Download rol de la proteína del virus herpes simplex tipo

Profesor Patrocinante
Dra. Carola Otth L.
Instituto de Microbiología Clínica
Facultad de Medicina
Profesor Co-Patrocinante
Dr. Gonzalo Mardones C.
Instituto de Fisiología
Facultad de Medicina
ROL DE LA PROTEÍNA DEL VIRUS HERPES SIMPLEX TIPO-1
VP11/12 EN LA ALTERACIÓN DEL APARATO DE GOLGI
NEURONAL.
Tesis de Grado presentada como parte de
los requisitos para optar al grado de
Licenciado en Bioquímica y Título
Profesional de Bioquímico
YENNYFER VALERIA ARANCIBIA MUÑOZ
VALDIVIA – CHILE
2014
AGRADECIMIENTOS
Quisiera agradecer en primer lugar a la Dra. Carola, por haberme aceptado como tesista en su
laboratorio y haber sido una fuente constante de energía y experiencia.
También quisiera agradecerle a todo el Team Herpes (aún sin logo), por su compañía, apoyo y
entusiasmo durante los momentos difíciles y los alegres.
A la Karo y la Meli, por haber sido un soporte y trampolín en los momentos de flaqueza, por
hacer del laboratorio una segunda familia y por –apañar- en todas.
A la Pía, Jorge y Lucho, por siempre estar ahí y ayudarme en todo cuanto les pedí, fueron un
descanso importante en este camino.
Finalmente agradecer infinitamente a mi familia, especialmente mis padres y mi hermano,
quienes siempre estuvieron apoyando aún cuando no sabían en qué ni para qué. No habría sido
capaz de llegar a este punto de no haber sido por Ustedes.
El presente trabajo se llevó a cabo en el Laboratorio de Virología Molecular del Instituto de
Microbiología Clínica, Facultad de Medicina, de la Universidad Austral de Chile, y contó con el
financiamiento de los proyectos FONDECYT 1120464 y CONICYT 24121539.
i
ÍNDICE GENERAL
1.
RESUMEN
1.1 SUMMARY
2.
INTRODUCCIÓN
1
2
3
2.1. VIRUS HERPES SIMPLEX TIPO 1
3
2.2. PROTEÍNA VIRAL 11/12
6
2.3. VHS-1 Y SISTEMA NERVIOSO CENTRAL
8
2.4. VHS-1 Y EVENTOS NEURODEGENERATIVOS
8
2.5. APARATO DE GOLGI
10
2.6. VHS-1 Y APARATO DE GOLGI
12
2.7. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
14
2.8. HIPÓTESIS
15
2.9. OBJETIVO GENERAL
15
2.9.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
3.
PÁGINA
MATERIALES Y MÉTODOS
15
16
3.1.REACTIVOS Y SISTEMAS COMERCIALES
16
3.2. MATERIAL BIOLÓGICO
16
3.2.1. VIRUS HERPES SIMPLEX TIPO 1
16
3.2.2. PLÁSMIDO PUL46
16
3.2.3. PLÁSMIDO PGUL46
17
3.2.4. LÍNEAS CELULARES
19
3.3. METODOLOGÍA
20
ii
3.3.1 PROPAGACIÓN DE HERPES SIMPLEX VIRUS TIPO 1 20
3.3.2 TITULACIÓN VIRAL
20
3.3.3 CULTIVO PRIMARIO DE NEURONAS CORTICALES
22
3.3.4 TRANSFORMACIÓN
23
3.3.5 EXTRACCIÓN DE ADN PLASMIDIAL
24
3.3.6 DIGESTIÓN CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
25
3.3.7 PCR CONVENCIONAL
26
3.3.8 CINÉTICA DE INFECCIÓN
30
3.3.9 SINCRONIZACIÓN CELULAR
30
3.3.10 TRANSFECCIÓN
31
3.3.11 INMUNO FLUORESCENCIA INDIRECTA
31
3.3.11.1 FIJACIÓN EN PARA-FORMALDEHÍDO
BLOQUEO CON GELATINA
31
3.3.11.2 FIJACIÓN EN PARA-FORMALDEHÍDO
BLOQUEO CON SOLUCIÓN DE SUERO
DE CABALLO
32
3.3.12 REGISTRO DE IMÁGENES Y CARACTERIZACIÓN
FENOTÍPICA
3.3.13 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
4.
RESULTADOS
33
34
35
4.1. PROTEÍNA VIRAL VP11/12-GFP
35
4.2. DISTRIBUCIÓN SUBCELULAR DE VP11/12-GFP
39
4.3. LOCALIZACIÓN Y DISTRIBUCIÓN DE GIANTIN
iii
AL EXPRESAR VP11/12-GFP
42
4.4 LOCALIZACIÓN Y DISTRIBUCIÓN DE GIANTIN Y
GM130 DURANTE INFECCIÓN NEURONAL CON
VHS-1
49
5.
DISCUSIÓN
53
6.
CONCLUSIÓN
65
7.
BIBLIOGRAFÍA
66
8.
ANEXOS
71
iv
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1. Estructura y genoma del virus del herpes simplex tipo 1 (VHS-1).
4
Figura 2. Esquema del establecimiento de la latencia en neuronas y fenómenos
9
de reactivación por el VHS-1.
Figura 3. Plásmido pGUL46 que codifica la proteína VP11/12 del VHS-1 fusionada
a GFP.
36
Figura 4. Análisis de restricción para los plásmidos pUL46 y pGUL46
37
Figura 5. Distribución subcelular de la proteína viral VP11/12 en células neuronales
y neuronas corticales.
40
Figura 6. Eficiencia de transfección de VP11/12-GFP en células neuronales.
41
Figura 7. Expresión de la proteína viral VP11/12-GFP causa alteración de la
distribución de Giantin en células N2A.
43
Figura 8. Expresión de la proteína viral VP11/12-GFP causa una leve alteración
de la distribución de Giantin en células H4.
44
Figura 9. Expresión de la proteína viral VP11/12-GFP causa alteración de la
distribución de Giantin en células HT22.
45
Figura 10. Expresión de la proteína viral VP11/12-GFP causa una leve alteración
de la distribución de Giantin en neuronas corticales.
46
Figura 11. Expresión de la proteína viral VP11/12-GFP causa alteración
fenotípica de Giantin en distintas líneas neuronales.
Figura 12. Expresión de la proteína viral VP11/12-GFP causa una redistribución
47
v
de Giantin y una disminución de la viabilidad celular.
48
Figura 13. Infección neuronal por VHS-1 causa alteración de la distribución de la
proteína del Golgi Giantin.
50
Figura 14. Infección neuronal por VHS-1 causa alteración de la distribución de la
proteína del Golgi GM130.
51
Figure 15. Caracterización de infección neuronal con VHS-1.
52
Figura 16. Placa de agar-LB con ampicilina (100 mg/mL) que contiene colonias
de E. coli transformadas con el plásmido pGUL46.
71
Figura 17. Transfección transiente de células N2A con el plásmido pGUL46 utilizando
Lipofectamina 2000 y Fugene HD.
73
Figura 18. Controles de transfección transiente de células HT22.
75
Figura 19. Controles de transfección transiente de células HT22 (continuación).
76
Figura 20. Distribución de Giantin en controles de transfección transiente en células
HT22.
77
vi
ÍNDICE DE TABLAS
Página
Tabla I.
Clasificación alfabética de acuerdo al nombre del fabricante de los reactivos
utilizados en este trabajo.
18
Tabla II.
Reacciones de digestión enzimática.
25
Tabla III.
Partidores utilizados en la reacción de PCR convencional.
27
Tabla IV.
Componentes para la reacción de PCR convencional de un fragmento interno
de VP11/12
28
Tabla V.
Programa utilizado para PCR convencional de un fragmento interno de VP11/12.
