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Trabajos en modalidad cartel P37 VALIDACIÓN DE LA AMPLIFICACIÓN ISOTÉRMICA MEDIADA POR HORQUILLAS (LAMP) DIRIGIDA AL GEN SCA1 PARA EL DIAGNÓSTICO DE RICKETTSIA Gutierrez-Torres, G.I., Monteón-Padilla, V.M., López-Alcántara, R., HernándezVázquez, O.H., Villalobos-Rodríguez, L.A., Ramírez-Benítez, J.E. Universidad Autónoma de Campeche, FCQBC. E-mail: [email protected] Dentro de las Enfermedades Transmitidas por Vector prioridad en el Plan Nacional de Salud, las Rickettsiosis ocupan un lugar importante, debido a que son consideradas como enfermedades emergentes cuya incidencia podría incrementar en los próximos años. Entre los diversos métodos para el diagnóstico de Rickettsiosis, entre los cuales los métodos moleculares muestran mayor sensibilidad que los serológicos. Esta enfermedad se considera como subdiagnosticada en nuestra región debido principalmente a la falta de la infraestructura necesaria para garantizar la cobertura en las zonas donde se espera una mayor incidencia. La Amplificación Isotérmica Mediada por horquillas (LAMP) es una nueva técnica de diagnóstico que ha mostrado ser más sensible que la prueba de PCR, además de que requiere de menor infraestructura para su implementación. Esta técnica ya se ha aplicado para la detección de Rickettsiosis en diferentes modelos, así como para el diagnóstico de pacientes con cuadros febriles inespecíficos. Sin embargo, sus límites de detección mostraron ser inferiores al PCR cuando se diseñaron cebadores sobre secuencias blanco de los genes sca5 y ompB. Recientemente, el gen sca1 ha mostrado ser un blanco promisorio para el diagnóstico, debido a que se encuentra en la mayoría de las especies del género y de que su secuencia es suficientemente divergente entre las mismas. El objetivo de este trabajo la validación del gen sca1 como gen blanco de diagnóstico para Rickettsia, mediante amplificación Isotérmica mediada por Horquillas. Se realizó una búsqueda bioinformática de la secuencia del gen sca1 en el repositorio GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/genbank) para las especies Rickettsia felis, R. prowaseki, R. typhi y R. rickettsii. Se realizó el diseño in silico de cebadores para la amplificación LAMP, haciendo uso del software Primer Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/ index.html) haciendo uso de alineamientos entre las secuencias del gen sca1 para las 4 especies de Rickettsia, así como se diseñaron cebadores específicos para cada especie. Se realizó una Este documento está disponible en http://www.revbiomed.uady.mx/pdf/rb1526S169.pdf Suplemento 1-2015 145 Gutiérrez-Torres et al. selección de los cebadores candidatos en base a sus temperaturas de fusión y % GC, siguiendo los parámetros recomendados por el diseñador del software. Se extrajo ADN genómico a partir de cultivos bacterianos de cada especie haciendo uso del kit QIAmp DNA bloodminikit (QIAGEN) con las modificaciones descritas anteriormente (3), verificando por electroforesis la integridad y cuantificando por espectrofotometría la concentración. Se realizó la amplificación del gen sca1 con el ADN genómico, haciendo uso del kit Loopamp DNA amplification kit (EikenChemical Cp., Ltd, Japón) a una temperatura de 60 oC y 90 min, en las siguientes condiciones y haciendo uso de los cebadores diseñados anteriormente: volumen total de reacción 25 uL, 40 pmol de cebadores FIP y BIP, 20 pmol de cebadores Loop-F y Loop B, 10 pmol de cebadores F3 y B3, 12.5 uL de amortiguador de reacción, 1uL de Bst polimerasa, 3uL de ADN molde. Los productos de amplificación fueron aplicados a un gel de agarosa al 1 % y separados mediante electroforesis a 100 v durante 40 min, siendo visualizados en un fotodocumentador. Los Revista Biomédica alineamientos entre las secuencias de los genes sca1 de las 4 especies de Rickettsia mostraron pocas regiones conservadas en las mismas. Se pudo observar que las secuencias de sca1 en las especies R. rickettsii y R. prowaseki tenían mayor similitud entre ellas que con el par R. typhi y R. felis. El análisis de los archivos de alineamiento mediante el software Primer Explorer no arrojó ningún set de cebadores para la amplificación LAMP para las secuencias conservadas de estos genes. Por otra parte, se obtuvieron de 1 a 5 sets de cebadores para las secuencias individuales de sca1 en cada especie. Se eligió 1 set de cebadores por especie para la amplificación LAMP de sca1 en ADN genómico de las cuatro cepas. El tamaño de los productos de amplificación obtenidos concordó con los esperados para los genes sca1 de las cuatro especies de Rickettsia. En este trabajo se confirmó la utilidad del gen sca1 como gen diana para la amplificación isotérmica LAMP en ADN genómico de Rickettsia. Los cebadores diseñados serán evaluados para determinar el nivel de sensibilidad en el diagnóstico de Rickettsia en comparación con la técnica de PCR convencional. 146