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Licenciatura en Bioquímica. Curso 2005-2006. Genética microbiana. Examen final. 14 de Febrero de 2006. Nombre.............................................................. Contesta cada pregunta en los espacios reservados, utilizando letra clara escrita con tinta (no a lápiz). No utilices abreviaturas. Puedes emplear los reversos de cada hoja como borrador. No desgrapes el examen. Puede utilizarse todo tipo de material de consulta (libros, apuntes, etc) Calificación sobre 25 puntos totales 1) Varios investigadores están comentando la posibilidad de utilizar el análisis genético de microorganismos en sus futuros trabajos. Todos ellos investigan la separación de cromosomas durante la meiosis. Uno plantea la posibilidad de realizar el análisis genético de ese proceso en Escherichia coli, otro se decanta por Saccharomyces cerevisiae y un tercero por Neuróspora crassa. ¿Quién crees que está más acertado en su elección? Razona la respuesta indicando las posibles ventajas y desventajas de cada uno de esos organismos modelo para realizar ese estudio en concreto. (3 puntos) •E. coli no realiza meiosis •S. cerevisiae y N. crassa sí hacen meiosis y tienen una genética bien desarrollada •N. crassa produce ascas (octadas) ordenadas, lo que facilita más información sobre el desarrollo de la meiosis. Es la mejor elección 2) Te propones averiguar qué genes están involucrados en la transformación natural de una estirpe bacteriana recientemente aislada. a) ¿Cómo ensayarías la transformación para saber, por ejemplo, si un mutante puede o no ser transformado de forma natural? (2 puntos) 1.-Conseguir un marcador genético seleccionable. Por ejemplo una resistencia a antibiótico. 2. Optimizar las condiciones de transformación utilizando un silvestre y el DNA de un resisitente 3. En esas condiciones, ensayar la transformabilidad del mutante b) ¿Qué harías para conocer el número de genes de esa bacteria implicados en la transformación natural? (2 puntos) 1. Realizar una mutagénesis, a ser posible con un transposón que lleve un marcador de resistencia a un antibiótico 2. Detectar los mutantes que no transformen utilizando el ensayo puesto a punto. Emplear una estrategia de contraselección con penicilina para enriquecer. 3. Aislar los genes afectados en cada mutante y comprobar si el alelo silvestre de dichos genes, introducido en un plásmido conjugativo, complementa los otros mutantes. 4. Los grupos de complementación así definidos nos indican el número de genes implicados, si la mutagénesis ha sido saturante. c) ¿Cómo aislarías los genes implicados para determinar su secuencia? (2 puntos) Se realiza una genoteca de cada mutante en un plásmido de E. coli y se selecciona el marcador del transposón. Las secuencias adyacentes al transposón constituyen la del gen afectado. 3) La empresa farmacéutica en que trabajas, estudia la producción de una nueva droga útil para la lucha contra el SIDA. Se trata de un metabolito poco conocido que es excretado en pequeñas cantidades por una estirpe de Bacillus. Como biotecnólogo de la empresa, te encargan la optimización de la producción de dicha droga hasta conseguir una excreción al menos cien veces superior. ¿Qué estrategia utilizarías? Si se te ocurren varias, compáralas en términos de oportunidad y priorízalas. (5 puntos) Posibles estrategias: a) Caracterizar la ruta de síntesis, aislar su genes, estudiar su regulación, identificar los pasos limitantes, hacer ingeniería genética b) Optimizar las condiciones de cultivo de la cepa silvestre para maximizar la producción c) Mutagénesis de la cepa silvestre y asilamiento de mutantes superproductores Un biotecnólogo empezaría por la b, pondría en marcha la c e intentaría convencer a la empresa para que financiara la a. 4) En un hospital han aislado un nuevo patógeno. La caracterización taxonómica indica que se trata de Lactobacillus bulgaricus una bacteria de las utilizadas corrientemente para hacer yogurt. La nueva estirpe patógena, con capacidad para infectar humanos y conejos, porta un plásmido no hallado en las estirpes conocidas de Lactobacillus bulgaricus. a. ¿Cómo podríamos averiguar