29
vii
LISTA DE ABREVIATURAS
AG:
Aparato de Golgi
DMEN:
Medio Eagle modificado por Dulbecco
GFP:
Green Fluorescent Protein (Proteína Verde Fluorescente)
HPI:
Horas Post-Infección
HSE:
Encefalitis por Herpes Simplex
IFD:
Inmunofluorescencia Directa
IFI:
Inmunofluorescencia Indirecta
ORF:
Open Reading Frame (Marco de Lectura Abierto)
pADN:
ADN plasmidial
PCR:
Reacción en Cadena de la Polimerasa
PFA:
Paraformaldehído
PBS:
Tampón Fosfato Salino
SFB:
Suero Fetal Bovino
SMC:
Sitio Múltiple Clonamiento
SNC:
Sistema Nervioso Central
VHS-1:
Virus Herpes Simplex Tipo 1
1
RESUMEN
El virus herpes simplex tipo 1 (VHS-1) pertenece a la familia Herpesviridae, del género
Simplexvirus, siendo ubiquitario, neurotrópico y el patógeno más común de encefalitis aguda
esporádica en humanos. Las proteínas del tegumento se encuentran entre la cápside y la envoltura
de los herpesvirus y son liberadas en el citoplasma durante la infección viral para manipular
funciones de la célula hospedera. VP11/12 es una de las proteínas más abundantes del tegumento
del VHS-1, pero su función durante la infección no está bien establecida. Recientemente, se ha
mostrado que VHS-1 tiene un efecto sobre la dinámica del aparato de Golgi, pero se desconoce si
proteínas del tegumento están involucradas. Considerando que VP11/12 ha sido encontrada
asociada a la red trans-Golgi (TGN), nosotros planteamos que esta proteína juega un rol en la
alteración de la distribución del aparato Golgi. El objetivo de este estudio fue evaluar cambios de
distribución de una proteína de la matriz del Golgi durante una infección por VHS-1 y por
expresión de VP11/12 en líneas neuronales y neuronas corticales mediante inmunofluorescencia
indirecta. Encontramos que la infección con VHS-1 induce la redistribución de proteínas del
aparato de Golgi. Estos cambios fueron también inducidos por expresión de VP11/12. Nuestros
resultados sugieren que durante una infección por VHS-1 se producen cambios en la distribución
normal de proteínas del aparato de Golgi donde podría estar involucrada VP11/12, lo que puede
tener consecuencias para la supervivencia y funcionalidad de la neurona.
Financiamiento: FONDECYT 1120464 y CONICYT 24121539.
2
SUMMARY
Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) belong to the family Herpesviridae, the genus
Simplexvirus; it is ubiquitous, neurotropic and the most common pathogenic cause of sporadic
acute encephalitis in humans. Tegument proteins are layered between the capsid and the envelope
of herpesviruses, and they are delivered into the cytoplasm during viral infection to manipulate
host cell functions. VP11/12 is one of the most abundant tegument proteins of HSV-1, but its
function during infection is not well established. Recently, it has been shown that HSV-1 has an
effect on the dynamics of the Golgi apparatus, but it is unknown whether tegument proteins are
involved. Considering that VP11/12 has been found associated to the trans-Golgi network
(TGN), we hypothesized that this protein plays a role in the alteration of distribution of the Golgi
apparatus. The aim of this study was to evaluate through indirect immunofluorescence changes in
the distribution of Golgi apparatus proteins during either infection or expression of VP11/12 in
neuronal cell lines and neurons in primary culture. We found that infection with HSV-1 induces
redistribution of Golgi proteins. These changes were also induced by expression of VP11/12. Our
results suggest that during HSV-1 infection there are changes in the distribution of the Golgi
proteins where VP11/12 could be involved, which may have consequences for neuronal survival
and functionality.
Funding: FONDECYT 1120464 and CONICYT 24121539.
3
2. INTRODUCCIÓN
2.1 VIRUS DEL HERPES SIMPLEX TIPO 1
El Virus del Herpes Simplex tipo 1 (VHS-1) es un virus ubicuo y neurotrópico, que afecta entre
85-90% de la población adulta a nivel mundial. Sin embargo, sólo un 20-40% de las personas
infectadas desarrolla sintomatología clínica evidente (Schillinger et al., 2004; Diefenbach et al,
2008). Pertenece a la familia de los Herpesviridae, subfamilia Alfaherpesvirinae, y al género
Simplexvirus (Mori et al., 2006). Los viriones constan de 4 regiones estructurales bien definidas
(que se presentan en la figura 1a): una región central o core, que contiene el genoma viral (ADN
de doble hebra), una cápside icosahédrica constituida por 162 capsómeros, una región
proteinácea denominada tegumento que rodea la nucleocápside, y una envoltura lipídica en cuya
superficie se encuentran glicoproteínas virales (Mettenleiter et al., 2004). El genoma viral consta
de 152 kb que codifican para al menos 74 genes distintos. Este genoma consta de dos regiones
únicas codificantes, una región única larga (UL) y una región única corta (US), que se encuentran
flanqueadas por regiones repetidas invertidas (Whitley et al., 2001). Un esquema de la
organización génica de VHS-1 se puede observar en la figura 1b. Los genes codificantes
presentes en el genoma de VHS-1 son clasificados en tres grupos de acuerdo a su cinética de
expresión durante una infección productiva: inmediatamente tempranos (IE), tempranos (E) y
tardíos (L).
4
A)
B)
Figura 1. Estructura y genoma del VHS-1). A) Esquema de una partícula viral de VHS-1
donde se señalan sus partes. A su lado, se encuentra una imagen obtenida por microscopía de
fuerza atómica (Liashkovich et al., 2010). B) Esquema del genoma viral. TRL: long terminal
repeat (repetición terminal larga), IRL: long internal repeat (repetición interna larga), UL: unique
long (única larga), IRS: short internal repeat (repetición interna corta), TRS: short terminal repeat
(repetición terminal corta), US: unique short (única corta) (Nishiyama Y., Nagoya J. Med. Sci.
59.107-119, 1996).
5
La primo-infección o primera infección ocurre con frecuencia en la niñez o adolescencia, y es
usualmente leve o asintomática en un hospedero inmuno-competente (Zahariadis et al., 2008). En
esta primo-infección ocurre una infección productiva en células epiteliales de regiones de la
mucosa respiratoria/orofaríngea o genital, que luego se transmite a neuronas sensoriales
periféricas, donde finalmente ocurre una infección persistente latente, que se establece durante
todo el tiempo de vida del huésped (Kelly et al., 2009). Este estado de latencia se define por la
presencia y mantención del genoma viral en forma circular (episoma) silenciado y con ausencia
de producción de viriones (Lachmann et al., 1999). En esta etapa la expresión viral se limita a la
expresión de un solo gen, con la capacidad de codificar abundantes moléculas de ARN conocidas
como transcritos asociados a latencia (LATs), encargadas de silenciar el genoma del virus
durante una infección latente.
El ingreso de la partícula viral a la célula ocurre a través de la unión de glicoproteínas virales de
superficie como gC, gD, gB, gH/gL con receptores o dominios de proteínas de la célula huésped
como los proteoglicanos heparán sulfato presentes en la membrana plasmática. Una vez que el
virus ingresa a la célula, el contenido del tegumento y la nucleocápside son liberados al
citoplasma celular. Luego el genoma del virus junto a factores de transcripción viral son liberados
al núcleo celular, donde se inicia la expresión secuencial de los genes virales que darán origen a
la partícula viral. El transporte y egreso de esta partícula viral envuelta requiere de ciertas
estructuras celulares como el retículo endoplásmico (RE) y el aparato de Golgi (AG), del cual
proviene la envoltura viral (Diefenbach et al., 2008).
