Download Informe de Seguimiento Técnico Anual 2003

Aprovechamiento de los recursos genéticos de las papayas
para su mejoramiento y promoción
Informe de progreso a mayo 2002, preparado por Geo Coppens d’Eeckenbrugge
1. Resumen
Germoplasma de los géneros Carica (papaya común), Vasconcellea (papayas de monte o
papayuelas) y Jacaratia fue colectado por la Universidad de Ambato en el Ecuador (50
accesiones) y por la Universidad de Caldas (70 accesiones), la Universidad Nacional y
Corpoica en Colombia (106 accesiones). Fue sembrado en colecciones de campo donde
se inició la caracterización morfológica, revisando la lista de descriptores. En Venezuela,
se han realizado colectas e intercambios menores y se han preparado colectas más
extensas utilizando datos de herbarios.
Para la conservación de semillas de papaya, la unidad de recursos genéticos del CIAT
estableció las curvas de secado e imbibición y mostró que soporta la desecación hasta 511% sin pérdida importante de viabilidad y podía almacenarse bajo temperatures de 22
hasta –196°C (nitrógeno líquido), lo que permite planificar la conservación a largo plazo
de los materiales colectados.
La caracterización morfológica se centró esencialmente en las especies más comunes y de
mayor importancia económica, C. papaya, V. cundinamarcensis, V. goudotiana,
V. stipulata y V. x heilbornii cv. Babaco. En Colombia (Corpoica) se caracterizaron 44
accesiones de la segunda y tercera especie. Según el análisis correspondiente, los
caracteres cualitativos presentaron poder discriminante a nivel taxonómico y los
cuantitativos mostraron amplia variación. En el Ecuador (U.T. Ambato/CIRAD/IPGRI)
fueron caracterizadas 42 plantas.
Técnicas de caracterización bioquímica (isoenzimas) y molecular (microsatélites) han
sido desarrolladas en la U. Caldas y en CIRAD-FLHOR. Sobre 14 sistemas enzimáticos
ensayados, ocho revelaron polimorfismo. Una primera muestra de 66 accesiones y 132
plantas se está estudiando. Los marcadores microsatélites se han ensayado sobre una
primera muestra de 30 genotipos caribeños de papaya y 11 genotipos de papayas andinas
del género Vasconcellea. Los resultados mostraron polimorfismo con 26 iniciadores en
los primeros y con cuatro en los segundos. Los microsatélites han permitido diferenciar
claramente los dos géneros.
Seis nuevas accesiones de C. papaya y V. goudotiana fueron probadas por su resistencia
a nemátodos. Todas mostraron susceptibilidad. Se confirmó la susceptibilidad de
V. monoica al virus de la mancha anular y se observó que la supuesta resistencia de
V. cauliflora y V. cundinamarcensis sólo existe en ciertas plantas de estas especies. Se
encontró resistencia a la bacteria del cancro en cuatro de seis genotipos evaluados.
Los aislados del virus de la mancha anular provenientes de Colombia y Ecuador
mostraron un variación limitada entre ellos y con los de México, abriendo perspectivas
interesantes para la aplicación de métodos de protección cruzada o el uso de cultivares
transgénicos existentes.
2
2. Actividades desarrolladas
2.1. Colecta, recuperación, intercambio y conservación de los recursos genéticos de
papayas
2.1.1. Colectas, colecciones e intercambios
En Colombia, los equipos de la Universidad Nacional (sede Medellín) y CORPOICA
reportaron en 2001 la colecta de 106 materiales de las especies de tierra baja, Carica
papaya, Vasconcellea cauliflora, V. crassipetala, V. sphaerocarpa y Jacaratia
dolichaula, y de altura, V. goudotiana, V. cundinamarcensis, esencialmente en la parte
noroccidental del país (Costa Caribe, valles interandinos de Antioquia y norte de la Costa
Pacífica). Han preparado y utilizado un formato de levantamiento de datos de pasaporte y
descripción preliminar de los materiales colectados, el cual ha sido revisado con los
coordinadores y difundido para su utilización en las otras instituciones del proyecto
(anexo 2 del informe 2001). Las semillas colectadas están conservadas en el banco de
germoplasma de Corpoica, en Rionegro (Antioquia). La colección de campo está en el
mismo sitio, para las especies que soportan un clima frío (74 accesiones), mientras se
sembraron en el Centro Agropecuario Cotové de la Universidad Nacional (sede Medellín)
y en el Centro de Investigación La Libertad de Corpoica, en los Llanos Orientales. A
partir de la colección se ha obtenido semilla para almacenamiento del germoplasma a
10°C y 10%HR. La Universidad de Caldas juntó una colección de 70 accesiones de
especies del género Vasconcellea, esencialmente en la zona central del país. Las semillas
están conservadas en cuarto frío a 5°C y 30%HR.