si ese plásmido es el causante de la patogenicidad? (3 puntos) Curar el plásmido y comprobar si pierde patogenicidad, utilizando el conejo como sistema experimental. Adicionalmente , intentar transferir el plásmido a una cepa no patógena de L. bulgaricus y ensayar su patogenicidad en el conejo. b) En caso de que la patogenicidad no dependiese del plásmido, ¿cómo analizarías su origen? (3 puntos) En ese caso debe haber genes cromosómico implicados. Aislar mutantes no patógenos, utilizando el conejo como modelo experimental. Identificar los genes afectados y comparar su secuencia en las bases de datos para intentar deducir su origen. 5) Un equipo que investiga el mal de Bush, una raro síndrome hereditario que reduce severamente la capacidad intelectual, ha localizado el gen cuya mutación produce la enfermedad. Su secuencia es muy homóloga a otro gen presente en el genoma de Saccharomyces cerevisiae, cuya función se desconoce y que han bautizado como BSH1 (de Bush syndrome homologous). Con la esperanza de avanzar en su conocimiento, los investigadores han obtenido el mutante bsh1∆ de Saccharomyces, que presenta una deleción completa de BSH1. El mutante bsh1∆ no presenta fenotipo alguno, por lo que el trabajo realizado hasta ahora no ha aportado información útil para comprender las bases moleculares de la enfermedad. Pero, lejos de arredrarse, los investigadores quieren utilizar el mutante bsh1∆ como punto de partida para obtener información útil sobre la función de BSH1. ¿Qué tipo de estrategia experimental seguirías tú en su lugar? (5 puntos) Aislar mutaciones que produjeran letalidad sintética con bsh1∆ e identificar los genes afectados. Éstos, si tienen funciones conocidas, nos acercarán al proceso molecular en el que esté implicado BSH1. Licenciatura en Bioquímica. Curso 2006-2007. Genética microbiana. Examen. 1 de Febrero de 2007. 1) Varios investigadores están interesados en llevar a cabo estudios sobre los mecanismos de la transformación bacteriana mediante análisis genético. Uno plantea la posibilidad de realizar el análisis genético de ese proceso en Escherichia coli, otro se decanta por Bacillus subtilis y un tercero por Neisseria gonorrhoeae. ¿Quién crees que está más acertado en su elección? Razona la respuesta indicando las posibles ventajas y desventajas de cada uno de esos organismos para realizar ese estudio en concreto. (3 puntos) E. coli no se transforma de manera natural, por lo que sería una pésima elección B. subtilis presenta transformación natural y acepta cualquier tipo de DNA. N. gonorrhoeae se transfroma de manera natural pero sólo capta DNA que incluya una secuencia altamente específica, que está presente en su propio genoma. Este hecho dificulta su estudio, ya que no permite la introducción de DNA heterólogo. Además es patógena. Por todo ello la mejor elección sería B. subtilis. 2) Un equipo de investigadores ha aislado un mutante X de E. coli afectado en su pared celular. En su caracterización han descrito que este mutante puede recibir plásmidos por conjugación pero no puede donarlos. Otros investigadores afirman que este fenotipo se debe a que el mutante produce mutaciones en el origen de transferencia del plásmido cuando éste entra en la bacteria. ¿Cómo comprobarías experimentalmente estas dos hipótesis? Dispones de: a) la estirpe mutante X, que es sensible a estreptomicina y posee un plásmido no conjugativo pero movilizable que confiere resistencia a kanamicina b) una estirpe A, que es sensible a estreptomicina y posee un plásmido conjugativo que confiere resistencia a cloranfenicol c) una estirpe B que es resistente a estreptomicina y no posee plásmidos (5 puntos) Conjugación triparental usando las tres estirpes. Siembra en medio sólido con estreptomicina y kanamicina, estrptomicina y cloranfenicol, kanamicina y cloranfenicol. Si se obtienen colonias en el primer medio el mutante sí puede donar DNA. Siempre deben obtenerse colonias en los otros dos medios. 