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PCR en tiempo real.
Fundamentos.
Lic. Guido Fernández Marinone
2014
PCR cuantitativa
¿Cómo hacer para conocer la cantidad
exacta de copias originales presentes en la
muestra?
¿Qué problemas plantea este método?
Cinética de la reacción de PCR
Cinética de la reacción de PCR
Los comienzos
Los comienzos
Gráfico representativo de amplificación
Threshold = umbral
Ct=Cq ciclo de cuantificación
“La cuantificación del ADN se debe hacer
en la parte lineal de la escala logarítmica”
Aritmética
Logarítmica
UMBRAL
El punto dónde se acumula la fluorescencia
en la muestra y cruza el UMBRAL se llama
CICLO UMBRAL (Cq)
El CICLO UMBRAL es inversamente
proporcional al número de copias del
target: a mayor concentración de target
inicial, menor Cq.
UMBRAL
UMBRAL
Eficiencia de reacción
La eficiencia es máxima en la fase exponencial. Para cada par de
primer hay que probar la eficiencia que tiene que ser entre 95-105%.
¿Qué necesitamos para hacer una qPCR?
Necesitamos un termociclador en tiempo
real.
Señal, que puede ser por intercalantes o
sondas marcadas con fluorocromos.
Agentes intercalantes
Bromuro de etidio, SYBR Green, Eva Green.
Sondas con fluorocromos
DONOR y ACEPTOR en estrecha proximidad.
Espectro de excitación del ACEPTOR debe solapar
con el espectro de emisión del DONOR
Sondas FRET
Sondas de hidrólisis (Taqman)
Molecular beacons
Comparación entre las químicas de la
qPCR
Especificidad de la señal
Esta una curva de disociación con
productos específicos.
Diseño de un experimento de qPCR (S.
Deveaux; 2010)
Real-Time PCR Data Markup Language (RDML)
Cuantificación absoluta
Curva estándar externa (ADN o ARN), se
requieren idénticas eficiencias para el
estándar y la muestra.
Curva estándar externa y control interno
(ADN o ARN) útil para detectar
potenciales inhibidores de reacción en
cada muestra. Ej: bacteriología.
Muy difícil de reproducir, requiere un
operador entrenado.
Cuantificación relativa
Respecto a un control endógeno (ARN):
el target se mide con transcriptos de al
menos dos genes de referencia.
Respecto a un gen de copia única (ADN),
el target se mide en relación a un gen
celular de copia única, preferiblemente
ubicado en el mismo cromosoma que el
target. Ej: medir número de copias de un
gen.
¿Qué voy a tener en una placa de
qPCR?
Mis muestras por triplicado.
Mis dos genes de referencia, también por
triplicado.
Un control sin templado, (un control
negativos o NTC), que puede dar señal
cerca del ciclo 40, no me preocupo por
eso.
Elementos a tener en cuenta para una correcta
cuantificación utilizando la curva cinética de
amplificación de la qPCR
Estimación de la línea de base
Establecimiento de la línea de cuantificación
Determinación de la eficiencia de la
amplificación
Cálculos
GOI
RQ
RG1 RG2
RQ RQ NF
GOI
RG RG
1 2 GOI RG1 RG2
0,77
0,96
1,37
eficienci prom
a
Cq
GOI
nro
muestraCq
24,36
1
24,26
24,08
2
23,87
23,55
3
23,33
23,52
4
23,37
24,83
5
24,76
23,84
6
23,66
23,31
7
23,39
24,18
8
24,39
23,92
1,93
Cq DS RQ
23,92
Log
trasnf
1,37
0,56
24,31
0,14
0,77
-0,11
1,12
23,98
0,27
0,96
-0,02
1,45
23,44
0,12
1,37
0,14
0,79
23,45
0,80
1,37
0,14
24,80
0,55
0,56
-0,25
23,75
0,27
1,12
0,05
23,35
0,48
1,45
0,16
24,29
0,24
0,79
-0,10
23,92
0,36
1,31 0,95
miR16
let7a
miR16
let7a
NRQ
NRQ
M
M
GOI
RG1
NRQ
NRQ
M
M
1,17
0,85
0,46
-0,46
0,69 0,69
-0,16
0,97
1,28
0,78
0,72
-0,72
0,99 0,99
0,00
0,80
1,13
0,89
0,34
-0,34
1,70 1,70
0,23
2,17
1,05
0,95
0,15
-0,15
0,63 0,63
-0,20
2,18
1,08
0,93
0,22
-0,22
0,26 0,26
-0,59
0,76
0,97
1,03
-0,08
0,08
1,47 1,47
0,17
0,65
0,51
1,98
-1,97
1,97
2,22 2,21
0,35
0,49
1,06
0,95
0,16
-0,16
1,61 1,61
0,21
1,03
0,23
1,04
0,39
0,00
0,83
0,00
0,83
RQ RQ RQ NF
1,31 0,95
0,77
1,12
1,25 0,76
0,96
0,91 0,71
1,37
2,29 2,06
1,37
2,35 2,02
0,56
0,74 0,78
1,12
0,33 1,30
1,45
0,51 0,46
0,79
1,25 0,76
0,91 0,71
2,29 2,06
2,35 2,02
0,74 0,78
0,33 1,30
0,51 0,46
miR16 let7a
36,9
22,50 2
coeficiente de
variacion
prom
cont
M
promedio
29,71 %
menor 25%
0,83
menor
0.5
RQ= Ef^(Prom Cq – Prom Cq muestra)
NF= media geométrica
NRQ = RQ/NF
mir-122
NRQ
Log transform
RG2
Log
transform
NRQ
1,00 1,00
DS
prom
trat
0,49
1,39
DS
0,82
Libro recomendado de consulta
Diagnóstico
Identificación de tumores resistente
mediante su expresión génica.