En el Ecuador, la Universidad Técnica de Ambato colectó 50 accesiones del género
Vasconcellea en las provincias de Chimborazo, Tungurahua, Cañar, Loja, Azuay y
Cotopaxi. Como en Colombia, se caracterizó este material in situ. Esta material está
conservado, cultivado, en invernadero o, en forma de semillas, en cámara fría a 4°C.
En Venezuela, se visitaron seis importantes herbarios y se mapearon las distribuciones de
C. papaya, V. microcarpa, V. cauliflora y V. cundinamarcensis, para preparar las colectas
del 2002. También se inventariaron los materiales presentes en la estación experimental
Bajo Seco de la UCV. En la región central y oriental del país, se colectaron seis tipos de
C. papaya y muestras de V. cauliflora y V. cundinamarcensis, los cuales fueron
propagados con los que se recibieron de CORPOICA y la UN de Colombia: cv. Cotové,
cv. Sofia, V. goudotiana y V. cundinamarcensis. También se sembraron las accesiones
recibidas el año anterior: ‘Cartagenera Roja’, ‘Paraguanera’, ‘Red Lady’ y ‘Maradol’. El
INIA y la UCV acordaron establecer las papayas de altura en la Estación Experimental
Bajo Seco para la reconstrucción del banco de germoplasma de Caricaceae. Los primeros
materiales establecidos son V. cauliflora, V. cundinamarcensis y V. goudotiana.
3
2.1.2. Conservación del germoplasma
Los primeros estudios de la unidad de recursos genéticos del CIAT habían mostrado el
efecto nefasto de muy bajos contenidos de humedad sobre semillas de papaya. La
segunda fase del estudio se centró en probar protocolos de conservación para un año,
experimentando en dos variedades, con tres contenidos de humedad (11, 9, y 5%) y
cuatro temperaturas de conservación (22, 7, -20 y -196°C), y con lectura a los 0, 6 y 12
meses. La germinación no se vio afectada por las diferencias de humedad. Sin embargo,
las semillas con contenido de humedad de 11% mostraron mayor fragilidad a la
conservación a bajas temperaturas. El análisis permite concluir que las semillas de
C. papaya resisten desecación entre 11 y 5% al igual que conservación a temperaturas
entre 22 y -196°C, sin que haya una ventaja significativa para alguno de los tratamientos,
lo que concuerda con su clasificación en el tipo intermedio. La germinación de la
variedad 1, más baja en la prueba inicial, mejoró en las dos lecturas siguientes.
Posiblemente las bajas temperaturas de conservación actuaron como mecanismo de
estratificación, rompiendo latencia.
Paralelamente, se establecieron las curvas de secado e imbibición de las semillas de
papaya común. Se pudo observar como las semillas absorben agua muy rápidamente en
las primeras 24 horas, llegando a contenidos de humedad de 77%. Esto sugiere que la
latencia de estas semillas está asociada a factores endógenos y no a factores externos
como sus cubiertas.
2.2. Caracterización y evaluación
2.2.1. Caracterización morfológica
En la colección del C.I. La Selva de Corpoica, se caracterizaron 44 accesiones de las
especies V. goudotiana (25), V. cundinamarcensis (18) y V. longiflora (1), usando una
primera versión del listado de descriptores adaptado a las especies del mismo género. La
información se registró, en forma individual, en cinco plantas por accesión. Las figuras 1
a 4 muestran los dendrogramas para los caracteres cualitativos y cuantitativos, por sexo.