3) La empresa de bioremediación en que trabajas ha recibido el encargo de obtener un microorganismo capaz de degradar, DCT, un derivado clorado del tolueno. Está estudiando dos estrategias para conseguirlo: a) Buscar en las rutas metabólicas conocidas posibles enzimas que realicen la conversión de ese compuesto en tolueno e introducir por ingeniería genética los genes que codifican esas enzimas en una bacteria ya conocida capaz de degradar el tolueno. b) Inocular un fermentador, lleno de medio de cultivo con DCT como única fuente de carbono, con la estirpe capaz de degradar tolueno y con diversas muestras de aguas contaminadas de DCT, y esperar a que se produzca incremento de la biomasa para aislar el microorganismo responsable de ese crecimiento. Analiza ambas estrategias, indicando sus ventajas e inconvenientes. (6 puntos) La estrategia a implica la existencia de suficiente conocimiento previo. Llevará mucho tiempo y gasto. Si tiene éxito se consigue además conocer muy bien el fenómeno. La estrategia be debe ser más rápida y menos costosa. Sin embargo, su éxito no va acompañado de un conocimiento detallado del fenómeno. 4) La levadura Saccharomycescerevisiae puede actuar como patógeno oportunista. Se ha establecido una hipotética relación entre la patogenicidad y la capacidad de algunas estirpes diploides para realizar crecimiento pseudohifal en agar. a) ¿Cómo comprobarías esta hipótesis? (3 puntos) Aislamiento de mutantes que no hagan crecimeinto pseudohifal en agar y comprobación de su patogenicida en un modelo animal. El asilamiento se vería facilitado en una cepa homotálica que diploidiza espontáneamente. b) Si la hipótesis fuese cierta, ¿podrías realizar un primer análisis genético de la patogenicidad sin utilizar animales de experimentación? ¿en qué consistiría? (3 puntos) Sí, mediante análisiscomplementación. Para esto el homotalismo sería una dificultad, pero podría solucionarse haciendo el escrutinio en una estirpe que tuviera el gen HO bajo control (promotor regulable por fuente de carbono, por ejemplo). 5) Unos investigadores en genética humana han localizado en un locus del cromosoma IV el gen responsable de una enfermedad hereditaria monogénica que produce hipersensibilidad a las radiaciones ultravioletas. En dicho locus se encuentran sólo tres genes, todos ellos de función desconocida, que presentan homólogos en muchos microorganismos, incluidos E. coli y S. cerevisiae. Te piden ayuda a ti, genético microbiano, para avanzar en la investigación. ¿Qué les aconsejarías? (5 puntos) Obtener mutantes en E.coli y en S. cerevisiae afectados en los genes homólogos. Caracterizar la posible sensibilidad de esos mutantes a la luz UV y su posible interacción funcional con otros genes implicados en la reparación del DNA. Licenciatura en Bioquímica. Curso 2007-2008. Genética microbiana. 21 de Enero de 2008. 1) ¿Qué bacteriófago elegirías para realizar un análisis genético de la transducción: lambda, P22 ó T4? Razona la respuesta indicando las posibles ventajas y desventajas de cada uno de esos organismos para realizar ese estudio en concreto. (3 puntos) T4 no transduce de forma natural, a no ser que incorpore determinadas mutaciones. Es un fago lítico no lisogénico. No es una buena opción, por tanto. Lambda es un fago atenuado, con capacidad de realizar lisogenia pero que sólo realiza transducción especializada. Sería una opción para analizar genéticamente este tipo de transducción. P22 es un excelente fago transductor, que realiza transducción generalizada a una frecuencia muy conveniente para realizar su análisis genético. Puede realizar lisogenia, además. El único pequeño inconveniente es que no infecta E. coli, sino Salmonella, pero esta bacteria tiene también una genética muy desarrollada. Es la mejor opción. 