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Trabajos en
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VALIDACIÓN DE LA AMPLIFICACIÓN
ISOTÉRMICA MEDIADA POR HORQUILLAS
(LAMP) DIRIGIDA AL GEN SCA1 PARA EL
DIAGNÓSTICO DE RICKETTSIA
Gutierrez-Torres, G.I., Monteón-Padilla, V.M., López-Alcántara, R., HernándezVázquez, O.H., Villalobos-Rodríguez, L.A., Ramírez-Benítez, J.E.
Universidad Autónoma de Campeche, FCQBC.
E-mail: [email protected]
Dentro de las Enfermedades Transmitidas
por Vector prioridad en el Plan Nacional de Salud,
las Rickettsiosis ocupan un lugar importante,
debido a que son consideradas como enfermedades
emergentes cuya incidencia podría incrementar
en los próximos años. Entre los diversos métodos
para el diagnóstico de Rickettsiosis, entre los
cuales los métodos moleculares muestran mayor
sensibilidad que los serológicos. Esta enfermedad
se considera como subdiagnosticada en nuestra
región debido principalmente a la falta de la
infraestructura necesaria para garantizar la
cobertura en las zonas donde se espera una mayor
incidencia. La Amplificación Isotérmica Mediada
por horquillas (LAMP) es una nueva técnica de
diagnóstico que ha mostrado ser más sensible
que la prueba de PCR, además de que requiere
de menor infraestructura para su implementación.
Esta técnica ya se ha aplicado para la detección
de Rickettsiosis en diferentes modelos, así como
para el diagnóstico de pacientes con cuadros
febriles inespecíficos. Sin embargo, sus límites de
detección mostraron ser inferiores al PCR cuando
se diseñaron cebadores sobre secuencias blanco
de los genes sca5 y ompB. Recientemente, el gen
sca1 ha mostrado ser un blanco promisorio para
el diagnóstico, debido a que se encuentra en la
mayoría de las especies del género y de que su
secuencia es suficientemente divergente entre las
mismas. El objetivo de este trabajo la validación
del gen sca1 como gen blanco de diagnóstico para
Rickettsia, mediante amplificación Isotérmica
mediada por Horquillas. Se realizó una búsqueda
bioinformática de la secuencia del gen sca1 en el
repositorio GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.
gov/genbank) para las especies Rickettsia felis, R.
prowaseki, R. typhi y R. rickettsii. Se realizó el
diseño in silico de cebadores para la amplificación
LAMP, haciendo uso del software Primer
Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/
index.html) haciendo uso de alineamientos entre
las secuencias del gen sca1 para las 4 especies
de Rickettsia, así como se diseñaron cebadores
específicos para cada especie. Se realizó una
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Suplemento 1-2015
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Gutiérrez-Torres et al.
selección de los cebadores candidatos en base a
sus temperaturas de fusión y % GC, siguiendo
los parámetros recomendados por el diseñador
del software. Se extrajo ADN genómico a partir
de cultivos bacterianos de cada especie haciendo
uso del kit QIAmp DNA bloodminikit (QIAGEN)
con las modificaciones descritas anteriormente
(3), verificando por electroforesis la integridad
y cuantificando por espectrofotometría la
concentración. Se realizó la amplificación del gen
sca1 con el ADN genómico, haciendo uso del kit
Loopamp DNA amplification kit (EikenChemical
Cp., Ltd, Japón) a una temperatura de 60 oC y
90 min, en las siguientes condiciones y haciendo
uso de los cebadores diseñados anteriormente:
volumen total de reacción 25 uL, 40 pmol de
cebadores FIP y BIP, 20 pmol de cebadores
Loop-F y Loop B, 10 pmol de cebadores F3 y
B3, 12.5 uL de amortiguador de reacción, 1uL
de Bst polimerasa, 3uL de ADN molde. Los
productos de amplificación fueron aplicados a
un gel de agarosa al 1 % y separados mediante
electroforesis a 100 v durante 40 min, siendo
visualizados en un fotodocumentador. Los
Revista Biomédica
alineamientos entre las secuencias de los genes
sca1 de las 4 especies de Rickettsia mostraron
pocas regiones conservadas en las mismas. Se
pudo observar que las secuencias de sca1 en las
especies R. rickettsii y R. prowaseki tenían mayor
similitud entre ellas que con el par R. typhi y R.
felis. El análisis de los archivos de alineamiento
mediante el software Primer Explorer no arrojó
ningún set de cebadores para la amplificación
LAMP para las secuencias conservadas de estos
genes. Por otra parte, se obtuvieron de 1 a 5 sets
de cebadores para las secuencias individuales de
sca1 en cada especie. Se eligió 1 set de cebadores
por especie para la amplificación LAMP de sca1
en ADN genómico de las cuatro cepas. El tamaño
de los productos de amplificación obtenidos
concordó con los esperados para los genes sca1
de las cuatro especies de Rickettsia. En este
trabajo se confirmó la utilidad del gen sca1 como
gen diana para la amplificación isotérmica LAMP
en ADN genómico de Rickettsia. Los cebadores
diseñados serán evaluados para determinar el nivel
de sensibilidad en el diagnóstico de Rickettsia en
comparación con la técnica de PCR convencional.
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