Los atributos cualitativos presentan poder discriminante a nivel taxonómico, tanto en
árboles femeninos como masculinos. Existe amplia variación en los caracteres
cuantitativos, tanto en hembras como en machos. En los últimos, permiten una mejor
discriminación taxonómica que en las hembras, quizás porque en este caso se incluyen
variables de frutos, sujetas a selección convergente en las dos especies.
Esta primera experiencia permitió revisar la lista de descripciones y proponer
modificaciones para completar, simplificar y sistematizar la colecta de la información. La
segunda versión se probó y completó con investigadores de la U.T. Ambato, en un viaje
al Ecuador, donde se pudieron caracterizar plantas de otras especies, como V. stipulata
(jigacho), V. x heilbornii ‘Babaco’ y otros probables híbridos, V. monoica, V. parviflora y
V. palandensis. La lista actual está presentada en el anexo 1.
4
Figura 1. Dendrograma elaborado a partir de los caracteres morfológicos cualitativos (hembras, colección de Corpoica).
2259
2275
2272
2274
2273
2375
2278
2276
2376
2279
2270
2374
ILS307
2269
C1042280
2271
2266
2300
2260
2263
2268
2277
2265
Paproja
CDRLLG
ILS238
ILS313
ILS328
ILS331
ILS324
ILS340
ILS274
ILS441
ILS 245
ILS264
ILS268
ILS326
ILS325
ILS341
ILS357
ILS285
ILS327
ILS443
V. goudotiana
V. longiflora
V. cundinamarcensis
0.30
0.47
0.65
Coeficiente de similitud
0.82
1.00
5
Figura 2. Dendrograma elaborado a partir de los caracteres morfológicos cualitativos (machos, colección de Corpoica).
2260
2279
2265
2276
2300
2374
2375
2264
ILS 307
ILS 321
2270
2277
2376
Paproja
2266
2274
2275
2272
2273
2269
2268
CDRLLG
2278
ILS 309
ILS 310
ILS 331
ILS 312
ILS 326
ILS 443
2263
C1042280
ILS 245
ILS 264
ILS 268
ILS 341
ILS 325
ILS 327
ILS 328
ILS 288
ILS 315
ILS 324
ILS 314
ILS 340
V. goudotiana
V. cundinamarcensis
0.47
0.60
0.73
Coeficiente de similitud
0.87
1.00
6
Figura 3. Dendrograma elaborado a partir de los caracteres morfológicos cuantitativos (hembras, colección de Corpoica).
2259
2266
2273
PAPROJA
2265
2376
2260
2275
2268
2270
2272
2277
ILS313
2300
2374
ILS357
ILS341
ILS 443
2271
2375
ILS340
ILS245
ILS328
ILS285
2263
2279
C1042280
2269
2276
2274
ILS331
ILS307
2278
ILS441
ILS268
ILS325
ILS324
ILS326
ILS238
ILS264
ILS327
ILS274
CDRLLG
0.00
V. goudotiana
V. longiflora
V. cundinamarcensis
0.22
0.45
Distancia
0.67
0.89
7
Figura 4. Dendrograma elaborado a partir de los caracteres morfológicos cuantiitativos (machos, colección de Corpoica).
2259
2266
2273
PAPROJA
2265
2376
2260
2275
2268
2270
2272
2277
ILS313
2300
2374
ILS357
ILS341
ILS 443
2271
2375
ILS340
ILS245
ILS328
ILS285
2263
2279
C1042280
2269
2276
2274
ILS331
ILS307
2278
ILS441
ILS268
ILS325
ILS324
ILS326
ILS238
ILS264
ILS327
ILS274
CDRLLG
0.00
V. goudotiana
V. longiflora
V. cundinamarcensis
0.22
0.45
Distancia
0.67
0.89
8
En un segundo viaje al Ecuador, investigadores del grupo CIRAD/IPGRI y de la
U. Caldas colaboraron con personal de la U.T. Ambato para caracterizar 42 plantas en
colección e in situ, incluyendo 18 de V. stipulata, 14 de V. x heilbornii, seis de
V. cundinamarcensis, una de V. parviflora, una de V. palandensis y dos V. sp. También
apoyaron a estudiantes de la U. Caldas para la identificación y la caracterización de la
colección correspondiente.
