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Pruebas bioquímicas y
moleculares para la
identificación y distinción
varietal
Amalio Santacruz Varela
31 de agosto de 2011
Puntos a abordar
 Introducción
 Importancia de los marcadores bioquímicos y moleculares
 Concepto de marcadores bioquímicos y moleculares
 Principios en que se basan las técnicas de marcadores
 Ejemplos de marcadores usuales
 Bioquímicos
 De ADN
 ¿Qué se ha concretado en la UPOV?
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INTRODUCCIÓN
Niveles en la identificación varietal
 En el fenotipo: Es la combinación de los caracteres individuales
que resultan de u genotipo y de su interacción con el ambiente. Se
concentra en rasgos morfológicos o fisiológicos que definen la
forma y apariencia de un grupo de individuos.
 En el genotipo: Es la constitución genética particular de un
organismo. Se realiza al nivel de la molécula de ADN (o sus
productos directos) que es la responsable de la transmisión de la
información genética.
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Identificación varietal a nivel de fenotipo
 Medición generalmente sencilla
 No requiere equipo sofisticado o costoso
 Constituyen mediciones directas
 Requiere un conocimiento práctico del cultivo
 Está sujeta a influencias ambientales
 El número de caracteres confiables es limitado
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Marcadores moleculares
Dogma central de la Biología Molecular
La información fluye del ADN al ARN por vía del proceso llamado
transcripción, y luego a la proteína por el proceso de traducción.
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Marcadores bioquímicos
Para superar las limitaciones de los marcadores morfológicos, se han
desarrollado otros tipos de marcadores, unos de ellos, a nivel de
proteínas, conocidos también como “marcadores bioquímicos”.
Los marcadores bioquímicos pueden ser proteínas de almacenamiento
de la semilla e isoenzimas.
Se obtienen mediante electroforesis, aprovechando las propiedades
migratorias de las proteínas, y se detectan mediante tinciones
histoquímicas específicas de las proteínas que se quieren analizar.
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Proteínas de reserva
 Maíz: Prolaminas (zeinas), albúminas, globulinas, glutelinas
 Trigo: Prolaminas (gliadinas), glutelinas (gluteninas), albúminas,
globulinas
 Cebada: Hordeínas
 Leguminosas: Globulinas (Leguminas, vicilinas)
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Isoenzimas
Múltiples formas de la misma enzima
Metodología
a)
Macerar el tejido y extraer las enzimas
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Isoenzimas
Metodología
b) Separar las enzimas por electroforesis
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Isoenzimas
Metodología
c) Localizar las enzimas por tinción histoquímica
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d) Analizar los patrones de bandas
Malato deshidrogenasa
A
B
C
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Glutamato oxaloacetato transaminasa
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Marcadores moleculares
Son secuencias detectables de ADN cuya herencia puede ser
monitoreada
Varios eventos (mutaciones puntuales, inserciones, deleciones,
duplicaciones, rearreglos) pueden dar lugar a variantes en la
secuencia del ADN.
A tales variantes se les denomina polimorfismos, que se traducen
en diferencias en el genotipo (como lo evidencían los diferentes
perfiles de bandas); y tal vez repercuta en el fenotipo
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Propiedades deseables de los marcadores
moleculares
Altamente polimórficos
Que presenten codominancia
Que se presenten en todo el genoma
Fáciles, rápidos y baratos para la detección
Reproducibles dentro y entre laboratorios
Propios para automatización
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Marcadores moleculares
Tipos de marcadores moleculares más comunes:
RFLPs
RAPDs
Repeticiones en serie (Minisatélites, microsatélites)
AFLPs
etc.
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SSRs (Secuencias simples repetidas o Microsatélites)
Es una técnica que usa iniciadores (“primers”) para sitios específicos
(aquellos donde se encuentran las secuencias repetidas) y amplifica
fragmentos de ADN plenamente identificados.
Etapas de la metodología en laboratorio:
• Extracción y cuantificación de ADN
• Reacción de PCR con los iniciadores específicos
