceso en Escherichia coli, otro se decanta por Saccharomyces
cerevisiae y un tercero por Neuróspora crassa. ¿Quién crees que
está más acertado en su elección? Razona la respuesta indicando las
posibles ventajas y desventajas de cada uno de esos organismos
modelo para realizar ese estudio en concreto. (3 puntos)
•E. coli no realiza meiosis
•S. cerevisiae y N. crassa sí hacen meiosis y tienen una genética
bien desarrollada
•N. crassa produce ascas (octadas) ordenadas, lo que facilita más
información sobre el desarrollo de la meiosis. Es la mejor
elección
2) Te propones averiguar qué genes están involucrados en la
transformación natural de una estirpe bacteriana recientemente
aislada.
a) ¿Cómo ensayarías la transformación para saber, por ejemplo, si
un mutante puede o no ser transformado de forma natural? (2
puntos)
1.-Conseguir un marcador genético seleccionable. Por
ejemplo una resistencia a antibiótico.
2. Optimizar las condiciones de transformación utilizando
un silvestre y el DNA de un resisitente
3. En esas condiciones, ensayar la transformabilidad del
mutante
b) ¿Qué harías para conocer el número de genes de esa
bacteria implicados en la transformación natural? (2
puntos)
1. Realizar una mutagénesis, a ser posible con un transposón
que lleve un marcador de resistencia a un antibiótico
2. Detectar los mutantes que no transformen utilizando el
ensayo puesto a punto. Emplear una estrategia de
contraselección con penicilina para enriquecer.
3. Aislar los genes afectados en cada mutante y comprobar si
el alelo silvestre de dichos genes, introducido en un
plásmido conjugativo, complementa los otros mutantes.
4. Los grupos de complementación así definidos nos indican
el número de genes implicados, si la mutagénesis ha sido
saturante.
c) ¿Cómo aislarías los genes implicados para determinar su
secuencia? (2 puntos)
Se realiza una genoteca de cada mutante en un plásmido de E. coli y se
selecciona el marcador del transposón.
Las secuencias adyacentes al transposón constituyen la del gen
afectado.
3) La empresa farmacéutica en que trabajas, estudia la producción de
una nueva droga útil para la lucha contra el SIDA. Se trata de un
metabolito poco conocido que es excretado en pequeñas cantidades
por una estirpe de Bacillus. Como biotecnólogo de la empresa, te
encargan la optimización de la producción de dicha droga hasta
conseguir una excreción al menos cien veces superior. ¿Qué
estrategia utilizarías? Si se te ocurren varias, compáralas en términos
de oportunidad y priorízalas. (5 puntos)
Posibles estrategias:
a) Caracterizar la ruta de síntesis, aislar su genes, estudiar su
regulación, identificar los pasos limitantes, hacer ingeniería
genética
b) Optimizar las condiciones de cultivo de la cepa silvestre para
maximizar la producción
c) Mutagénesis de la cepa silvestre y asilamiento de mutantes
superproductores
Un biotecnólogo empezaría por la b, pondría en marcha la c e intentaría
convencer a la empresa para que financiara la a.
4) En un hospital han aislado un nuevo patógeno. La caracterización
taxonómica indica que se trata de Lactobacillus bulgaricus una
bacteria de las utilizadas corrientemente para hacer yogurt. La nueva
estirpe patógena, con capacidad para infectar humanos y conejos,
porta un plásmido no hallado en las estirpes conocidas de
Lactobacillus bulgaricus.
a. ¿Cómo podríamos averiguar si ese plásmido es el causante de la
patogenicidad? (3 puntos)
Curar el plásmido y comprobar si pierde patogenicidad, utilizando el
conejo como sistema experimental.
Adicionalmente , intentar transferir el plásmido a una cepa no
patógena de L. bulgaricus y ensayar su patogenicidad en el conejo.
b) En caso de que la patogenicidad no dependiese del plásmido,
¿cómo analizarías su origen? (3 puntos)
En ese caso debe haber genes cromosómico implicados.
Aislar mutantes no patógenos, utilizando el conejo como modelo
experimental. Identificar los genes afectados y comparar su
secuencia en las bases de datos para intentar deducir su origen.