2.2.2. Caracterización bioquímica y molecular
En colaboración con el grupo CIRAD/IPGRI, la Unidad de Recursos Genéticos del CIAT
el C.I. La Selva de Corpoica y la U.T. Ambato, investigadores de la U. Caldas han
adaptado protocolos desarrollados por el CIAT y el CIRAD en otras especies. De 14
sistemas ensayados, ocho se han mostrado polimórficos para los géneros Carica y
Vasconcellea (GOT, ACP, DIA, á-EST, PGM, PGI, 6-PGDH y SKDH). A nivel
intergenérico, Carica y Vasconcellea presentan patrones isoenzimáticos muy diferentes
(figura 5). Dentro de Vasconcellea, existe una importante variación. V. cauliflora muestra
bandas diferentes en comparación con las demás especies. La muestra estudiada incluye
132 plantas de 66 accesiones de los dos géneros, provenientes de Colombia y Ecuador. El
nivel de ejecución está indicado en la tabla 1.
Figura 5. Gel de electroforesis de la isoenzima α Esterasa para diferentes especies. Se puede observar el
polimorfismo marcado entre los géneros Carica (C.p) y Vasconcellea (V. spp.).
9
Tabla 1. Material de Caricaceae evaluado con marcadores isoenzimáticos.
Especie
V. goudotiana
V. cundinamarcensis
V. sphaerocarpa
V.cauliflora
V. crassipetala
V. longiflora
V. stipulata
V. x heilbornii
C.papaya.
Plantas
a
evaluar
/accesión
28
68
4
6
4
2
4
4
12
N°°
accessiones
14
34
2
3
2
1
2
2
6
Plantas evaluadas/Sistemas Enzimáticos
α EST
GOT
ACP
DIA
PGM
PGI
SKDH
14
25
2
3
2
1
2
2
4
14
25
2
3
2
1
2
2
4
14
25
2
3
2
1
2
2
4
14
25
2
3
2
1
2
2
4
12
15
2
2
1
1
1
1
2
12
15
2
2
1
1
1
1
2
12
15
2
2
1
1
1
1
2
6
PGDH
12
15
2
2
1
1
1
1
2
Con fines de desarrollar marcadores microsatélites y estudiar las relaciones entre
C. papaya. y sus especies más cercanas fue construida una genoteca enriquecida de
secuencias di-nucleotidas. Se obtuvieron 507 clones, de los cuales 147 fueron positivos
(presencia de microsatélite). Los clones fueron secuenciados y seleccionados según la
ubicación del microsatélite dentro de la secuencia. A partir de 76 secuencias se diseñaron
los iniciadores utilizando el programa Primer 3. Estos iniciadores se evaluaron en tres
genotipos de C. papaya y en ocho especies del genero Vasconcellea (V. Sphaerocarpa,
V. cundinamarcensis, V. crassipetala, V. goudotiana, V. cauliflora, V. stipulata,
V. monoica, V. x heilbornii) sobre un gel de agarosa. Un total de 70 iniciadores
funcionaron en papaya, mientras solamente cuatro permitieron amplificación en las ocho
especies de Vasconcellea estudiadas; 35 iniciadores fueron seleccionados teniendo
encuenta su resolución e intensidad de las bandas amplificadas. Estos fueron utilizados en
un pequeño estudio de diversidad con 30 genotipos de papaya provenientes del arco
antillano y 11 de Vasconcellea de los Andes de Colombia y Ecuador (papaya de altura).
Los resultados mostraron 26 iniciadores polimórficos en papaya y cuatro en papaya de
altura con un total de 104 alelos para el conjunto. (TC)n fue el motivo de mayor
repetibilidad, seguido por (GA)n. Los microsatélites han permitido diferenciar claramente
los dos géneros, confirmando la reciente reclasificación taxonómica.
La figura 6 muestra un ejemplo del iniciador Cp 1H05 donde se diferencian claramente
los géneros Carica y Vasconcellea y la tabla 2 presenta la lista de los iniciadores
utilizados para el estudio de diversidad.