• Separación de los fragmentos de ADN por electroforesis
• Visualización de los fragmentos de ADN usando bromuro de etidio,
nitrato de plata o mediante etiquetas fluorescentes
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Análisis de microsatélites
Extracción de ADN
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Cuantificación de ADN
 Relación de absorbancia 260/280 nm entre 1.0 y 2.0
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Amplificación de los microsatélites
 Desnaturalización inicial de 4 minutos
a 95 °C,
 25 ciclos de
1 minuto a 95 °C (desnaturalización),
2 minutos a 55 °C (alineación)
2
minutos a 72 °C (extensión)
 10 minutos de extensión final a 72 °C.
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Electroforesis
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Automatización del proceso
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Cuadro 1. Iniciadores a utilizar para la amplificación de Secuencias Simples Repetidas en
poblaciones de razas mexicanas de maíz
Grupo
1
2
3
Locus
BIN #
Unidad
Repetitiva
phi127
2.07
GTGC
Tamaño de
fragmento
(bp)
105-126
phi051
7.06
AGG
136-154
phi115
8.03
ATAC
292-312
phi015
8.08
TTTG
76-113
phi033
9.02
CCT
224-270
phi053
3.05
ATGT
169-213
phi072
4.01
CAAA
134-163
phi093
4.08
CTAG
272-296
phi024
5.00
CCT
354-376
phi085
5.06
GCGTT
233-266
phi034
7.02
CCT
123-160
phi121
8.04
CCG
93-105
phi056
1.01
GCC
231-278
phi064
1.11
ATCC
75-121
phi050
10.03
AAGC
77-87
Iniciador adelante//
Iniciador en reversa
ROX-ATATGCATTGCCTGGAACTGGAAGGA//
AATTCAAACACGCCTCCCGAGTGT
6-FAM-GCGAAAGCGAACGACAACAATCTT//
ACATCGTCAGATTATATTGCAGACCA
HEX-GCTCCGTGTTTCGCCTGAA//
ACCATCACCTGAATCCATCACA
HEX-GCAACGTACCGTACCTTTCCGA//
ACGCTGCATTCAATTACCGGGAAG
6-FAM-ATCGAAATGCAGGCGATGGTTCTC//
ATCGAGATGTTCTACGCCCTGAAGT
ROX-CTGCCTCTCAGATTCAGAGATTGAC//
AACCCAACGTACTCCGGCAG
6-FAM-GTGCATGATTAATTTCTCCAGCCTT//
GACAGCGCGCAAATGGATTGAACT
ROX-GTGCGTCAGCTTCATCGCCTACAAG//
CCATGCATGCTTGCAACAATGGATACA
HEX-CTCCGCTTCCACTGTTCCA//
TGTCCGCTGCTTCTACCCA
6-FAM-AGCAGAACGGCAAGGGCTACT//
TTTGGCACACCACGACGA
HEX-TAGCGACAGGATGGCCTCTTCT//
GGGGAGCACGCCTTCGTTCT
6-FAM-AGGAAAATGGAGCCGGTGAACCA//
TTGGTCTGGACCAAGCACATACAC
ROX-ACTTGCTTGCCTGCCGTTAC//
CGCACACCACTTCCCAGAA
HEX-CGAATTGAAATAGCTGCGAGAACCT//
ACAATGAACGGTGGTTATCAACACGC
ROX-AACATGCCAGACACATACGGACAG//
ATGGCTCTAGCGAAGCGTAGAG
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Variedades de maíz palomero
Morfología
SSRs
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¿Se puede mejorar la congruencia? (Caso maíz)
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Situación actual
Para la mayoría de las especies, las pruebas DHE se basan en características
morfológicas, las cuales, son influenciadas por el ambiente y además:
 Requieren evaluaciones en distintas localidades y un cierto número de
repeticiones.
 Las características deben evaluarse a lo largo de todo el ciclo del cultivo o
por más de un ciclo, dependiendo de la especie, lo que conlleva un mayor
consumo de tiempo.
 En este contexto, los exámenes DHE podrían beneficiarse de las bondades
y ventajas que les brindarían los marcadores bioquímicos y moleculares.
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Situación actual
El uso de marcadores aún no está generalizado, algunos países han implementado su
aplicación como complemento de las características morfológicas.
Ejemplos:
 Inglaterra: ha incorporado como criterio de distinción varietal para
trigo los perfiles electroforéticos de gliadinas
 Francia: para la identificación y el registro de líneas de maíz trigo
y cebada emplean patrones isoenzimáticos
 Italia: utilizan el análisis de hordeínas para cebada siguiendo un
protocolo de la UPOV.
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¿Qué se ha concretado en la UPOV?
1.
Se prefiere el uso de microsatélites sobre otro tipo de
marcadores.
2.
Se prevee que en el futuro el tipo preferido de marcadores sean
los polimorfismos de nucleótido individual (SNPs), para lo cual es
necesario secuenciar el ADN.
3. Se necesita con urgencia armonizar las metodologías de
marcadores moleculares para garantizar la calidad de los datos.
4. Se debe poner atención a la definición de un grupo núcleo de
marcadores para uso estándar.
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LA VISIÓN DE LA UPOV
Uso de marcadores moleculares en el
examen DHE
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¿Técnicas moleculares?
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Consideraciones legales