Identificación de enfermedades prenatales
monogénicas causadas por cambios en un
nucleótido.
Microbiología
Brinda un rápido diagnóstico.
Examinación de susceptibilidad a
antibióticos.
Detección de genes bacterianos específicos.
Detección de mutaciones.
Tipificación vírica mediante sondas
secuencia-específicas.
Medición de carga viral (ROCHE, sondas de
hidólisis).
qPCR: troubleshooting
Los problemas en la qPCR comienzan desde la
extracción del material.
Para extraer el ARN limpiar las mesadas con
EtOH 70%, al igual que el material. Si se tiene
RNAse away o RNAse Zap mejor.
Chequear la pureza mediante la absorbancia
(260, 280, 230) e integridad mediante gel de
agarosa.
La pureza se puede mejorar mediante kits a
base de columnas (pero el rendimiento baja).
qPCR: troubleshooting: integridad
Tratar cuba electroforética con NaOH 0,5 M
por ½ - 1 hora
Usar agua miliQ para preparación de buffer y
muestras. Siempre esterilizo el agua miliQ, de
histérico nomás.
NO reutilizar el buffer.
Separar reactivos exclusivamente para ARN
(agarosa, gelred, Loading Buffer).
Tener un juego de pipetas exclusivo para
molecular en lo posible.
qPCR: troubleshooting: la RT
Es el paso que más variabilidad trae. Gran
cantidad de pasos con pipetas que
aumentan el error, el iScript (BioRad) es
un buen kit para disminuir todo eso.
qPCR: troubleshooting: la qPCR
Se recomiendan hacer triplicados (tanto de
las muestras como de los genes de
referencia), pero aún así cada placa es un
mundo.
Cq elevadísimos!!!! La desviación estándar
por las nubes…
ARN realmente íntegro?
Problema en la qPCR?? Usar un control
Problema en la RT? Pueden ser las enzimas.
qPCR: troubleshooting: la qPCR
Lámpara de excitación o el intercalante??
qPCR: troubleshooting: la qPCR
Mucho SYBR
qPCR: troubleshooting: la qPCR
Dímero de primer: cambiar la temperatura
de annealing, rever la concentración y si
nada de esto funciona…hacer nuevos.
qPCR: troubleshooting: la qPCR
No tengo reacción, puede ser por los
GUANTES o…
El NTC da señales en Cq bajos, dímeros de
primers o contaminación.
qPCR: troubleshooting: la qPCR
•
Lidiar con las contaminaciones:
•
Usar DNAsa previo a la RT.
•
Juego de pipetas exclusivo (cuando se pueda).
•
Gel agarosa en sala aparte (cuando se pueda).
•
Alicuotar reactivos.
•
Hacer SIEMPRE blanco de reacción (NTC) para
cada gen.
Nomenclatura según MIQE (2009)
qPCR: no RT-PCR, queda confinada a
retrotranscripción.
Reference genes: genes de referencia, no
housekeeping gene.
Taqman probes: hydrolisys probes
FRET probe (flouresence resonance energy transfer
probes): es muy genérico, especificar cuales se están
usando.
Cq: quantification (y no quantitation) cycle y no se
recomienda el uso de Ct.