A partir de los iniciadores seleccionados se realizará un estudio de diversidad sobre un
mayor número de genotipos provenientes de Colombia y Ecuador. Además se rediseñarán
iniciadores que no tienen una clara definición e intensidad de las bandas amplificadas en
el género Vasconcellea para incluirlo en el estudio.
10
Carica
Vasconcellea
Figura 6. Ejemplo del iniciador Cp 1H05 diferenciando los géneros Carica y Vasconcellea
2.3.3. Evaluación de resistencias
2.3.3.1. Nemátodos
Los nematólogos del INIA-CENIAP habían evaluado la acción del nemátodo
Meloidogyne incognita en cinco materiales de Caricaceae : C. papaya, cultivares Sofia,
Cartagena Amarilla y Paraguanera, V. cauliflora y V. cundinamarcensis. Todas las
plantas inoculadas habían presentado formación de agallas. Hubo diferencias
significativas entre los materiales evaluados para el peso aéreo y radical fresco, a
excepción de V. cauliflora que no presentó diferencias para el peso radical. V. cauliflora
y V. cundinamarcensis se pudieron considerar resistentes - no tolerantes a la acción del
nemátodo - en virtud de que a pesar de reducir las variables agronómicas evaluadas, el
nemátodo no se reprodujo.
11
Tabla 2. Lista de iniciadores polimórficos utilizados para el estudio de diversidad con marcadores
microsatélites.
#
Repetición
Temperatura
Tamaño
Número de alelos
1
Cpa1A08-F1
Cpa1A08-R1
Código
(CT)18..(GA)3
54
48
320
7
2
Cpa1B03-F1
Cpa1B03-R1
(CT)20..(AC)5
50
50
293
4
3
Cpa1B08-F1
Cpa1B08-R1
(TA)4..(AG)18
48
48
347
5
4
Cpa1B12-F1
Cpa1B12-R1
(TC)8
44.51
44.78
283
2
5
Cpa1C04-F1
Cpa1C04-R1
(GA)9..CA..(AG)6
48.12
48.98
283
5
6
Cpa1C08-F1
Cpa1C08-R1
(AG)7 (GA)10
50.01
50.47
271
6
7
Cpa1D08-F1
Cpa1D08-R1
(TC)9
48.23
47.54
155
2
8
Cpa1E02-F1
Cpa1E02-R1
(AG)8
49.48
49.49
319
4
9
Cpa1E03-F1
Cpa1E03-R1
(CT)9…(CT)9
47.51
48.32
293
3
10
Cpa1F02-F1
Cpa1F02-R1
(GA)9
49.84
49.79
281
2
11
Cpa1G05–F1
Cpa1G05–R1
(GA)12
50.96
51.04
282
2
12
Cpa1G12-F1
Cpa1G12-R1
(GA)5..(GA)13..A..(AG)4
49.59
50.51
219
4
13
Cpa1H02-F1
Cpa1H02-R1
(CT)18
50.44
50.19
320
5
14
Cpa1H03-F1
Cpa1H03-R1
(TC)24
41.51
41.6
272
6
15
Cpa1H05-F1
Cpa1H05-R1
(TC)10
50.46
50.18
163
10
16
Cpa1H11-F1
Cpa1H11-R1
(CT)9...(TC)11
47.51
48.31
267
3
17
Cpa1H12-F1
Cpa1H12-R1
(TC)11 (CT)13
50.2
49.6
228
3
18
Cpa2A05-F1
Cpa2A05-R1
(CT)9
49.53
50.03
281
3
19
Cpa2C11-F1
Cpa2C11-R1
(AG)9 (TC)9
48.24
48.51
224
2
20
Cpa2D04-F1
Cpa2D04-R1
(GA)5.AC.(GA)9
49.84
50.13
130
3
21
Cpa2D07-F1
Cpa2D07-R1
(TC)15
46.22
46.66
329
3
22
Cpa2E02-F1
Cpa2E02-R1
(AG)9
50.45
49.96
299
2
23
Cpa2E05-F1
Cpa2E05-R1
(TC)12
50.13
50.31
348
2
24
Cpa2F08-F1
Cpa2F08-R1
(CT)9
49.9
49.9
130
4
25
Cpa2F10-F1
Cpa2F10-R1
(TC)14
49.72
49.05
190
7
26
Cpa2F11-F1
Cpa2F11-R1
(TC)14
50.32
50.02
227
5
12
En 2001 se evaluó la resistencia de seis materiales a una población mixta de este mismo
nemátodo y de Rotylenchulus reniformis, situación análoga a lo que se observó el año
anterior en casi todos los cultivos comerciales. Los materiales evaluados fueron las
accesiones ‘Pajarera’ (papaya asilvestrada), ‘Red Lady’, ‘Maradol’ de C. papaya y A y B
de V. goudotiana. Los resultados preliminares indican que todos ellos fueron
susceptibles, al presentar disminución de las características agronómicas estudiadas (peso
aéreo fresco, peso radical fresco y altura). El cultivar Red Lady mostró el mayor valor
para el Factor de Reproducción. Actualmente se realizan estudios histológicos de estos
materiales, para confirmar las alteraciones que causan estos parásitos en los tejidos.