6
2.2 PROTEÍNA VIRAL 11/12
La proteína viral 11/12 (VP11/12) de VHS-1, es una proteína regulatoria presente en el
tegumento viral que se sugiere funciona como proteína tirosina quinasa. Es una de las más
abundantes dentro del virión con 1000-2000 copias (Kelly et al., 2009). Está codificada por el
fragmento único largo del genoma viral, específicamente por el marco de lectura abierto 46, por
lo que también se le suele denominar UL46 (Zhang & McKnight, 1993) y tiene un peso
molecular aproximado de 90 kDa (Zahariadis et al., 2008). Es capaz de incrementar la eficiencia
de la expresión de los genes alfa (de expresión inmediatamente temprana) mediado por la
proteína viral 16 (VP16) (Kato et al., 2000). Se produce en la fase tardía de la infección en alta
dependencia de la síntesis de ADN (Kato et al., 2000). Una vez dentro de la célula infectada se
localiza cercana al núcleo en el citoplasma (región perinuclear), lugar donde se sugiere ocurre el
ensamblaje del virión (Kato et al., 2000). A través de análisis de flotación de membranas en
células transfectadas para VP11/12 (con pUL46 o plásmido de UL46), se descubrió que VP11/12
se asocia con membranas en forma independiente de la presencia de otras proteínas virales
(Murphy et al., 2008).
Estudios en linfocitos han mostrado que VP11/12 activa a la quinasa específica de linfocitos Lck,
perteneciente a la familia de las quinasas Src, y que a su vez, es fosforilada en tirosina de manera
dependiente de la misma durante una infección de células T; e independiente de la señalización
por el receptor de células T (TCR) (Wagner et al., 2009). La activación de Lck ha mostrado ser
dependiente de VP11/12 (Wagner et al., 2009). Se ha descubierto que en fibroblastos primarios y
células T Jurkat infectados con VHS se requiere de VP11/12 para la activación de la vía de
señalización PI3K-Akt inducida por el virus (Wagner et al., 2011). Tanto la fosforilación de
7
VP11/12, así como la interacción con PI3K y la activación de Akt, en fibroblastos infectados
requiere la actividad de la familia quinasa Src (SFK).
Estudios recientes sugieren que además podría tener un rol en eventos de tráfico de membrana
puesto que se ha observado co-localización con la proteína Rab27a, una GTPasa pequeña de
oligodendrocitos en la red trans-Golgi (Bello-Morales et al., 2012).
8
2.3 VHS-1 Y SISTEMA NERVIOSO CENTRAL
Una vez ocurrida la infección en el epitelio de la mucosa oral, la progenie viral generada accede
al sistema nervioso central (SNC) mediante infección de los terminales axónicos de neuronas
sensoriales del ganglio trigémino que inervan el sitio inicial de la infección, liberando la cápside
que contiene el material genético viral en el citoplasma de la neurona. Una vez allí la cápside es
transportada por microtúbulos celulares hasta el cuerpo celular ubicado en el ganglio, allí ingresa
el genoma viral al núcleo donde es transcrito por la maquinaria celular, resultando en una
replicación viral de carácter productiva, con posterior establecimiento de la latencia, eventos que
pueden observarse en la figura 2a (Wilson et al, 2012).
2.4 VHS-1 Y EVENTOS NEURODEGENERATIVOS
El VHS-1 presenta tropismo por células epiteliales y por neuronas, infectando y estableciendo
latencia en neuronas del área frontal, temporal e hipocampo. Una vez alcanzado el SNC es capaz
de producir encefalitis (HSE, encefalitis por herpes simplex) en algunos individuos vulnerables.
La presencia de VHS-1 a nivel de SNC aumenta con la edad del paciente, producto del deterioro
del sistema inmune asociado con el envejecimiento. Esto conlleva un mayor riesgo de
reactivación y posibilidad de secuelas cognitivas.
9
Figura 2. Esquema del establecimiento de la latencia en neuronas y fenómenos de
reactivación por el VHS-1. A) Infección natural por VHS-1. El virus entra al sistema nervioso
vía terminales axónicos de neuronas periféricas que inervan el sitio de primo-infección (mucosa o
epitelio). La partícula viral alcanza el cuerpo axonal a través de transporte retrógrado, el genoma
viral ingresa al núcleo y se mantiene silenciado en estado episomal (latencia). B) Diversos
estímulos son capaces de reactivar la producción de progenie viral a través del acumulo de
proteínas virales y celulares implicadas en transcripción, como VP16 y HCF-1. Una vez ocurrida
la síntesis de proteínas virales, los viriones son transportados de manera anterógrada a los
terminales axonales de neuronas sensoriales que inervan la mucosa, dando inicio así a un nuevo
ciclo de infección productiva (Wilson et al., 2012).
10
Estudios realizados por nuestro laboratorio han demostrado que durante infección neuronal por
VHS-1 se observa una clara reducción en la viabilidad neuronal sumado a importantes
modificaciones en la dinámica microtubular y la hiperfosforilación de tau, proteína neuronal
asociada a microtúbulos, y cuya hiperfosforilación anormal se relaciona con enfermedades
neurodegenerativas (Zambrano et al., 2008). Estudios posteriores en cultivos primarios
neuronales y de astrocitos han demostrado que en un proceso infeccioso por VHS-1 existen
además otros eventos neurodegenerativos como el procesamiento de tau en D421, evento que se
correlaciona con la activación de caspasa-3 (Lerchundi et al., 2010). Estos resultados sugieren
que la infección por VHS-1 podría conducir a la disrupción del citoesqueleto neuronal y a la
generación de procesos neurodegenerativos tempranos, y de paso reforzar la hipótesis de que
episodios reiterativos de reactivación podrían conducir a disfunciones neuronales y
neurodegenerativos in vivo (Lerchundi et al., 2010; Martin et al., 2013).
2.5 APARATO DE GOLGI
El aparato de Golgi (AG) es un organelo citoplasmático que participa en el transporte,
procesamiento y dirección de las proteínas sintetizadas en el retículo endoplásmico rugoso y con
destino a la vía secretoria. Se compone de una serie de cisternas aplanadas, paralelas e
interconectadas organizadas en torno al centro organizador de microtúbulos en la región
perinuclear. Presenta conexiones tubulares que permiten el paso de sustancias entre las cisternas
(Nakamura et al., 2012). Puede ser esquemáticamente dividido en tres grandes compartimentos:
cis, medial y trans Golgi. La integridad funcional y estructural del AG es mantenida por al menos
3 sistemas de proteínas: microtúbulos y proteínas asociadas, citoesqueleto de actina y proteínas
11
de la matriz del AG (Gonatas et al., 2006). La ubicación característica de este organelo es
dinámica y cambia drásticamente durante varios procesos celulares. Procesos fisiológicos, como
mitosis celular y polarización, o patológicos, como apoptosis, regulan la estructura y ubicación de
este organelo. La fragmentación y pérdida de posición del AG se produce durante la mitosis y
apoptosis. Durante la mitosis los microtúbulos se reordenan para formar el huso mitótico y los
fragmentos de membranas del AG se dispersan a través de las células en división (Yadav &
Linstedt, 2011). Este proceso se caracteriza por la fosforilación de proteínas asociadas a la matriz
del AG, como GM130 y GRASP65 (Short et al., 2005). La apoptosis se caracteriza por el clivaje
proteolítico de éstas y otras proteínas de la matriz. Se sugiere que los fragmentos clivados (como
golgina-160 y p115) participarían en la activación de la expresión de genes pro-apoptóticos
(Colanzi & Sütterlin, 2013). Estudios revelan que el proceso de fragmentación y dispersión del
AG es un evento temprano en la muerte celular neuronal, y que es iniciado previo a la
degeneración de tubulina, lo que ocurre en los estadios medios de la apoptosis. Este evento de
fragmentación y dispersión se sabe que también ocurre en el sistema nervioso central durante
varias enfermedades neurodegenerativas como ALS, AD, degeneración corticobasal y la
enfermedad de Creutzfeldt–Jakob (Nakamura et al., 2012). Finalmente, durante la polarización
celular se activan GTPasas como Cdc42, que establece el complejo de polaridad Par6-Par3-PKC,
el que recluta y ancla dineína hacia el sitio del estímulo, induciendo la reorientación del
centrosoma. Este evento induce la alineación del AG (Yadav & Linstedt, 2011).