Hay una lista disponible on-line de datos
esenciales para poner en la publicación y de
otros que son deseables según MIQE (Minimum
Information for publication of Quantitative realtime Experiments).
Item to check
Importance
Experimental design
Definition of experimental and control groups
E
Muestras de hígado en 2 grupos, control y tratamiento
Number within each group
E
4
Assay carried out by the core or investigator’s laboratory?
D
Llevado a cabo en nuestro laboratorio
Acknowledgment of authors’ contributions
D
Sample
Description
Volume/mass of sample processed
Microdissection or macrodissection
E
D
E
Murciélagos con diferentes dietas (D. rotundus, T. brasiliensis, S. lilium, A. literatus)
50mg
Extracción de los órganos
Processing procedure
E
Los murciélagos fueron anestesiados con una inyección intraperitoneal ketamina (100 mg/kg ) / xilazina (3 mg/kg) y sacrificados por exceso de anestesia. Los órganos son aislados y lavados con solución salina.
If frozen, how and how quickly?
If fixed, with what and how quickly?
E
E
Las muestras son almacenadas en RNAlater, por una noche a 4ºC y luego colocados a -20ºC
No
Sample storage conditions and duration
E
Almacenadas a -20ºC hasta la extracción de ácidos nuecleicos
E
El ARN total fue extraído usando el kit Pure link (Ambion) siguiendo los protocolos del
fabricante. La homogeneización fue llevada a cabo en eppendorfs, extrayendo
previamente el ARNlater. El ARN purificado fue disuelto en 35ul de agua libe de
nucleasa y almacenado a -20ºC.
Name of kit and details of any modifications
E
Pure link (Ambion). Sin modificaciones.
Source of additional reagents used
D
Agua tratada con DEPC (Sigma)
Details of DNase or RNase treatment
E
1 ug de ARN es tratada con con 1 U of Turbo DNA free (Ambion) en un volumen final de reacción de 50ul. La digestión del ADN es lograda con una incubación de 1h a 37ºC. La reacción es parada con una solución inhibidora, DNase Inactivation Agent (Ambion) siguiendo una
incubación de 3min, posterior centrifugación.
Contamination assessment (DNA or RNA)
E
Controles negativos para la RT fueron llevados a cabo. Para ese propósito el ARN fue
procesado como una muestra normal, excepto que no se agrego transcriptasa
reversa.
Nucleic acid quantification
Instrument and method
Purity (A260/A280)
E
E
D
La concetración de ARN, fue medida a 260nm
Espectofotómetro AQ7 (Ampliquant)
La pureza de ARN fue obtenida mediante la relación 260/280.
Yeld
D
El rendimiento del ARN fue calculado como ug/ul.
RNA integrity: method/instrument
E
La integridad del ARN fue medida a través de un gel de agarosa (Genbiotech) al 1%, en buffer TBE 1X, visualizado con gelred en transiluminador
RIN/RQI or Cq of 3' and 5' transcripts
Electrophoresis traces
E
D
Inhibition testing (Cq dilutions, spike, or other)
E
Las curvas estándar utilizando muestras de cDNA a estudiar se considerò prueba para evaluar la presencia de inhibidores
Complete reaction conditions
E
Transcripción reversa: se colocó 1ug de ARN en un volumen final de 16ul, se le agregan 4ul de iScript (Biorad)quedando un volumen final de 20ul. Esta muestra es calentada 5min a 25ºC, luego 30min a 42ºC y por último 5min a 85ºC para inactivar. En este paso también se utiliza el
control negativo.
Amount of RNA and reaction volume
E
Cantidad de ARN 1ug, volumen de reacción: 20ul
Priming oligonucleotide (if using GSP) and concentration
E
Oligo dt y random primers
Reverse transcriptase and concentration
E
iScript (Ambion)
Temperature and time
E
En complete reaction conditions
Manufacturer of reagents and catalogue numbers
D
Turbo Dnase free (Ambion Cat.AM1907); iScript (Biorad Cat. 170-8890)
Cqs with and without reverse transcription
D
Se controló la eficiencia con una PCR de punto final, en un totoal de 30 ciclos.Luego se realizó un gel de agarosa
al 2,5%
Storage conditions of cDNA
qPCR TARGET INFORMATION
D
-20°C
Gene symbol
E
Gen de interes:MDR1; Gen de referencia: Eef1a1, y b actina
Sequence accession number
Location of amplicon
Amplicon length
In silico specificity screen (BLAST, etc)
E
D
E
E
M33581, NM010106
Pseudogenes, retropseudogenes or other homologs?