2.3.3.2. Virus de la mancha anular (Papaya Ring Spot Virus: PRSV)
Se probó la resistencia de tres especies del género Vasconcellea (V. cauliflora,
V. cundinamarcensis y V. monoica) al virus de la mancha anular. Las dos primeras se
consideran resistentes, al contrario de la última. Fueron inoculadas con cepas de
Venezuela, Hawaii, Taiwan, Tailandia y México y se realizaron pruebas biológicas,
sexológicas (ELISA) y molecular (hibridaciones ARN-ADNc).
En general, los primeros síntomas aparecieron después de 10 días de la inoculación, y
fueron diferentes de acuerdo a la especie y, dentro de la especie, de acuerdo a las cepas
del virus.
En V. monoica, las cepas venezolanas y tailandesa indujeron síntomas sistémicos severos.
La cepa tailandesa fue más severa e indujo necrosis en los márgenes de las hojas y en los
ápices, hasta que las plantas murieron. Las cepas taiwanesa y hawaiana indujeron
síntomas sistémicos y lesiones locales en las hojas nuevas. El aislado mexicano indujo
lesiones locales en las hojas y necróticas en las nervaduras de las hojas.
En V. cauliflora, el aislado venezolano indujo lesiones locales (pocas, algunas o severas)
en algunas plantas; solo síntomas sistémicos; o la combinación de ambos síntomas; y
manchas grasientas en el tallo. La mayoría de las plantas se recuperaron de después de 21
días de la inoculación. Sin embargo, otras siguieron mostrando síntomas sistémicos.
En V. cundinamarcensis, la cepa venezolana indujo epinastia de las hojas, lesiones
locales necróticas y lesiones necróticas en las nervaduras y hojas nuevas. A los 15 días de
la inoculación, las plantas mostraron muerte regresiva, algunas plantas murieron (30 %),
el 70 % se recupero y formaron hojas nuevas sin síntomas.
C. papaya y C. metuliferus mostraron los síntomas típicos de la enfermedad.
En general, las pruebas biológicas y moleculares fueron mas sensibles que la prueba
serológica, demostrándose la presencia del virus en todas las especies de Vasconcellea.
Mediante la prueba molecular se comprueba que las plantas de V. cauliflora y
V. cundinamarcensis recuperadas, que no mostraron síntomas en las hojas nuevas,
después de 21-35 días de la inoculación, no presentaban el virus. Estos resultados
sugieren algún mecanismo de resistencia en algunas de las plantas inoculadas y que
13
dichos mecanismos quizás sean diferentes en estas dos especies. Estudios en desarrollo
incluyen la respuesta de estas dos especies a los demás aislamientos del PRSV y las
respuestas de V. stipulata y V. goudotiana a dichos aislados.
2.3.3.2. Bacteria del cancro
Seis genotipos de Caricaceae se utilizaron para estudiar su reacción ante dos cepas de la
bacteria Erwinia sp. Entre ellos, ‘Maradol’ y ‘Pajarera’ mostraron susceptibilidad,
mientras el resto de los genotipos presentaron resistencia a la enfermedad.
2.4. Selección y difusión de material élite
Mientras no estén suficientemente caracterizados y evaluados los materiales colectados y
sembrados en colecciones, no se pueden reportar resultados de selección ni difusión.