5) Un equipo que investiga el mal de Bush, una raro síndrome hereditario
que reduce severamente la capacidad intelectual, ha localizado el gen
cuya mutación produce la enfermedad. Su secuencia es muy homóloga a
otro gen presente en el genoma de Saccharomyces cerevisiae, cuya
función se desconoce y que han bautizado como BSH1 (de Bush
syndrome homologous). Con la esperanza de avanzar en su
conocimiento, los investigadores han obtenido el mutante bsh1∆ de
Saccharomyces, que presenta una deleción completa de BSH1. El
mutante bsh1∆ no presenta fenotipo alguno, por lo que el trabajo
realizado hasta ahora no ha aportado información útil para comprender
las bases moleculares de la enfermedad. Pero, lejos de arredrarse, los
investigadores quieren utilizar el mutante bsh1∆ como punto de partida
para obtener información útil sobre la función de BSH1. ¿Qué tipo de
estrategia experimental seguirías tú en su lugar? (5 puntos)
Aislar mutaciones que produjeran letalidad sintética con bsh1∆ e
identificar los genes afectados. Éstos, si tienen funciones conocidas,
nos acercarán al proceso molecular en el que esté implicado BSH1.
Licenciatura en Bioquímica. Curso 2006-2007.
Genética microbiana. Examen. 1 de Febrero de 2007.
1) Varios investigadores están interesados en llevar a cabo estudios sobre los
mecanismos de la transformación bacteriana mediante análisis genético. Uno
plantea la posibilidad de realizar el análisis genético de ese proceso en
Escherichia coli, otro se decanta por Bacillus subtilis y un tercero por
Neisseria gonorrhoeae. ¿Quién crees que está más acertado en su elección?
Razona la respuesta indicando las posibles ventajas y desventajas de cada
uno de esos organismos para realizar ese estudio en concreto. (3 puntos)
E. coli no se transforma de manera natural, por lo que sería una pésima
elección
B. subtilis presenta transformación natural y acepta cualquier tipo de DNA.
N. gonorrhoeae se transfroma de manera natural pero sólo capta DNA que
incluya una secuencia altamente específica, que está presente en su propio
genoma. Este hecho dificulta su estudio, ya que no permite la introducción
de DNA heterólogo. Además es patógena. Por todo ello la mejor elección
sería B. subtilis.
2) Un equipo de investigadores ha aislado un mutante X de E. coli afectado en su pared
celular. En su caracterización han descrito que este mutante puede recibir plásmidos
por conjugación pero no puede donarlos. Otros investigadores afirman que este
fenotipo se debe a que el mutante produce mutaciones en el origen de transferencia del
plásmido cuando éste entra en la bacteria. ¿Cómo comprobarías experimentalmente
estas dos hipótesis? Dispones de:
a) la estirpe mutante X, que es sensible a estreptomicina y posee un plásmido no
conjugativo pero movilizable que confiere resistencia a kanamicina
b) una estirpe A, que es sensible a estreptomicina y posee un plásmido conjugativo
que confiere resistencia a cloranfenicol
c) una estirpe B que es resistente a estreptomicina y no posee plásmidos (5 puntos)
Conjugación triparental usando las tres estirpes. Siembra en
medio sólido con estreptomicina y kanamicina, estrptomicina y
cloranfenicol, kanamicina y cloranfenicol.
Si se obtienen colonias en el primer medio el mutante sí puede
donar DNA. Siempre deben obtenerse colonias en los otros dos
medios.
3) La empresa de bioremediación en que trabajas ha recibido el encargo de obtener un
microorganismo capaz de degradar, DCT, un derivado clorado del tolueno. Está
estudiando dos estrategias para conseguirlo:
a) Buscar en las rutas metabólicas conocidas posibles enzimas que realicen la conversión
de ese compuesto en tolueno e introducir por ingeniería genética los genes que
codifican esas enzimas en una bacteria ya conocida capaz de degradar el tolueno.
b) Inocular un fermentador, lleno de medio de cultivo con DCT como única fuente de
carbono, con la estirpe capaz de degradar tolueno y con diversas muestras de aguas
contaminadas de DCT, y esperar a que se produzca incremento de la biomasa para
aislar el microorganismo responsable de ese crecimiento.