D
Nucleic acid extraction
Procedure and/or instrumentation
Reverse transcription
Sequence alignment
D
Secondary structure analysis of amplicon
D
Location of each primer by exon or intron (if applicable)
E
What splice variants are targeted?
qPCR OLIGONUCLEOTIDES
E
Primer sequences
E
RTPrimerDB Identification Number
Probe sequences
D
D
Location and identity of any modifications
E
Manufacturer of oligonucleotides
Purification method
D
D
Gen de interés: 120 pb ; Gen de referencia: 77, y 60 pb
Actina: Forward: TGCGTGACATCAAGGAGAAG; Reverse: CGGATGTCCACATCACACTT; MDR1 FW:: CTGAGACAGGATGTGAGCTG, Reverse primer 5´a 3´: AATCACAGCAAGCCTAGACC; Eef1a1; Forward primer 5´a 3´: CTGAACCATCCAGGCCAAAT, Reverse primer 5´a 3´:
GGCTGTGTGACAATCCAG
qPCR protocol
Las reacciones de PCR fueron llevadas a cabo en un termociclador Applied Biosystem 7500, usando SYBR Green Super Mix
(AB) en un volumen final de 25ul. La mix de reacción consisitió en 12,5ul de SYBR mix, 2,5ul agua libre de nucleasa, 2,5ul
de cada par de cebadores (forward and reverse) con una concetración 2.5 uM, y 5 ul de 1/50 cDNA. La PCR fue iniciado
con 2min incubación a 50°C, seguido por una etapa de 95°C por 10 seg, continuaron 40 ciclos de 15seg a 95ºC, 60°C por
1min y 72°C por 40 seg. Todas las reacciones fueron llevadas a cabo por triplicado.
Complete reaction conditions
E
Reaction volume and amount of cDNA/DNA
E
Complete reaction conditions
Primer, (probe), Mg2, and dNTP concentrations
E
Complete reaction conditions
Polymerase identity and concentration
E
Complete reaction conditions
Buffer/kit identity and manufacturer
E
Complete reaction conditions
Exact chemical composition of the buffer
D
Additives (SYBR Green I, DMSO, and so forth)
E
Complete reaction conditions
Manufacturer of plates/tubes and catalog number
D
Placas de PCR de 96 wells y flims opti well ambos provistos por Applied Biosystem
Complete thermocycling parameters
E
Reaction setup (manual/robotic)
D
Manual
D
Applied Biosystem 7500
Manufacturer of qPCR instrument
Complete reaction conditions
qPCR validation
Evidence of optimization (from gradients)
D
Specificity (gel, sequence, melt, or digest)
E
Curva de melting, las medidas de fluorescencia son medidas continuamente. La especificidad del gen fue confirmada con
la presencia de una sola banda en un gel de agarosa al 2,5% teñido con gelred. Controles sin templado (NTC) son
llevados a cabo.
For SYBR Green I, Cq of the NTC
E
L a señal fue en un Cq mayor a 36,9.
Calibration curves with slope and y intercept
E
MDR1: y= -3.42X + 32,65
PCR efficiency calculated from slope
E
CIs for PCR efficiency or SE
r2 of calibration curve
MDR1: 95,56
D
E
Linear dynamic range
MDR1: 0.996
E
Cq variation at LOD
E
CIs throughout range
D
Evidence for LOD
E
If multiplex, efficiency and LOD of each assay
Se realizaron 5 diluciones seríadas por triplicado del gen de inte´res y de los de referencia. Eea1f1 cq:20 ; b- actina Cq:
21; MDR1 Cq: 19
E
Data analysis
qPCR analysis program (source, version)
E
Method of Cq determination
E
Outlier identification and disposition
E
Results for NTCs
E
Excel 2007. Office 2007
7500 System SDS software
SD: 0,13
Justification of number and choice of reference genes
E
2 genes de referencia, b-actina y Eef1a
Description of normalization method
E
Utilización de 2 genes de referencia
Number and concordance of biological replicates
D
Number and stage (reverse transcription or qPCR) of technical replicates
E
Repeatability (intraassay variation)
E
Las muestras fueron realizadas por triplicado
Reproducibility (interassay variation, CV)
D
Power analysis
D
Statistical methods for results significance
E
Student t
Software (source, version)
E
Systat 12
Cq or raw data submission with RDML
D
SD: 0,05
No lo he hecho
¡Gracias por su atención!