12
2.6 VHS-1 Y APARATO DE GOLGI
Existen varios nexos entre VHS-1 y aparato de Golgi. El primero de ellos lo constituye la
adquisición de la envoltura lipídica durante el proceso de egreso de la partícula viral, mientras
que el segundo hace referencia a la maduración de las glicoproteínas virales. Sobre esto último
existen estudios que datan de 1983, en los que se descubrió que la extensión de las cadenas
unidas a O de las glicoproteínas de VHS-1, y que probablemente, el acoplamiento del primer
azúcar unido a O, ocurre como una modificación post-traduccional en el aparato de Golgi
(Johnson et al., 1983). Por otra parte, se ha sugerido que la envoltura viral parece derivar de
vesículas de la red trans-Golgi (TGN) y que, en consecuencia, el proceso de envoltura final
ocurriría en este compartimento celular (Mettenleiter et al., 2006). Hay estudios que sugieren que
la infección por VHS-1 causa una redistribución de las membranas de TGN para formar múltiples
compartimentos citoplasmáticos, posiblemente para una óptima segunda envoltura de la partícula
viral (Sugimoto et al., 2008). Se ha observado que en células VERO y HEp-2 durante un proceso
infeccioso por VHS-1, proteínas asociadas con el aparato de Golgi parecen estar unidas con
numerosas y pequeñas estructuras dispersas a lo largo del citoplasma (Campadelli et al., 1993).
La fragmentación y dispersión del aparato de Golgi mostró ser un evento tardío en el ciclo
reproductivo del virus, coincidiendo con el ensamblaje, el procesamiento proteico y egreso de la
partícula viral. El patrón de fragmentación observado es morfológicamente distinto al observado
en tratamientos con Brefeldina A (Campadelli et al., 1993). Durante estudios sobre la exocitosis
viral, el rol de los microtúbulos y el aparato de Golgi, se descubrió que la redistribución de los
microtúbulos puede ser requerida, pero no es necesaria para la fragmentación y dispersión del AG
(Avitabile et al., 1995). A través de estudios con Nocodazol y Taxol se reveló que la exocitosis
13
viral es independiente de la integridad del AG y de la distribución de los microtúbulos (Avitabile
et al., 1995). Durante el proceso de exocitosis y a través de ensayos de inmunofluorescencia, se
determinó que la red trans-Golgi es el principal sitio de re-envoltura de la partícula viral una vez
que ha salido del núcleo. Tanto las cápsides como las glicoproteínas virales han sido encontradas
adyacentes a este compartimento (Loret et al., 2008). Ensayos en conos de crecimiento neuronal
para analizar el transporte anterógrado de la partícula viral, han determinado que tanto el
tegumento como la envoltura proteica pueden viajar en axones de forma independiente de la
cápside viral a través de dos tipos de transporte vesicular, estructuras membranosas túbulo
vesicular y grandes vesículas con núcleo denso. Se descubrió que ambos sistemas de transporte
derivaban de la red trans-Golgi y que contienen proteínas claves como Rab3A, SNAO-25, GAP43 y quinesina-1 (Miranda-Saksena et al., 2009).
14
2.7 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Considerando que la ubicación y estructura del AG está determinada por factores fisiológicos y
externos, junto a la evidencia que durante infección productiva en epitelios, VHS-1 es capaz de
alterar este organelo, resulta importante esclarecer la participación de proteínas virales, ya sea de
manera individual o durante infección, en alterar la distribución de este organelo. Estudios
recientes han demostrado que la fragmentación del AG estaría gatillado, entre otras cosas, por la
actividad de la GTPasa dinamina II, una mecanoenzima encargada de la fisión de vesículas que
contienen proteínas cargo derivadas del aparato de Golgi que contienen proteínas cargo. La
activación de esta enzima depende de la quinasa Src (de la familia de quinasas Src, SFK), que en
su forma activa es capaz de fosforilar y activar a dinamina II (Weller et al., 2010). En el contexto
de una infección viral, se ha descubierto que durante infección en linfocitos, VHS-1 es capaz de
activar a Lck, una quinasa miembro de la familia SFK, donde esta activación es dependiente de
VP11/12 (Wagner et al., 2009).
La información recién expuesta plantea la problemática de dilucidar el mecanismo por el cual
VHS-1 gatilla la fragmentación y redistribución de proteínas del aparato de Golgi neuronal,
donde posiblemente podría estar involucrada la proteína del tegumento viral VP11/12, que se ha
encontrado recientemente localizada en la red trans-Golgi (Bello-Morales et al. 2012).
15
2.8. HIPÓTESIS
Durante el proceso de infección productiva por VHS-1 se induce la redistribución de proteínas
de la matriz del aparato de Golgi neuronal., posiblemente por acción de la proteína del tegumento
VP11/12
2.9 OBJETIVO GENERAL
Caracterizar el rol de la proteína de tegumento VP11/12 sobre la distribución normal de proteínas
de la matriz del aparato de Golgi neuronal.
2.9.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1.- Analizar el vector de expresión pGUL46, que expresa VP11/12 fusionada a GFP, mediante
detección por PCR de una región específica del gen viral.
2.- Determinar la distribución subcelular de la proteína viral VP11/12 en células transfectadas
con el vector pGUL46 que expresa VP11/12 fusionada con GFP.
3.- Analizar la localización y distribución de la proteína de la matriz del aparato de Golgi
(Giantin) en líneas neuronales y neuronas corticales transfectadas con el vector pGUL46.
4.- Analizar la localización y distribución de las proteínas de la matriz del aparato de Golgi
(Giantin y GM130) durante una infección productiva con VHS-1.
16
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. REACTIVOS Y SISTEMAS COMERCIALES
Los reactivos utilizados a lo largo de este trabajo se detallan en la Tabla I.
3.2. MATERIAL BIOLÓGICO
3.2.1. VIRUS HERPES SIMPLEX TIPO 1
Se utilizó la cepa F del virus herpes simplex tipo 1, la cual fue donada por la Dra. María José
Martínez del Programa de Virología, Universidad de Chile. Esta cepa es utilizada como cepa de
referencia en estudios a nivel mundial debido a su reconocida neurovirulencia.
3.2.2 PLÁSMIDO pUL46
El plásmido pUL46 que codifica para la proteína viral VP11/12 fue gentilmente cedido por el Dr.
James Smiley (Zaharadis et al., 2008). Se construyó insertando el producto de PCR que contiene
el marco de lectura abierta del gen que codifica para esta proteína (cepa KOS), 10 nucleótidos río
arriba del codón de inicio de UL46 hasta 30 nucleótidos río abajo entre los sitios de restricción de
EcoRI
y
XhoI
de
pcDNA3.1
(InvitrogenTM),
usando
el
par
ttgaattcGGGCGTCACCATGCAG-tttctcgagGTCTAGCGACGGCAGCAC.
de
partidores
17
3.2.3 PLÁSMIDO pGUL46
El plásmido pGUL46 que codifica para la proteína viral VP11/12 acoplada a la proteína verde
fluorescente (GFP) fue gentilmente cedido por el Dr. James Smiley (Wagner et al., 2011). Este
vector fue construido por inserción de una etiqueta de GFP en el plásmido pUL46 10
aminoácidos desde el extremo carboxilo terminal de VP11/12 (después de L710). Una porción
del sitio de múltiple clonamiento de pUL46 conteniendo el sitio de restricción HindIII fue
removido por escisión del fragmento NheI-EcoRI. El cDNA de GFP fue amplificado desde
pEGFP-N1 (Clontech) usando el par de partidores gtcaaagcttAAGATGGTGAGCAAGGGCGA
y cttgaagcttCTTGTACAGCTCGTCC. El cDNA de GFP fue entonces inserto en el sitio
remanente de HindIII dentro de UL46.