Analiza ambas estrategias, indicando sus ventajas e inconvenientes. (6 puntos)
La estrategia a implica la existencia de suficiente conocimiento
previo. Llevará mucho tiempo y gasto. Si tiene éxito se
consigue además conocer muy bien el fenómeno.
La estrategia be debe ser más rápida y menos costosa. Sin
embargo, su éxito no va acompañado de un conocimiento
detallado del fenómeno.
4) La levadura Saccharomycescerevisiae puede actuar como patógeno oportunista. Se
ha establecido una hipotética relación entre la patogenicidad y la capacidad de algunas
estirpes diploides para realizar crecimiento pseudohifal en agar.
a) ¿Cómo comprobarías esta hipótesis? (3 puntos)
Aislamiento de mutantes que no hagan crecimeinto pseudohifal en
agar y comprobación de su patogenicida en un modelo animal. El
asilamiento se vería facilitado en una cepa homotálica que
diploidiza espontáneamente.
b) Si la hipótesis fuese cierta, ¿podrías realizar un primer análisis genético de la
patogenicidad sin utilizar animales de experimentación? ¿en qué consistiría? (3
puntos)
Sí, mediante análisiscomplementación. Para esto el
homotalismo sería una dificultad, pero podría solucionarse
haciendo el escrutinio en una estirpe que tuviera el gen HO
bajo control (promotor regulable por fuente de carbono, por
ejemplo).
5) Unos investigadores en genética humana han localizado en un locus del cromosoma IV
el gen responsable de una enfermedad hereditaria monogénica que produce
hipersensibilidad a las radiaciones ultravioletas. En dicho locus se encuentran sólo tres
genes, todos ellos de función desconocida, que presentan homólogos en muchos
microorganismos, incluidos E. coli y S. cerevisiae. Te piden ayuda a ti, genético
microbiano, para avanzar en la investigación. ¿Qué les aconsejarías? (5 puntos)
Obtener mutantes en E.coli y en S. cerevisiae afectados en los
genes homólogos. Caracterizar la posible sensibilidad de esos
mutantes a la luz UV y su posible interacción funcional con otros
genes implicados en la reparación del DNA.
Licenciatura en Bioquímica. Curso 2007-2008. Genética microbiana. 21 de
Enero de 2008.
1) ¿Qué bacteriófago elegirías para realizar un análisis genético de la
transducción: lambda, P22 ó T4? Razona la respuesta indicando las posibles
ventajas y desventajas de cada uno de esos organismos para realizar ese estudio
en concreto. (3 puntos)
T4 no transduce de forma natural, a no ser que incorpore
determinadas mutaciones. Es un fago lítico no lisogénico. No es
una buena opción, por tanto.
Lambda es un fago atenuado, con capacidad de realizar lisogenia
pero que sólo realiza transducción especializada. Sería una opción
para analizar genéticamente este tipo de transducción.
P22 es un excelente fago transductor, que realiza transducción
generalizada a una frecuencia muy conveniente para realizar su
análisis genético. Puede realizar lisogenia, además. El único
pequeño inconveniente es que no infecta E. coli, sino Salmonella,
pero esta bacteria tiene también una genética muy desarrollada. Es
la mejor opción.
2) Un equipo de investigadores ha aislado una estirpe de E. coli que presenta una
inserción en el gen gdhA. La inserción parece causada por un transposón de la familia
de Tn5, que suele conferir resistencia a kanamicina. De hecho, la estirpe es resistente a
este antibiótico. ¿Cómo podrían los investigadores averiguar si la secuencia insertada en
gdhA es capaz de transponerse autónomamente? Diseña un experimento para
comprobarlo, sabiendo que la estirpe es Hfr y transmite el locus gdhA a alta frecuencia
por conjugación (5 puntos).
