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Rev. Salud Anim. Vol. 27 No. 3 (2005): 152-158
EXPRESIÓN DE GENES REPORTEROS EN LA LÍNEA QT 35
UTILIZANDO LA TRANSFECCIÓN CON LIPOSOMAS
Edenis Ramos*, Ivette Espinosa*, A. Vega*, D. Naranjo*, Siomara Martínez*,
Gabriela Calamante** y Maritza Barreras*
*Grupo de Biología Molecular y Virología Animal, Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA),
Apartado 10, San josé de las Lajas, La Habana, Cuba. Correo electrónico: [email protected];
**Lab INTA, Castelar.
RESUMEN: Para la obtención de vacunas recombinantes utilizando vectores virales vivos es necesario
la transcripción y expresión del gen foráneo, el cual se introduce a la célula en un plásmido de expresión,
mediante un procedimiento de transfección celular, por lo que resulta imprescindible la optimización
de los parámetros. Se ensayaron diferentes concentraciones de ADN, diferentes volúmenes de
lipofectamina y diferentes tiempos de expresión del gen LacZ como gen reportero en la línea celular
QT 35. También fueron evaluados otros vectores portadores de los genes reporteros LacZ y GFP bajo
el control de los promotores de CMV y temprano (E) de poxvirus. Como resultado se obtuvo un mayor
nivel de expresión del gen lacZ utilizando 1.5 ul lipofectamina, 0.4 ug de ADN a las 72 horas
postransfección, datos que serán necesarios en futuros ensayos de expresión transiente de genes en este
tipo de células.
(Palabras clave: Gen lacZ; transfección; liposomas; células QT35; genes reporteros)
EXPRESSION OF REPORTER GENES IN QT 35 LINE USING TRANSFECTION WITH
LIPOSOMES
ABSTRACT: In order to optimize the lipofection conditions in QT 35 cell line, different concentrations
of DNA, volumes of lipofectamine and optimal expression time of lacZ gene as reporter gene were
assayed. Other vectors with the reporter genes lacZ and GFP were evaluated under the control of CMV
and poxvirus early promoters. As a result, there was a higher expression level of lacZ using 1.5 ul
lipofectamine, 0.4 ug of DNA at 72 hr postransfection . These optimal values are important in future
assays of transient expression of genes in this type of cells.
(Key words: lacZ gene; transfection; liposomes; QT 35 cells; reporter genes)
INTRODUCCIÓN
La transfección de ADN es uno de los procedimientos experimentales cruciales en la biología
molecular y celular (7), ya que la introducción de ADN
exógeno, dentro de células eucariotas, constituye una
herramienta esencial para el estudio de la expresión
del gen, replicación del ADN, la recombinación y
transfección celular a niveles moleculares (22).
Estos análisis pueden realizarse, a través de una
expresión transiente del ADN transfectado o una expresión de largo término, en la cual el ADN se integra
al cromosoma de la célula hospedera (15).
Existen diversos métodos físicos y químicos para
la eficiente introducción del ADN con su propio espectro de ventajas y desventajas. Dentro de ellos, se destaca la transfección mediada por liposomas catiónicos
o lipofección, considerado mejor, que la transfección
por DEAE-dextrano, fosfato de calcio y la
electroporación, en términos de mayor eficiencia de
transfección y reproducibilidad (3,22), que no presenta
las desventajas de los otros métodos: citotoxicidad,
dificultades técnicas y equipamiento necesario.
La eficiencia de la transfección varía ampliamente
entre diferentes tipos de células (22) y no siempre los
investigadores seleccionan las líneas celulares por la
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facilidad de transfección, sino más bien por sus propiedades biológicas. De ahí que en nuestro trabajo
utilicemos una línea celular de origen aviar (QT 35),
procedente de células fibroblásticas de codorniz por
las ventajas que posee en la propagación de los
avipoxvirus en cultivos más estables y seguros que
en cultivos de fibroblastos de embrión de pollo, de
interferencias por transmisión vertical de otros virus o
la presencia de anticuerpos (9). Tampoco requiere
de la preparación de cultivos primarios que necesiten
una labor intensa de manipulación y se evita la preparación de cultivos desde poblaciones celulares
heterogéneas.
Otra forma de introducir el ADN con alta eficiencia
son los vectores virales y dentro de ellos, se encuentran los poxvirus como el virus de la viruela aviar y el
de la viruela de canarios, que incorporan el gen extraño directamente dentro de una región no esencial del
genoma viral (24, 2). Los virus recombinantes son viables y bajo la infección transcriben el gen foráneo, a
partir de un promotor viral. Esto resulta de gran aplicación en la biotecnología para la obtención de vacunas
vivas recombinantes basadas en un vector viral (5).