18
TABLA I. Clasificación alfabética de acuerdo al nombre del fabricante de los reactivos
utilizados en este trabajo.
Nombre del Fabricante
Reactivos
Abcam
Anticuerpo anti-Giantin
Ambion, Inc.
Agua libre de nucleasas
Gibco Laboratories Life Technologies, Inc.
DMEM, Tripsina 0,25X, B-27, SFB, LGlutamina 100X,
Antibiótico/Antimicótico 100X,
Optimem. Neurobasal.
IDT
Partidores forward y reverse VP11/12
fragmento interno.
Invitrogen
Anticuerpos anti-rabbit y anti-mouse IgG
Alexa 488 y 594. Lipofectamina 2000.
New England BioLabs, Inc.
DNA ladder 100 pb, 1000 pb.
OMEGA bio-tek
Kit extracción pDNA E.Z.N.A
Sigma Aldrich
Poli-L-lisina.
19
3.2.4 LÍNEAS CELULARES
Para el desarrollo de esta tesis se utilizaron las siguientes líneas celulares:
Línea celular VERO E6 (riñón de mono verde africano Cercopithecus aethiops):
Corresponde a una línea epitelial inmortalizada utilizada en este trabajo para propagación y
titulación viral. Estas células se cultivaron y mantuvieron en monocapa en medio DMEM
suplementado con 10% SFB y 1% v/v penicilina/estreptomicina (100 U/mL). La incubación se
realizó a 37ºC en una atmósfera al 5% de CO2 y 95% humedad relativa.
Línea celular N2A (neuroblastoma de ratón): Corresponde a una línea neuronal inmortalizada
utilizada para transfección. Fue cultivada en DMEM al 10% de suero fetal bovino (SFB), 100
U/mL penicilina y 100 μg/mL estreptomicina en botellas de 25 cm2 a 37 ºC y 5 % CO2.
Línea celular H4 (neuroglioma humano): Corresponde a una línea neuronal inmortalizada
utilizada para transfección. Fue cultivada en DMEM al 10% de suero fetal bovino (SFB), 100
U/mL penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina en botellas de 25 cm2 a 37°C y 5% CO2.
Línea celular HT22 (hipocampo de ratón): Corresponde a una línea neuronal inmortalizada
utilizada para transfección. Fue cultivada en DMEM al 10% de suero fetal bovino (SFB), 100
U/mL penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina en botellas de 25 cm2 a 37°C y 5% CO2.
20
3. 3 METODOLOGÍA
3.3.1. PROPAGACIÓN DE VIRUS HERPES SIMPLEX TIPO 1
Para propagar VHS-1 se utilizaron células VERO, las cuales se mantuvieron en monocapa en
medio DMEM al 10% SFB en botellas de 150 cm2. Éstas se infectaron con 1 mL de stock de
VHS-1. La adsorción del virus se realizó durante una hora, con agitación cada 10 minutos a 37ºC
y 5% CO2. Posteriormente se eliminó el medio y se incubaron las células en medio DMEM al
10% SFB hasta visualizar efecto citopático en el 95% de las células (48-72 horas post-infección).
Una vez visualizado éste efecto, las células se sometieron a ciclos de congelamiento (-80°C) y
descongelado a temperatura ambiente. Luego se centrifugó el medio a 10.000 rpm durante 5
minutos. A partir del sobrenadante se obtuvieron los stocks virales utilizados en el presente
estudio, los cuales se conservaron en alícuotas a -80°C para su posterior titulación.
3.3.2. TITULACIÓN VIRAL
A partir de una alícuota obtenida al propagar el virus, se prepararon 6 diluciones de ésta, en base
10 (X * 10 -y). Cada dilución se agregó sobre células VERO crecidas en monocapa en placas de 6
pocillos. Esta placa se infectó 1 hora a 37oC al 5% CO2, con agitación manual cada 10 minutos.
Pasado ese tiempo, se adicionó a cada pocillo una mezcla de 1,2% agarosa en agua y DMEM 2X
al 1% SBF en una relación 1:1 y se incubó a 37°C al 5% CO2 por 72 horas. Luego se le adicionó
formalina al 37% + cristal violeta por 30 minutos con el fin de fijar y teñir las células. Finalmente
se eliminó la agarosa de cada pocillo.
21
El título de la preparación viral se calculó contando el número de placas de lisis que produjo una
determinada dilución de la alícuota viral.
Cada partícula infecciosa da origen a una placa de lisis y se denomina unidad formadora de placa
(PFU). El título se expresa como PFU/mL.
Ejemplo de cálculo:
No de placas de lisis
(Volumen virus x dilución del virus)
Título viral (PFU/mL) =
Título viral (PFU/mL) =
1,2x107 (PFU/mL) =
60
(0,5 mL x 10-5)
60
(0,5 mL x 10-5)
La concentración viral corresponde a 1,2x107 (PFU/mL). Para obtener un MOI de 10, es decir, 10
partículas virales infecciosas por célula, se necesita saber el número de células en la placa. Para
saber la cantidad necesaria de partículas virales para obtener un MOI 10 se realizó el siguiente
cálculo:
10PFU -------------> 1 célula
X -------------> 0,2*106 células
X = 2 * 106 PFU
Al saber la concentración del virus y el número de partículas virales necesarias para obtener un
MOI 10 de infección, se determinó el volumen necesario de virus que se debe agregar al medio.
22
1,2*107PFU --------> 1mL
2*106PFU --------> X mL
X =0,167mL
Por lo tanto, con 167 uL del virus por pocillo (placa 24 pocillos) se obtiene un MOI de 10. Los
volúmenes de virus y medio se ajustaron de manera que siempre existió un volumen final mínimo
de 100 uL para infectar cada pocillo.
3.3.3 CULTIVO PRIMARIO DE NEURONAS CORTICALES DE RATÓN
Se realizó según lo descrito por Zambrano et al., 2008. Se utilizaron ratonas Balb/C preñadas de
18 días de gestación, las que fueron provistas por el Bioterio Central de la Facultad de Ciencias
Biológicas de la Pontificia Universidad Católica de Chile, mantenidos en condiciones sanitarias
adecuadas con fotoperiodos de 12 horas a 25 ºC y alimentados con una dieta comercial para
ratones, con libre disposición de alimento y de agua. Las ratonas fueron sacrificadas por dosis
letal de sodium pentabarbitone intravenoso (200 mg/kg total de peso). La muerte fue confirmada
por observación de la cesación de los latidos cardiacos y de la respiración, y ausencia de reflejos,
de acuerdo a lo sugerido por organizaciones internacionales (www.lal.org.uk). Posteriormente se
diseccionaron las cortezas de los embriones extraídos. Se colocaron en solución salina balanceada
Hanks, suplementada con 10 mM HEPES (pH 7,4), 50 U/mL penicilina, 50 mg/mL
estreptomicina y 0,5% glucosa (HBSS); eliminando manualmente las meninges. El tejido se lavó
tres veces por decantación en HBSS 1X y luego se incubó por 5 minutos a 37ºC con 0,25%
tripsina. Luego se inactivó y eliminó la tripsina y se le adicionó medio DMEM al 10% SFB para
disociar el tejido mecánicamente utilizando pipetas de vidrio (5, 2 y 1 mL) y pipetas Pasteur de
23
mayor a menor diámetro hasta no percibir resistencia. Las células disgregadas recolectadas del
sobrenadante, se sembraron en placas de 24 pocillos 15,6 mm (densidad de 1,9 x 105células por
placa) cubiertas con poli-L-lisina, y fueron mantenidas en DMEM suplementado con 10% SFB.