Conformidad con el Convenio de la UPOV

Impacto potencial en el valor de la protección
Consideraciones técnicas

Fiabilidad y fortaleza del sistema

Acceso a la tecnología

Armonización de métodos

Costo del examen
Consecuencias para los obtentores (e.j. costo y tiempo involucrado para
nuevos requisitos de uniformidad)

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MODELOS DE APLICACIÓN VISUALIZADOS POR LA UPOV
1. Marcadores moleculares específicos de caracteres
EJEMPLO: MARCADOR GENÉTICO ESPECÍFICO PARA LA
TOLERANCIA A LOS HERBICIDAS
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1. Una variedad se modifica genéticamente mediante la inserción de un gen
para la tolerancia al herbicida “X”. Las variedades que contienen este gen
no se ven afectadas cuando se les aplica “X”, mientras que las variedades
que no tiene este gen mueren sistemáticamente. La tolerancia a la
Fórmula X, examinada en ensayos en parcelas pulverizando las parcelas, es
un carácter DHE aceptado, y puede utilizarse para establecer la distinción
entre variedades.
2. Se propone que, en lugar de asperjar las variedades en las parcelas (debido a
la dificultad de organizarlo en los ensayos DHE estándar), se examine el
carácter “tolerancia al herbicida X” realizando un examen para determinar la
presencia de un marcador molecular vinculado al gen. Este marcador se
encuentra en una parte del gen “construido”. El marcador puede localizarse
en el gen, parcialmente en el gen o fuera del propio gen.
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Premisas
a) El examen DHE
Que el examen para el marcador tendrá el mismo alcance que el ensayo en
parcela, es decir, el mismo número de plantas individuales, durante el mismo
número de años y con los mismos criterios para establecer la distinción, la
homogeneidad y la estabilidad.
b) Fiabilidad de los vínculos
Que se controlará el vínculo entre el marcador y el gen a fin de garantizar
que el marcador sea un predictor fiable de la tolerancia a la Fórmula X. Este
control será necesario para garantizar, por ejemplo, que el marcador no se
separe del gen y que la presencia del gen siga dando como resultado la
tolerancia al herbicida X.
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c) Creación de marcadores moleculares diferentes para el mismo gen
Quizás sea posible elaborar distintas construcciones genéticas que contengan
la tolerancia al herbicida X e identificar marcadores moleculares
independientes los distintos marcadores para el mismo gen se tratarían como
si fuesen distintos métodos para examinar el mismo carácter, a saber, la
tolerancia al herbicida X.
d) Distintos genes que producen tolerancia al mismo herbicida
Que distintos genes serían tratados como distintos métodos para examinar el
mismo carácter, a saber, la tolerancia al herbicida X.
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2. Calibración de distancias moleculares en la gestión de
colecciones de variedades
Se basa en la determinación de los niveles de umbral para marcadores
moleculares en función de los niveles de umbral de caracteres
tradicionales.
Los niveles de umbral de los caracteres tradicionales se basan en una
evaluación global de la distancia, en lugar de en un enfoque carácter por
carácter y se aplica a la “gestión de las colecciones de referencia”.
El término “gestión de las colecciones de referencia” abarca la selección
de variedades notoriamente conocidas que pueden excluirse del ensayo
en cultivo utilizado para examinar la distinción.
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La primera etapa consiste en determinar el modo de medir la distancia
entre las variedades utilizando caracteres tradicionales. Un ejemplo es
utilizando el programa informático GAΪA, creado en Francia. De este
modo, se establece un umbral a partir de un cierto grado de diferencias
con base en caracteres morfológicos.
La siguiente etapa es establecer también un umbral, pero ahora con
base en distancias genéticas determinadas con marcadores moleculares.
El umbral puede establecerse con un adecuado margen de seguridad
debido a que las variedades que no se eliminan, pero que son distintas,
se descubrirán en el ensayo en cultivo. Este umbral, con un margen de
seguridad, se denomina umbral de “distinción calificada” (umbral plus)
para marcadores moleculares.
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Diferencias en los marcadores moleculares (Distancias Genéticas)
Xu es la frecuencia del alelo u-ésimo en la primera población;
Yu es la frecuencia del alelo u-ésimo en la segunda población.
Distancia Euclideana, DEU
Distancia de Cavalli-Sforza y
Edwards (1967), DCH
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Distancia de Alelos
Compartidos, DSA
Distancia de Bhattacharyya y Nei
(1987), θ2
Distancia de Sanghvi (1953), χ2
Distancia de Rogers (1972), DR
Distancia de Prevosti (1975), Op
Distancia de Nei (1983), DA
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¿Cuál es la mejor distancia?....
Todos los parámetros de distancia genética tienen ventajas y
desventajas en relación a varias propiedades estadísticas y genéticas
tales como: a) metricidad, b) errores de muestreo, c) requerimientos
computacionales, etc.
Metricidad
Una distancia entre x and y tiene metricidad si cumple con las siguientes
cuatro propiedades:




D(x, y) ≥ 0 para toda x y y
D(x, y) = 0 si y sólo si x = y
D(x, y) = D(y, x) para toda x y y
D(x, y) ≤ D(x, z) + D(y, z) para toda x, y y z [inequidad del triángulo]
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Umbral molecular
Distancia morfoógica
Calibración perfecta
Umbral morfológico
Distancia molecular
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Determinando el umbral molecular
Un grupo de expertos debe efectuar una evaluación con respecto a un
conjunto de pares de variedades, y luego contrastar dicha evaluación con las
distancias moleculares. En el caso del maíz, se procedió así:
Material: 504 pares de variedades examinadas en paralelo mediante
marcadores moleculares
Disposición del cultivo: pares de variedades cultivadas en paralelo
(1 parcela = 2 hileras de 15 plantas)
Evaluación visual por expertos en cultivos del maíz en la escala de similitud:
1. Las dos variedades son similares o muy parecidas
3. Las dos variedades son distintas pero se parecen
5. La comparación es útil, pero las variedades son claramente distintas
7. La comparación no era necesaria. Las variedades son muy diferentes
9. La comparación no era necesaria. Variedades totalmente diferentes
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Tipo 1
Tipo 2
Tipo 3
Tipo 4
Distinción plus
(caracteres tradicionales)
Sí
No
Sí
No
Distinción plus
(marcadores moleculares)
Sí
No
No
Sí
Los resultados de los tipos 1 y 2 no tendrán repercusiones en la eficacia de la
protección debido a que el resultado es el mismo con los dos métodos utilizados.
Los resultados del tipo 3 no tendrán repercusiones en la eficacia de la protección
debido a que en el ensayo en cultivo, mediante la utilización de caracteres
tradicionales, se descubrirá que las variedades son distintas.
Los resultados del tipo 4 pueden tener repercusiones en la eficacia de la
protección debido a que pueden ocasionar que se consideren distintas
variedades que anteriormente no se hubiesen considerado distintas. Para
determinar si los resultados del tipo 4 podrían socavar la eficacia de la
protección que se brinda en virtud del sistema de la UPOV se precisaría realizar
un análisis de dichos casos.
3. Utilización de marcadores moleculares como caracteres.
Creación de un nuevo sistema
El nuevo sistema se basa en los marcadores STMS (Sequence-tagged
microsatelite sites) (“sitios de secuencia marcada por microsatélite”) se
utilizan para buscar ciertas secuencias repetidas en el ADN vegetal. En
dichos lugares de la secuencia reconocidos por el marcador, el ADN vegetal
se amplifica y los fragmentos resultantes se depositan en un gel, que
produce un conjunto de bandas o picos correspondientes a cada fragmento.
Primer
(Forward)
Secuencia
arbitraria
Microsatélite
(Unidades
repetitivas)
Secuencia
arbitraria
Primer
(Reverse)
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Se propone el siguiente esquema:
Etapa 1:
Utilizar un conjunto determinado de siete marcadores STMS (conjunto 1) para
examinar dos plantas de la variedad candidata a fin de determinar si se
diferencia claramente de todas las demás variedades.
Si la variedad candidata presenta al menos 3 diferencias de banda/pico en
relación con todas las demás variedades tras utilizar este primer conjunto de
marcadores, se considerará distinta y podrá cultivarse en un ensayo en cultivo a
fin de examinar la homogeneidad y la estabilidad en relación con los caracteres
no moleculares pertinentes. En otros casos, o cuando falten valores, se pasará a
la etapa 2.
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Etapa 2:
Si la variedad candidata no se considera distinta tras utilizar el
conjunto 1 de marcadores, se examinará con otro conjunto diferente de
siete marcadores STMS (conjunto 2).
Si la variedad candidata presenta al menos 3 diferencias de banda/pico
en relación con todas las demás variedades tras utilizar ambos
conjuntos de marcadores combinados, se considerará que es distinta y
podrá cultivarse en un ensayo en cultivo a fin de examinar la
homogeneidad y la estabilidad en relación con los caracteres no
moleculares pertinentes. En otros casos, o cuando falten valores para
más de un conjunto de marcadores, se pasará a la etapa 3.
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Etapa 3:
Si la variedad candidata no se considera distinta tras utilizar ambos
conjuntos de marcadores, es probable que se trate de una variedad
existente o de una variedad muy similar genéticamente a una variedad
existente, por ejemplo, consecuencia de una mutación. Dichas
variedades candidatas podrán incluirse en el ensayo en cultivo a fin de
examinar la distinción, la homogeneidad y la estabilidad, utilizando
caracteres no moleculares.
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¡¡GRACIAS!!
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