La manera más simple de optimizar los parámetros
para la transfección es con el uso de genes reporteros. Estos permiten una medida indirecta de la actividad promotora y son un estimado directamente proporcional de la actividad transcripcional del ADN
transfectado (15, 17). Estos genes codifican para proteínas, los cuales poseen una actividad enzimática y
que es fácilmente distinguible de la mezcla de proteínas celulares, la que es determinada cuantitativamente por la actividad in vitro del producto del gen
reportero o cualitativamente por tinción histoquímica
o luminiscente de las células intactas (16). Los más
utilizados son: el gen que codifica para la
Bgalactosidasa (Lac Z) que produce en las placas
recombinantes un color azul (12, 20), el gen que codifica para la cloranfenicol acetil transferasa (CAT) (4),
el gen que codifica para una proteína de fluorescencia (GFP), que una vez excitada a una longitud determinada, produce una fluorescencia verde en el citoplasma de las células (21) y el gen de la luciferasa de
luciérnaga (26, 25).
A partir de lo antes señalado este trabajo tiene
como objetivo la evaluación de la transfección, por
lipofectamina, a través del gen reportero lac Z y la
evaluación de los promotores de CMV y temprano(E)
de poxvirus mediante los genes reporteros lac Z y GFP,
en la línea QT 35.
MATERIALES Y MÉTODOS
Líneas celulares:
Línea QT 35, línea celular derivada de tumores
inducidos en células de codorniz japonesa (donado
por el CIGB, Cuba).
COS-1 (ATCC CRL 1650), Línea celular de riñón
de mono verde africano transformado conSV40 procedente del laboratorio de cultivo de tejido, CENSA.
Plásmidos con genes reporteros:
- CMV-GFP (proteína fluorescente bajo el control del
promotor temprano del CMV humano) donado al
laboratorio de Biología Molecular, CENSA.
- E-GFP (proteína fluorescente bajo el control del promotor temprano de un poxvirus) donado al laboratorio de Biología Molecular, CENSA.
- pCDNA3LacZ (gen LacZ bajo el control del promotor temprano del CMV humano) procedente del laboratorio de Biología Molecular, CENSA.
- pSC65 donado al laboratorio de Biología
Molecular,CENSA por el Dr. Michael Skinner, laboratorio Animal Health, Inglaterra.
Virus:
Cepa vacunal Gallina Modificada del virus de la
viruela aviar cedida por los Laboratorios Labiofam, SA,
(Cuba).
Purificación de los plásmidos y determinación de
la concentración de ADN:
Los plásmidos fueron transformados en células
competentes de E.coli DH5á según lo descrito por
Sambrook et al. (23).Las colonias obtenidas en las
placas de medio LB (Luria Bertani) con agar en presencia de ampicillin 100mg/mL (Sigma) a una concentración final de 100 ug/ mL, fueron sembradas en
100 mL de medio LB líquido suplementado con
ampicillin e incubados en agitación a 120 rpm durante toda la noche a 37°C. Para la obtención del ADN
plasmídico se utilizaron los reactivos del juego
PlasmidTM Midiprep Kit (Sigma). La concentración de
ADN fue medida a una longitud de onda de 260 nm,
calculada según la fórmula siguiente descrita por
Sambrook et al. (23).
C ( x) =
DO 260nm x cte (50) x dilución
1000
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Procedimiento de Lipofección:
Como control positivo de la transfección se utilizó
el plásmido pCDNA3LacZ en las células COS-1, siguiendo las condiciones que describe la casa productora (Invitrogen) para el juego de reactivos de
Lipofectamine, empleando 0.4ug de ADN plasmídico
y 3 uL de lipofectamina .
Se utilizaron placas de 4 pozos (Nunc, Denmark),
sembradas con la línea QT 35 a una concentración
de 1.25 x 105 cel/ placa en medio DMEM (Gibco, BRL),
con 10 % suero fetal Bovino SFB (Hyclone) y mantenidos en atmósfera húmeda con 5 % CO2 a 37°C,
hasta obtener una confluencia entre un 60-80 % en la
monocapa de células. La transfección se realizó utilizando el juego de reactivos de Lipofectamine TM
Reagent (Invitrogen) y para optimizar la mínima cantidad de reactivos a emplear que proporcionaran un
mayor número de células transfectadas, se evaluaron 3 volúmenes diferentes de lipofectamina: 1.5, 3 y
4.5 uL. La mezcla de ADN-lípidos fue adicionada suavemente a la monocapa de células e incubadas en
incubadora (Jouan, IG 150) en presencia de 5% CO2
a 37°C, durante 3 horas. A continuación de este tiempo se adicionó medio DMEM y con 2% Suero fetal
bovino y se dejó durante toda la noche. Posteriormente
se eliminó toda la mezcla y se adicionó nuevamente
medio suplementado con SFB al 2% y penicilinaestreptomicina a una concentración final de 100 UI/
mL y 100 ug/ mL, respectivamente e incubados hasta
las 72 horas postransfección.