Conjugación de esa estirpe con otra gdhA+ y otra resistencia (Cmr por ejemplo) que
permita seleccionar los transconjugantes como Kanr Cmr. Comprobar si algunos de los
transconjugantes seleccionados son gdhA+. En ese caso la secuencia de inserción debe
haberse insertado en el genoma por transposición y no por recombinación homóloga
entre el DNA conjugante y el cromosoma de la estirpe receptora.
Alternativamente, conjugación con una estirpe de otra especie (para evitar la
recombinación homóloga) que también porte una resistencia (Cmr por ejemplo) para
poder seleccionar transconjugantes. Si se aíslan Kanr Cmr a alta frecuencia, la
secuencia debe transponerse autónomamente.
3) El departamento de I+D de una empresa alimentaria quiere desarrollar un yogurt
enriquecido en lisina. Se han presentado dos proyectos: uno plantea aislar mutantes
de Lactobacillus bulgaricus resistentes a un análogo tóxico de la lisina, mediante
mutagénesis al azar, como forma de obtener estirpes que superproduzcan lisina. Otro
proyecto plantea superproducir las proteínas responsables de la síntesis de lisina
mediante ingeniería genética. ¿Qué proyecto seleccionarías si fueras el director de
I+D? Analiza ambas estrategias, indicando sus ventajas e inconvenientes. (6 puntos)
La estrategia de aislar directamente mutantes superproductores utilizando la
resistencia a un análogo tóxico es más rápida y menos costosa. Si tiene éxito permitiría
obtener el producto, aún a costa de disponer de un menor conocimiento del proceso
biológico que lo sustenta. Esta estrategia no exige además un extenso conocimiento
previo de la biosíntesis de lisina en la bacteria.
La estrategia que implica ingeniería genética sí exige un exhaustivo conocimiento
previo de las rutas biosintéticas y su regulación. Aún así, su éxito tampoco está
asegurado e implica un mayor coste y un mayor tiempo de desarrollo. Además, el uso
en alimentación de organismos modificados por ingeniería genética concita un gran
rechazo social en nuestros días. Todo esto hace poco recomendable para una empresa
seguir esta línea de I+D como opción prioritaria.
4) Hemos aislado un mutante de Saccharomyces cerevisiae, afectado en un gen
de función desconocida, que presenta una alta tendencia a la
autodiploidización (una de cada mil células haploides se vuelve diploide de
forma espontánea en cada generación). La estirpe es además termosensible.
a) Tras obtener un diploide cruzando con una estirpe silvestre, se procede a su
esporulación. Todas las esporas analizadas que presentan termosensibilidad
tras germinar, autodiploidizan con facilidad. Ninguna de las esporas
termorresistentes autodiploidiza. ¿Qué concluyes? (3 puntos)
La termosensibilidad y al autodiploidización presentan un ligamiento
completo. Muy probablemente ambos fenotipos responden a una misma
mutación.
b) Se aíslan mutaciones secundarias que suprimen la termosensibilidad. Se identifican
los genes afectados y todos ellos están relacionados con los microtúbulos. ¿Qué puedes
decir de la función del gen afectado en el mutante original? (3 puntos)
El gen afectado en el mutante original debe estar relacionado funcionalmente con
los microtúbulos; probablemente, con la función de éstos durante la mitosis.
5) Dispones de una estirpe avirulenta de Salmonella, incapaz de atravesar el epitelio
intestinal del ratón. ¿Cómo aislarías mutaciones supresoras de la avirulencia? Describe
el protocolo experimental que seguirías (5 puntos)
Primero convendría comprobar que la estirpe sí es capaz de infectar cuando se
inocula intraperitonealmente.
Si esto es así, se procedería a realizar una mutagénesis, preferentemente con
transposones.
La población mutagenizada se inocularía a ratones de forma oral.
Aquellos que enfermaran son candidatos a haber sido infectados por un supresor de
la avirulencia. Para identificar los supresores se sacrificarían los ratones y se
aislarían las bacterias del interior del organismo (hígado, torrente sanguíneo).
Se comprobaría que las bacterias aisladas contienen el marcador del transposón y
mantienen la virulencia en un nuevo ciclo de inoculación. Las que pasen esta prueba
se analizarán molecularmente para identificar los genes afectados por las inserciones
del transposón.