Luego de 30 minutos se cambió el medio por uno libre de suero (Neurobasal suplementado con
B27, 2 mM L-glutamina, 1% v/v penicilina/estreptomicina 100 U/mL). Pasados 3 días de
crecimiento, se agregó al medio de cultivo 1uM de AraC, un compuesto inhibidor de
proliferación celular con el fin de disminuir la presencia de células gliales. Finalmente las células
se mantuvieron durante 8 días a 37ºC en un ambiente al 5% CO2 y 95% de humedad hasta la
realización de los experimentos. Los restos no utilizados de los animales se eliminaron de
acuerdo a la Norma Institucional de Bioseguridad de la Universidad Austral de Chile. Los
laboratorios disponen de las condiciones de seguridad necesarias para el personal; y el manejo y
eliminación de las muestras biológicas y reactivos químicos, (Manual de Procedimientos de
Manejo
de
Residuos
de
la
Universidad
Austral
de
Chile
(www.uach.cl/direccion/investigacion/bioseguridad.htm), Normas de Bioseguridad de CONICYT
(2008).
3.3.4 TRANSFORMACIÓN
En un tubo estéril (eppendorf) se agregó ADN (1 uL) conteniendo el plásmido y se dejó en hielo.
Se le agregaron 15 uL de bacterias competentes al tubo eppendorf y se mezcló suavemente con
pipeta. Se dejó la mezcla en hielo por 30 minutos. Luego se le dio un shock térmico a 42°C por
45 segundos. Se dejó el tubo en hielo por 2 minutos. Posteriormente se le adicionaron 400 uL de
medio SOC y se incubó por 1 hora a 37°C en agitación. Una vez concluido el tiempo de
incubación se centrifugó el tubo a 4000 rpm por 5 minutos. Se agregaron 50 uL de células
24
transformadas a una placa agar-LB con ampicilina (100 mg/mL) y se dejó crecer overnight a
37°C.
3.3.5 EXTRACCIÓN DE ADN PLASMIDIAL
La extracción de ADN plasmidial (pADN) se realizó utilizando el kit de extracción: E.Z.N.A
Plasmid Mini Spin Protocol.
Luego de que las bacterias hayan sido transformadas se repicó una colonia (de las más grandes)
en 2 mL de medio LB con ampicilina (100 mg/mL) en un tubo para crecimiento bacteriano. Se
dejó crecer overnight a 37°C en agitación a 200 rpm. Al día siguiente: una vez que se observa
turbidez en el medio, se obtiene un stock de glicerol en esterilidad. El stock se obtuvo sacando
200 uL de bacterias transformadas en un tubo eppendorf estéril y agregando 300 uL de glicerol
(autoclavado al 80%), de modo que la solución obtenida quedó al 50%. El stock obtenido se
guardó a -80°C. Para la extracción de ADN plasmidial, se colocó 1,4 mL de bacterias
transformadas en un tubo eppendorf de 1,5 mL. Se centrifugó el tubo durante 1 minuto a 1000 g.
Se aspiró el sobrenadante con bomba y se agregó 250 uL de la solución I/RNAsa A y se
resuspendió el pellet. Luego se le agregó 250 uL de la solución II y se mezcló por inversión. Se
dejó 2-3 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se adicionó 350 uL de la solución III,
se mezcló por inversión hasta observar un precipitado floculente blanco y se centrifugó por 10
minutos a 13000 g. Se preparó la mini columna HiBind DNA. Para ello se colocó en un tubo
colector de 2 mL y se le añadieron 100 uL de buffer de equilibrio. Se centrifugó por 1 minuto a
13000 g y se eliminó el eluído. Se agregó el sobrenadante obtenido a la columna y se centrifugó
por 1 minuto a 13000 g a temperatura ambiente. Luego se le agregó 500 uL de buffer HB y se
centrifugó a 13000 g por 1 minuto. Después se agregó 700 uL de buffer DNA wash y se
25
centrifugó por 1 minuto. Se repitió este paso. Luego se centrifugó la columna vacía por 2 minutos
a 13000 g para secar la columna. Finalmente se colocó la columna en un nuevo tubo eppendorf
estéril de 1,5 mL. Se añadió 40 uL de buffer de elución, se incubó 1 minuto a temperatura
ambiente y se centrifugó por 1 minuto a 13000 g. El pADN obtenido fue cuantificado usando el
espectrofotómetro MaestroNano y conservado a 4°C para su posterior utilización.
3.3.6 DIGESTIÓN CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
El pADN de pUL46 y pGUL46 fue incubado overnight a 37°C con las mezclas de reacción que
se detallan en la Tabla II. Las digestiones se realizaron con las enzimas HindIII, XhoI y EcoRI.
Posterior a la incubación, las muestras digeridas se mezclaron con buffer de carga y se corrieron
en un gel de agarosa al 0,8% por 40 minutos a 110 Volts, como puede observarse en la figura 5.
TABLA II. Reacciones de digestión enzimática.
H2O s/n
Buffer 10X
pDNA
Enzima
pUL46
Hasta 20 uL
2 uL
1 ugr
0,5 uL
pGUL46
Hasta 20 uL
2 uL
1 ugr
0,5 uL
26
3.3.7. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) CONVENCIONAL.
Se realizó PCR convencional para una región específica del gen UL46 que codifica para la
proteína viral VP11/12, correspondiente a un fragmento interno de aproximadamente 186 pb. En
las tablas III, IV y V se detalla la selección de los partidores utilizados, los componentes de la
reacción utilizados y el programa utilizado, respectivamente.
27
TABLA III. Partidores utilizados en la reacción de PCR convencional.
Gen (pb)
Secuencia (5’-3’)
Tamaño del fragmento (pb)
UL46 (Frag. Interno)
Forward
186
GCCTTGATGCTCAACTCCAT
Reverse
TCACCACGCCCAGTATATCA
28
TABLA IV. Componentes para la reacción de PCR convencional de VP11/12 fragmento
interno.
Master Mix
Volumen 1X (ul/tubo)
Concentración final
GoTag Flexi Buffer 5X
2,5
1X
MgCl2 25 mM
1,0
2 mM
dNTP 1 mM
1,25
0,1 mM
Partidor Forward 10 uM
0,5
0,4 uM
Partidor Reverse 10 uM
0,5
0,4 uM
GoTag DNA polimerasa 5 U/uL
0,065
1,25 U
Agua libre de nucleasas
5,685
pDNA
1
Volumen total
12,5
140 ng/uL
29
TABLA V. Programa utilizado para PCR convencional de VP11/12 fragmento interno.
ETAPA
TEMPERATURA (°C)
TIEMPO
Denaturación inicial
95
2 minutos
Denaturación
95
20 segundos
Annealing
55
20 segundos
Extensión
72
1 minutos 30 segundos
Extensión final
72
10 minutos
N° de ciclos: 30
30
3.3.8 CINÉTICA DE INFECCIÓN
Las neuronas corticales de ratón fueron sembradas en coverslip en placas de 15,6 mm hasta
alcanzar una confluencia aproximada del 90%. Posteriormente se realizó la infección con VHS-1
(infección productiva). La infección con VHS-1 se realizó agregando a las placas de cultivo el
volumen de virus correspondiente para alcanzar un MOI 10 de infección, el cual se incubó
durante una hora a 37ºC y 5% CO2, agitando suavemente cada 10 minutos para así poder obtener
una adsorción homogénea del virus. Posteriormente se removió el virus y se restauró el medio de
crecimiento, este tiempo es considerado 0 post-infección. Transcurridas 2 horas a partir de la
restauración del medio, se extrajo un coverslip, el cual fue lavado en PBS 1X C-M (CaCl2 0,1
mM, MgCl2 1 mM) y se fijó en para-formaldehído (PFA) 4% durante 20-30 minutos. Luego de
haber sido fijado, se lavó con PBS 1X y se mantuvo en este buffer hasta la realización de la IFI.