Xgal (Sigma) descrito por Cepko (8). A las 72 horas
postransfección las placas transfectadas con el
plásmido portando el gen reportero lac Z fueron lavadas con PBS, fijadas con metanol durante 15 minutos
a -20°C e incubadas con la solución de tinción durante 1-24 horas a 37°C, para su observación al microscopio óptico invertido (West Germany). Las placas con
el plásmido portando el gen reportero GFP fueron
visualizadas en un microscopio Fluorescente (Opton).
Con los datos óptimos de concentración de lípidos
y ADN obtenidos se realizó la evaluación de la expresión del gen reportero a las 24, 48 y 72 horas
postransfección.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se demostró una alta eficiencia de transfección
en las células COS-1 con el plásmido pCDNA3lacZ
utilizado como control positivo, al observarse entre un
70- 80 % de células teñidas en toda la placa, caracterizadas por presentar una coloración azul intensa, lo
que demostró la calidad de los reactivos empleados y
la correcta manipulación del ensayo donde en las células no transfectadas no se observaron células teñidas (Fig. 1ab).
A
B
Con este resultado se procedió a evaluar 3 concentraciones diferentes de ADN plasmídico 0.2, 0.4 y
0.8 ug.
En el caso de los plásmidos que portaban los genes
reporteros bajo promotores de poxvirus, fue necesario antes de iniciar las transfecciones realizar una infección viral de las células con la cepa Gallina Modificada utilizando 200 uL de una dilución 1/100 durante
un período de 1 hora a 37°C en atmósfera de CO2 al
5% para permitir la adsorción del virus. Posteriormente, el inóculo se eliminó y la monocapa se continuó
incubando 2 hr en medio suplementado con SFB para
un período de recuperación de las células antes de
las transfecciones.
FIGURA 1. (A) Células COS transfectadas, (B) Células
COS no transfectadas./ (A)Transfected COS cells, (B) Non
transfected COS cells.
Visualización de los resultados de la transfección:
En los ensayos de optimización se obtuvo que de
las tres concentraciones de lipofectamina usadas la
de 1.5 ul permite obtener un mayor por ciento de células teñidas. En el caso de las concentraciones de
ADN transfectado, la de 0.4 ug resultó ser la óptima
en la línea QT 35, donde además se reflejó una mayor dependencia en la concentración de ADN. En
cuanto al tiempo de determinación de la expresión
postransfección resultó la de 72 horas el óptimo donde se obtuvo un mayor % de células teñidas que expresaban la Bgalactosidasa (Fig. 2).
La eficiencia de transfección se determinó mediante la coloración in situ de las placas con el reactivo
En la evaluación del gen reportero (GFP), se observó al microscopio fluorescente la emisión de una
En la evaluación de los promotores de CMV y E
que regulan los genes reporteros lacZ y GFP se siguieron las condiciones óptimas obtenidas anteriormente.
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A
B
C
FIGURA 2. Expresión del gen lac Z en el ensayo de estandarización. (A) células sin transfectar, (B-C) células transfectadas
con pCDNA3LacZ (125x/312x)./ Expression of LacZ gene in a standarization assay. (A) Non transfected cells, (B-C) Cells
transfected with pCDNA3LacZ.
luz verde en el citoplasma de las células que introdujeron el plásmido portador del gen, en las células que
no fueron transfectadas no se observó emisión de luz
(Fig. 3).
A1
A2
B
FIGURA 3. Expresión del GFP-bajo el promotor de CMV./
Expression of GFP under CMV promoter.
En el experimento donde se utilizaron plásmidos
portando genes bajo la acción de promotores de
poxvirus se obtuvo la expresión del mismo en las placas que previamente fueron infectadas con el inóculo
viral (Figs. 4B y 5).
En la Fig. 4A se muestra el efecto citopático caracterizado por focos necróticos, redondeamiento
celular y se observó diferencias entre las placas infectadas y transfectadas y las que solo fueron infectadas (datos no mostrados).
La habilidad de propagar virus aviares en una línea celular continua hace más fácil su evaluación
por las ventajas que posee, unido a un costo efectivo
menor para aquellos laboratorios con un acceso limitado a embriones y pollos libres de patógenos específicos, lo que demuestra la importancia de su empleo en la evaluación de sistemas de transfecciones
celulares para virus aviares.
FIGURA 4. Efecto citopático en la línea QT 35./ A1: células QT 35 no infectadas, A2: células infectadas, B: Expresión del gen lacZ bajo el promotor de poxvirus./ Cytopatic
effect of fowlpox virus on QT35 cells. A1: non infected QT35
cells, A2: Cells infected with GM viral strain, B: Expression
of LacZ gene under poxvirus promoter.