2) Un equipo de investigadores ha aislado una estirpe de E. coli que presenta una inserción en el gen gdhA. La inserción parece causada por un transposón de la familia de Tn5, que suele conferir resistencia a kanamicina. De hecho, la estirpe es resistente a este antibiótico. ¿Cómo podrían los investigadores averiguar si la secuencia insertada en gdhA es capaz de transponerse autónomamente? Diseña un experimento para comprobarlo, sabiendo que la estirpe es Hfr y transmite el locus gdhA a alta frecuencia por conjugación (5 puntos). Conjugación de esa estirpe con otra gdhA+ y otra resistencia (Cmr por ejemplo) que permita seleccionar los transconjugantes como Kanr Cmr. Comprobar si algunos de los transconjugantes seleccionados son gdhA+. En ese caso la secuencia de inserción debe haberse insertado en el genoma por transposición y no por recombinación homóloga entre el DNA conjugante y el cromosoma de la estirpe receptora. Alternativamente, conjugación con una estirpe de otra especie (para evitar la recombinación homóloga) que también porte una resistencia (Cmr por ejemplo) para poder seleccionar transconjugantes. Si se aíslan Kanr Cmr a alta frecuencia, la secuencia debe transponerse autónomamente. 3) El departamento de I+D de una empresa alimentaria quiere desarrollar un yogurt enriquecido en lisina. Se han presentado dos proyectos: uno plantea aislar mutantes de Lactobacillus bulgaricus resistentes a un análogo tóxico de la lisina, mediante mutagénesis al azar, como forma de obtener estirpes que superproduzcan lisina. Otro proyecto plantea superproducir las proteínas responsables de la síntesis de lisina mediante ingeniería genética. ¿Qué proyecto seleccionarías si fueras el director de I+D? Analiza ambas estrategias, indicando sus ventajas e inconvenientes. (6 puntos) La estrategia de aislar directamente mutantes superproductores utilizando la resistencia a un análogo tóxico es más rápida y menos costosa. Si tiene éxito permitiría obtener el producto, aún a costa de disponer de un menor conocimiento del proceso biológico que lo sustenta. Esta estrategia no exige además un extenso conocimiento previo de la biosíntesis de lisina en la bacteria. La estrategia que implica ingeniería genética sí exige un exhaustivo conocimiento previo de las rutas biosintéticas y su regulación. Aún así, su éxito tampoco está asegurado e implica un mayor coste y un mayor tiempo de desarrollo. Además, el uso en alimentación de organismos modificados por ingeniería genética concita un gran rechazo social en nuestros días. Todo esto hace poco recomendable para una empresa seguir esta línea de I+D como opción prioritaria. 4) Hemos aislado un mutante de Saccharomyces cerevisiae, afectado en un gen de función desconocida, que presenta una alta tendencia a la autodiploidización (una de cada mil células haploides se vuelve diploide de forma espontánea en cada generación). La estirpe es además termosensible. a) Tras obtener un diploide cruzando con una estirpe silvestre, se procede a su esporulación. Todas las esporas analizadas que presentan termosensibilidad tras germinar, autodiploidizan con facilidad. Ninguna de las esporas termorresistentes autodiploidiza. ¿Qué concluyes? (3 puntos) La termosensibilidad y al autodiploidización presentan un ligamiento completo. Muy probablemente ambos fenotipos responden a una misma mutación. b) Se aíslan mutaciones secundarias que suprimen la termosensibilidad. Se identifican los genes afectados y todos ellos están relacionados con los microtúbulos. ¿Qué puedes decir de la función del gen afectado en el mutante original? (3 puntos) El gen afectado en el mutante original debe estar relacionado funcionalmente con los microtúbulos; probablemente, con la función de éstos durante la mitosis. 5) Dispones de una estirpe avirulenta de Salmonella, incapaz de atravesar el epitelio intestinal del ratón. ¿Cómo aislarías mutaciones supresoras de la avirulencia? Describe el protocolo experimental que seguirías (5 puntos) Primero convendría comprobar que la estirpe sí es capaz de infectar cuando se inocula intraperitonealmente. Si esto es así, se procedería a realizar una mutagénesis, preferentemente con transposones. La población mutagenizada se inocularía a ratones de forma oral. Aquellos que enfermaran son candidatos a haber sido infectados por un supresor de la avirulencia. Para identificar los supresores se sacrificarían los ratones y se aislarían las bacterias del interior del organismo (hígado, torrente sanguíneo). Se comprobaría que las bacterias aisladas contienen el marcador del transposón y mantienen la virulencia en un nuevo ciclo de inoculación. Las que pasen esta prueba se analizarán molecularmente para identificar los genes afectados por las inserciones del transposón.