Una vez transcurridas 4 horas desde el tiempo 0, se extrajo nuevamente un coverslip, considerado
en este caso 4 hpi (horas post-infección) y se realizó el procedimiento detallado anteriormente.
Este proceso se repitió a 2, 4, 8, 18 y 24 hpi. Al finalizar la cinética, se extrajo el coverslip
correspondiente al Mock (control).
3.3.9 SINCRONIZACIÓN CELULAR
Las células fueron tratadas por 48 horas con DMEM al 2% de suero fetal bovino (SFB), 100
U/mL penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina en botellas de 25 cm2 a 37°C y 5% CO2 para
lograr una sincronización del ciclo celular en todo el cultivo.
31
3.3.10 TRANSFECCIÓN
La transfección tanto de las líneas celulares como del cultivo primario se realizó según el
protocolo establecido por los fabricantes del reactivo de transfección, Lipofectamina 2000 (Dalby
et al, 2004). A partir de células con un 90-95% de confluencia, se prepararon los siguientes mix
para cada muestra de transfección (coverslips):
A) Dilución de 0,8 ugr. de ADN en 50 uL de OPTIMEM sin suero. Se mezcló
generosamente.
B) Dilución de 2 uL de Lipofectamina en 50 uL de OPTIMEM sin suero. Se mezcló
generosamente y se dejó 5 minutos a temperatura ambiente.
Se combinaron ambas diluciones. Se mezcló generosamente y se dejó 20 minutos a temperatura
ambiente. Una vez concluidos los 20 minutos, se agregó 100 uL del complejo de transfección a
cada pocillo conteniendo células y medio, y se mezcló generosamente. Las células fueron
incubadas a 37°C en una incubadora húmeda con 5% CO2 por 15-18 horas, posterior a los cuales
se realizó la inmunofluorescencia respectiva.
3.3.11 INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
Las células fueron sembradas en portaobjetos redondos (coverslips) dentro de una placa de 24
pocillos para facilitar su manipulación. Al alcanzar una confluencia del 90% fueron transfectadas
y fijadas para posteriormente realizar la inmunofluorescencia indirecta.
3.3.11.1 Fijación con para-formaldehído y bloqueo con gelatina
Las células fueron fijadas en PFA 4% durante 10 minutos y luego mantenidas en PBS 1X C-M
por tiempo indefinido a 4°C hasta su utilización. Luego de la fijación se dejó en Tritón X-100
32
0,2% por 10 minutos. Posteriormente el coverslip es bloqueado en gelatina al 0,2% durante 10
minutos. Se incubó con el anticuerpo primario (rabbit anti-Giantin, rabbit anti-GM130) durante
media hora a 37°C en cámara húmeda. Se lavó el coverslip con PBS C-M 1X por 10 minutos y se
incubó con el anticuerpo secundario (anti-rabbit Alexa 594) por 30 minutos a 37°C en cámara
húmeda. Finalmente cada coverslip fue lavado e incubado con DAPI (núcleo) por 10 minutos a
37°C en cámara húmeda. Pasado el último lavado fue montado utilizando los reactivos Dako
Fluorescence Mounting Medium o ProLong® Gold antifade reagent with DAPI, según
corresponda, y puesto a secar durante una hora a 37°C. El portaobjeto fue guardado a 4°C en
oscuridad hasta su utilización.
3.3.11.2 Fijación con para-formaldehído y bloqueo con solución de suero de caballo
Las células fueron fijadas en PFA 4% durante 10-30 minutos y luego mantenidas en PBS 1X CM (CaCl2 0,1 M y MgCl2 1 M) por tiempo indefinido a 4°C hasta su utilización. Luego de la
fijación se dejó en solución de PBS Tritón X-100 (0,2%) por 2 minutos. Posteriormente el
coverslip fue bloqueado en solución de bloqueo (0,5 M EDTA, Fish Gelatin Podwer al 1%, BSA
libre de IgG al 1%, Suero de Caballo al 1% y H2O destilada) previamente preparado a partir de la
dilución de un stock 3X durante 1 hora a T° ambiente. Se incubó con el anticuerpo primario
(rabbit anti-Giantin, rabbit anti-GM130) overnight a 4°C en cámara húmeda. Se lavó el coverslip
con PBS C-M 1X por 10 minutos y se incubó con el anticuerpo secundario (anti-rabbit Alexa
594) por 1 hora a T° ambiente en oscuridad y en cámara húmeda. Finalmente cada coverslip fue
lavado e incubado con DAPI (núcleo) por 10 minutos a 37°C en cámara húmeda. Pasado el
último lavado fue montado utilizando los reactivos Dako Fluorescence Mounting Medium o
33
ProLong® Gold antifade reagent with DAPI, según corresponda,
y puesto a secar durante una
hora a 37°C. El portaobjeto fue guardado a 4°C en oscuridad hasta su utilización.
3.3.12 REGISTRO DE IMÁGENES Y CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA
Una vez finalizada la inmunofluorescencia se procedió a su análisis utilizando el microscopio de
epifluorescencia Zeiss Axioskope A1. Se tomó registro fotográfico de 3 campos visuales por
muestra, repitiendo la unidad experimental completa 3 veces. Para la caracterización fenotípica
de la inmunofluorescencia utilizando anticuerpo anti-Giantin, las células fueron clasificadas de
acuerdo a la reacción del anticuerpo en una de dos categorías: normal o alterado, entendiendo
como normal el decorado en una estructura perinuclear continua, característica del aparato de
Golgi en células de mamífero en cultivo, y como alterado la presencia de decorado en estructuras
citoplasmáticas no yuxtanucleares (Weller et al., 2010). Los resultados fueron posteriormente
graficados con el programa GraphPad Prism 5. Para la caracterización de la infección neuronal
con VHS-1, cultivos primarios de neuronas corticales fueron infectados a un MOI 10,
transcurrido el tiempo de infección las células fueron fijadas y se realizó una IFI. Para efecto de
cuantificación de infectividad, las células fueron teñidas con un anticuerpo específico para ICP8
como un marcador de infección viral y para viabilidad con DAPI como marcador nuclear. Los
resultados corresponden a tres experimentos independientes y fueron graficados utilizando el
programa GraphPad Prism 5. Para efecto de caracterización fenotípica durante infección
productiva, posterior a la infección se realizó una IFI utilizando un anticuerpo específico contra
Giantin, como marcador del AG. El patrón de tinción para Giantin fue clasificado en dos
categorías: normal y alterado, continuando con el mismo criterio expuesto más arriba.Los
34
resultados fueron graficados utilizando el programa GraphPad Prism 5. Para realizar el ensayo
de viabilidad celular utilizando la técnica de inmunofluorescencia se cultivaron células HT22 en
coverslips de la misma manera como se realizó para el ensayo de transfección. Estos coverslips
fueron transfectados con pGUL46 durante 4 y 15 horas. Una vez finalizada la transfección, las
células se fijaron en 4% PFA y se realizó microscopía de fluorescencia. Todas las imágenes
fueron capturadas a 63X de amplificación y se obtuvieron 3 campos distintos por cada tiempo de
transfección. La unidad experimental se repitió al menos tres veces con cultivos celulares
diferentes. Una vez obtenidas las imágenes, los núcleos teñidos con DAPI fueron contados
utilizando el programa Image J, utilizando como criterio que una célula viable corresponde a una
célula cuyo núcleo se encuentra teñido. Para el cálculo del porcentaje de viabilidad celular se
utilizó el promedio de células contadas en el control como 100% de viabilidad. Los valores
obtenidos se graficaron con el programa GraphPad Prism 5.
3.3.13 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los resultados obtenidos representan al menos tres unidades experimentales independientes. Los
datos obtenidos se graficaron en el programa GraphPad Prism 5 utilizando el análisis estadístico
One-way ANOVA (viabilidad e infectividad) y Two-way ANOVA (caracterización fenotípica).