Para obtener una transfección eficiente es necesario contar con un ADN de alto por ciento de pureza,
que en nuestro caso fue logrado al utilizar juegos comerciales de purificación basados, en el uso de resinas que, aunque resultan costosas, son fáciles y rápidos de manipular y no tan laboriosos como los protocolos que emplean gradientes de cloruro de Cesio
(18) o precipitación con polietilenglicol (19).
El plásmido pCDNA3lacZ ha sido utilizado para
optimizar los parámetros, que influyen en la
transfección de fibroblastos de embrión de pollo, meRev. Salud Anim. Vol. 27 No. 3 (2005)
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FIGURA 5. Expresión de GFP-bajo el PE de poxvirus./
Expression of GFP under E promoter.
diante la formación de un precipitado ADN-fosfato de
calcio (14) y en la evaluación del promotor de CMV
(12). La línea Cos-1 también ha sido utilizada por Yu
et al. (28) para evaluar mediante el método con DEAE
dextrano la transfección transiente de genes que tienen un papel regulador en la señal de
inmunoreceptores. También Eblen et al. (10) emplean
esta línea celular y mediante el método de lipofección
con el gen reportero de la luciferasa realizan una
transfección transiente para caracterizar mutaciones
en la región N-terminal de una kinasa (ERK2), importante en la señal de traducción.
El empleo del gen lac Z como control interno para
comprobar la transfección constituye un ensayo de
alta sensibilidad en células de mamíferos, ya que puede detectar alrededor de 109 moléculas (16), mediante un ensayo colorimétrico por espectrofotometría.
Otros autores (6) reportan el límite de detección para
el ensayo de la Bgal por quimioluminiscencia entre 16 x 103 moléculas y con un costo 0.05-0.20 $ USD.
Además, estos ensayos presentan muy bajo costo (11,
14), por lo que representa un buen método de elección para comprobar las transfecciones celulares.
El gen LacZ como gen reportero ha servido para
ensayar la importancia de determinados promotores
en el conocimiento de su fortaleza, en la determinación de la especificidad de tejido y la producción de
proteínas.
A pesar de que se trabajó en la búsqueda de mejores condiciones que propiciaran un mayor número
de células transfectadas, los resultados reflejaron que
la línea QT 35 fue de baja eficiencia de transfección
en nuestro estudio, al obtenerse un bajo número de
células que expresaban el gen reportero comparado
con los resultados obtenidos en las células COS-1,
empleando este mismo plásmido, lo que concuerda
con lo planteado por Whitt et al. (27) sobre la influencia del tipo de células que propicia que pueda ser
introducido un mayor o menor número de ADN a las
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células. Altmann et al. (1) encontraron que la línea de
células Zebrafish presentó baja eficiencia de
transfección en el rango de 1-5%, en comparación
con líneas celulares de mamíferos. La disminución
en la actividad Bgalactosidasa evidencia una disminución en el número de células transfectadas por toxicidad a las altas concentraciones de lipofectamina y
ADN, aunque otros ensayos donde emplean diferentes métodos como el DEAE dextrano utilizan mayores concentraciones de plásmido (13) que en nuestro
estudio, estos resultados permiten que se puedan
realizar más ensayos con poca concentración de ADN.
Muchos autores de manera general han planteado que
aumentando las concentraciones de lípidos se mejora la transfección que en nuestro caso resultó ser el
menor volumen de liposoma utilizado, lo que proporciona un ahorro que permite realizar un mayor número de transfecciones por juego de reactivo.
Los resultados obtenidos con el gen reportero GFP
son de gran importancia al seleccionar el método de
transfección, y puede ser usado en la optimización de
las condiciones de transfección, pero se necesita de
un microscopio de fluorescencia y de la habilidad en
la observación, ya que pueden existir artefactos de la
técnica que falseen los resultados.
La expresión obtenida en los genes reporteros
bajo promotores de poxvirus es indicativo no sólo en
la funcionabilidad de dichos genes, sino también en
el promotor. La misma está dada porque secuencias
presentes en el promotor fueron reconocidas por la
ARN polimerasa del virus de la viruela aviar, vector
viral vivo en el cual se expresaron todos los elementos que integraban el cassette de expresión insertados con los distintos plásmidos ensayados.
A partir de este trabajo se tiene un método de
monitoreo de las transfecciones con el uso de genes
reporteros, lo que permite controlar la calidad de las
mismas, tecnología de gran importancia para el estudio de la función de los genes virales a través de la
generación de mutantes virales. Además, este es un
paso necesario en la obtención de virus recombinantes
que incorporan en su genoma genes foráneos para el
desarrollo de vacunas que emplean vectores vivos,
así como para los ensayos de promotores y construcciones genéticas relacionadas con los virus aviares.
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