2.5.Estudio de la variabilidad de los dos principales patógenos
2.5.1. Variabilidad del virus
2.5.1.1. Estudio de la Unidad de Virología del CIAT en Colombia y Ecuador
En las visitas recientes efectuadas a plantaciones de papaya en el Ecuador, se observó la
manifestación más severa del PRSV, consistente en la deformación foliar total y en la
caída de todo el follaje y los frutos. Hasta el momento solo se ha logrado el control de la
enfermedad mediante la transformación genética de variedades de papaya. Debido a que
el virus de la mancha anular de la papaya (Potyviridae) presenta variabilidad genética, es
necesario estudiar este fenómeno a nivel regional con el fin de estandarizar las medidas
de control. En este informe se describen los últimos trabajos de caracterización molecular
de cepas del PRSV recolectadas en Colombia y Ecuador.
Se analizaron muestras de tejido foliar de C. papaya recolectadas en Colombia (Santa
Marta (Atlántico); Santafé de Antioquia (Antioquia); Viterbo (Caldas); Yotoco (Valle del
Cauca) y en una localidad al sur de Colombia, en territorio ecuatoriano.
Partículas con apariencia potyviral fueron detectadas por microscopía electrónica en
tejido foliar de plantas de C. papaya. La extracción de ARN total apto para RT-PCR se
obtuvo de tejido recientemente colectado, que aún presentaba un estado suculento en su
apariencia. Contrasta con la pobre calidad y cantidad de ARN total obtenida de tejido
seco de hojas de papaya que fueron inmunoreactivamente positivas a potyvirus en una
prueba de ELISA. A partir del ARN total (t),l se realizó la síntesis de ADN
complementario (c).
14
Las muestras de hojas de papaya que presentaron partículas como potyvirus, amplificaron
un producto del RT-PCR, de 800 pares de bases con los oligonucleótido degenerado
U341 y el iniciador complementario PolidT. Esto es lo esperado para un potyvirus en la
región terminal de la proteína de la cubierta y la región que no codifica. La secuencia
parcial de nucleotidos de las muestras de Santafé de Antioquia y Ecuador presentan la
menor similitud (75%) entre los aislados de Colombia y Ecuador (tabla 3). Todos los
aislados virales presentaron homología con el potyvirus de la mancha anular de la papaya
a partir de la comparación de secuencias publicadas de potyvirus en Carica papaya. Las
muestras de Colombia se agrupan de manera coherente al compararse con 16 diversos
aislados PRSV de América y Asia (figura 7). Los aislados PRSV de Colombia se agrupan
con un 85% de similitud con aislados PRSV de México, las Indias occidentales, Hawai y
Taiwán de manera más coherente que con los aislados de la India (en el 87% de 1000
submuestreos de construcción del árbol).
En conclusión, las evidencias reunidas con la amplificación de PCR y la secuencia de
nucleótidos indican que los aislados de Colombia y Ecuador pertenecen al grupo del
PRSV. Los análisis de similitud de las muestras de Colombia y Ecuador indican que a
pesar de la distribución geográfica en más de 200 km en la esquina norooccidental de
América del Sur, tales agentes presentan una similitud de secuencias para la región que
codifica por la proteína de la cubierta y el UTR, comparable con la variación observada
en otros aislados obtenidos en México, lo cual sugiere una variación genética
relativamente baja en los aislados colombianos. Estos resultados continúan siendo
prometedores para el desarrollo de resistencia genética al PRSV en la región andina
porque abren interesantes perspectivas para la aplicación de métodos de protección
cruzada y el uso de los materiales transgénicos existentes.
Tabla 3. Similitud de las secuencias parciales de potyvirus aislados de C. papaya en Colombia y Ecuador.
Nucleotidos
secuenciados
570
900
673
650
230
499
Fuente del aislado viral
1. Col-Yotoco-Valle del Cauca
2. Col-Santa Marta-Magdalena
3. Ecuador
4. Col-Ginebra-Valle del Cauca
5. Col-Viterbo-Caldas
6. Col-Santafé-Antioquia
Similitud de secuencias de nucleotidos
1
2
3
4
5
100.0
96.1
100.0
94.9
94.3
100.0
93.8
87.4
86.1
100.0
96.9
95.6
96.0
98.2 100.0
86.6
79.9
75.6
78.8
96.5
2.5.1.2. Estudio del INIA en Venezuela
Hojas jóvenes con síntomas de la enfermedad fueron colectadas en distintas regiones de
Venezuela y se estudió la diversidad del virus mediante análisis de SSCP (single-strand
conformation polymorphism) y de secuencias nucleotidicas de los genes que codifican
para la cubierta protéica y la polimerasa viral. Los productos de PCR analizados
mostraron polimorfismo de los genes que codifican para la cápside protéica del virus
(figura 8). Este trabajo está todavía en curso.
15
Colombia-Viterbo-Caldas
Colombia-GinebraValle del Cauca
Colombia-Santafe-Antioquia
Colombia-YotocoValle del Cauca
Colombia-Santa Marta
Ecuador
Mexico-AF319504
Mexico-AF319495
Mexico-AF319499
Hawaii-S46722
USA-Florida-AF196839
Mexico-AF319487
Mexico-AF309968
Mexico-AF319502
Mexico-AF319490
USA-Puerto Rico-AF196838
Mexico-AY017190
Mexico-PRI012650
Mexico-PRI012099
China-Taiwan-PRVNIAB
India (AF323638)
India (AF323637)
100
90
80
70
60
Figura 7. Arbol de porcentaje de similitud de secuencias de aislados de PRSV de diferentes orígenes.
50
16
Figura 8. Electroforésis en geles de agarosa de los productos de PCR amplificados utilizando los
iniciadores para CP. 1) escala de marcadores 100 pb; 2) ARN de planta sana; 3-9) ARN extraido de plantas
enfermas en diferentes localidades; 10) escala de marcadores 1kb.
2.5.2. Variabilidad de la bacteria
Se extrajo el ADN de 12 cepas de Erwinia del Caribe : St Vincent (Pembroke y South
Rives), Martinique (Rivière Pilote y Dumanoir), Guadeloupe (Moule y Capesterre), St
Croix (Lagrange) y St Lucia (Rabot y Richefonds).
En Venezuela, se aisló el patógeno de plantas con síntomas de cancro, por siembra
directa y por dilución en medio nutritivo. Las colonias bacterianas fueron purificadas y su
patogenicidad comprobada mediante infección mecánica de C. papaya cv. Solo. Cinco
colonias patogénicas se caracterizaron morfologicamente y por pruebas bioquímicas y
fisiológicas. Estas cepas venezolanas serán proximamente caracterizadas
molecularmente.
17
3. Resultados parciales en relación con los resultados esperados
3.1. Colecciones nacionales con un promedio de 150 accesiones
La meta de conservación de las accesiones en colecciones de campo ya está ampliamente
cumplida en Colombia. Ahora se deberá priorizar el trabajo de caracterización
morfológica. En el Ecuador, podemos considerar el progreso satisfactorio, tomando en
cuenta la reducción del presupuesto en 50%, ya que se dispone de más de 50 accesiones.
Para Venezuela, sólo se han realizado colectas menores, pero se están organizando
actividades más extensas.
La caracterización morfológica está progresando en estas colecciones.
3.2. Caracterización bioquímica y molecular
La meta de 150 accesiones caracterizadas sigue técnicamente realizable si los países
pueden intercambiar germoplasma. Los problemas generados por la entrada en vigencia
de nuevas reglas de acceso a los recursos genéticos en la región podrían dificultar el
pleno cumplimiento de este objetivo.
Con isoenzimas, se está caracterizando una primera muestra de 66 accesiones.
Marcadores microsatélites han sido desarrollados exitosamente para C. papaya y el
trabajo está en curso para el género Vasconcellea.
3.3. Inventario de las cepas del virus de la mancha anular y de la bacteria del cancro
Los resultados obtenidos en Colombia son muy satisfactorios. Pronto dispondremos de
datos de diversidad del virus y de la bacteria en el arco antillano y en Venezuela de parte
del IVIC y del INIA.
3.4. Metas relacionadas con otras actividades
El establecimiento de una colección nuclear regional y la selección de genotipos elite
corresponden a una fase ulterior. Constituyen un resultado final del proyecto.