Un valor de p<0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
35
4. RESULTADOS
4.1 PROTEÍNA VIRAL VP11/12
Como paso inicial en el estudio de la proteína viral VP11/12, se transformaron bacterias E. coli
competentes con el plásmido pGUL46, que codifica para esta proteína acoplada a la proteína
verde fluorescente (GFP) (Ver Anexos) según está descrito en la sección Materiales y Métodos
(página 23). El éxito de la técnica se observa a través de la aparición de puntos blancos que
corresponden a colonias que incorporaron el plásmido (Ver Anexos). Una vez finalizada la
transformación se guardó un stock de bacterias en glicerol a -80°C para usos posteriores. Seguido
de la purificación y cuantificación del ADN plasmidial (pADN) se realizó una reacción de PCR
para comprobar que el plásmido contenía clonado el material génico viral. Para esto se utilizó un
set de partidores específicos para un fragmento interno de 186 pb del gen UL46. Los detalles
tanto del programa de PCR así como de los partidores se encuentran en la sección de Materiales y
Métodos (página 26). Posteriormente las muestras fueron corridas en un gel de agarosa al 1,5%
para visualizar los productos de amplificación y el pADN obtenido de la transformación inicial
(Figura 3). Los resultados obtenidos en la figura 3 confirman la presencia del gen dentro del
plásmido, por la presencia de una banda de unos 200 pb en el carril 2. Continuando con la
caracterización del plásmido, se realizó un ensayo de digestión con enzimas de restricción tanto
para pGUL46 como para pUL46 (el cual no está acoplado a GFP). Para ello los pADN fueron
incubados overnight a 37°C con las enzimas HindIII, XhoI y EcoRI con sus buffers respectivos,
de manera individual o conjunta según indica la figura 4.
36
B
A
St.
1
St.
2
Figura 3. Plásmido pGUL46 que codifica la proteína VP11/12 del VHS-1 fusionada a GFP.
A) Gel de agarosa mostrando el plásmido pGUL46 que codifica para la proteína VP11/12-GFP
clonada inicialmente en el vector pcDNA 3.1 (carril 1). B) Gel de agarosa mostrando el producto
de amplificación de la reacción de PCR de VP11/12 a partir de pGUL46 purificado (carril 2).
Las flechas indican los tamaños correspondientes al plásmido pGUL46 purificado (8500 pb) y al
producto de PCR de VP11/12 esperado (186 pb) aprox. St.: estándar de peso molecular.
37
St
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12 13
14
Figura 4. Análisis de restricción para los plásmidos pUL46 y pGUL46. Gel de agarosa al
0,8% mostrando los productos de digestión de ambos plásmidos de UL46. Cada plásmido fue
incubado overnight a 37°C con una mezcla de reacción conteniendo las enzimas de restricción
HindIII (carriles 1 y 2), EcoRI (carriles 4 y 5), XhoI (carriles 7 y 8) y XhoI/EcoRI (carriles 10 y
11). Los carriles 13 y 14 corresponden a los plásmidos sin digerir. Las fechas indican los
productos esperados para GFP (750 pb), VP11/12 (2250 pb) y VP11/12-GFP (2900 pb)
aproximadamente. St.: corresponde al estándar de peso molecular mientras que (-) corresponde a
los controles negativos (sin pADN).
38
Al tratar pUL46 con HindIII es posible observar una banda correspondiente al marco de lectura
completo para VP11/12, de alrededor de 2257 pb y una banda de alrededor de 5389 pb que
corresponde al resto del plásmido. Al realizar la reacción de digestión con la misma enzima pero
con el plásmido pGUL46 se obtuvo un fragmento de alrededor de 750 pb, correspondiente al
marco de lectura abierto que codifica para GFP y una banda de aproximadamente 7621 pb, que
corresponde al resto del plásmido. Los resultados obtenidos son consistentes con lo esperado,
puesto que pUL46 contiene dos sitios de corte para HindIII que se encuentran delimitando el
ORF de UL46, uno en el sitio de múltiple clonamiento y otro en el extremo c-terminal. pGUL46
por otra parte, no contiene un sitio de corte para HindIII en el SMC del plásmido, porque éste fue
removido, sin embargo, mantuvo el sitio de corte en el extremo c-terminal del ORF de UL46 y,
además, se insertaron sitios de corte para esta enzima en el ORF de GFP, por lo que al realizar la
digestión y correr el gel, es posible observar la banda que corresponde a GFP de unos 750 pb, lo
que indica que se ha liberado del fragmento. Al tratar ambos plásmidos con la enzima EcoRI se
obtuvo una linearización de los mismos, puesto que ambos sólo contienen un sitio de corte para
esta enzima, esto se observa en la figura 4 en donde se aprecia una sola banda para cada caso,
correspondiente a 7646 pb (pUL46) y 8369 pb (pGUL46). Los mismos resultados fueron
obtenidos al tratar ambos plásmidos con la enzima XhoI, la cual también posee sólo un sitio de
corte dentro del plásmido. Finalmente, al tratar ambos plásmidos con las enzimas XhoI y EcoRI
conjuntamente, es posible liberar el ORF de UL46, puesto que éste se encuentra clonado entre
ambos sitios de corte. Las diferencias en la migración entre ambos plásmidos, se deben a que
pGUL46 contiene en su región 5’ el ORF de GFP, de 750 pb aproximadamente, lo que le otorga
un mayor tamaño.
39
4.2 DISTRIBUCIÓN SUBCELULAR DE VP11/12-GFP
Para determinar la distribución subcelular de esta proteína viral, se transfectaron líneas
neuronales usando el reactivo de transfección Lipofectamina 2000 (Invitrogen), luego de evaluar
la eficiencia de transfección de dos reactivos comerciales (Ver Anexos). Para este efecto,
posterior a la transfección del plásmido pGUL46 (como indica Materiales y Métodos), se realizó
una microscopía de fluorescencia en donde los núcleos fueron teñidos con DAPI (Figura 5). Los
resultados obtenidos indican que esta proteína viral tendría principalmente una distribución
perinuclear, lo que se observa a través de la presencia de fluorescencia verde en las zonas que
rodean al núcleo. En células como HT22 la distribución de esta proteína además se extiende por
el citoplasma y en el caso de neuronas, por los axones. Posteriormente se cuantificó la eficiencia
de transfección en las distintas líneas celulares y cultivo primario (Figura 6). Los resultados
obtenidos señalan la baja eficiencia con lo que estos cultivos fueron transfectados, la que no
supera el 20%.
40
A
B
C
Figura 5. Distribución subcelular de la proteína viral VP11/12 de VHS-1 en células
neuronales y neuronas corticales. Las células A) H4 B) HT22 C) N2A D) neuronas corticales
de ratón, fueron transfectadas de acuerdo a los protocolos del fabricante con el plásmido
pGUL46. Luego de 24 horas post-transfección se realizó microscopía de fluorescencia para la
detección de la proteína viral (expresando GFP) y tinción de los núcleos con DAPI. Los
experimentos fueron realizados en triplicado. Imágenes en aumento 63X.
D
41
19,35%
16%
13,3 %
2,74%
Figura 6. Eficiencia de transfección de VP11/12-GFP en células neuronales. Las células
fueron transfectadas con el plásmido pGUL46. Transcurrido el tiempo de transfección se realizó
microscopía de fluorescencia contra la proteína viral mientras que los núcleos fueron teñidos con
DAPI. Para efectos de cálculo, se tomaron fotografías a cinco campos en un aumento del 40X y
luego se contaron las células teñidas con DAPI. Posteriormente se contaron las células que
expresaban el plásmido (emisión de fluorescencia verde). Los valores fueron graficados con el
programa GraphPad Prism 5.
42
4.3 LOCALIZACIÓN Y DISTRIBUCIÓN DE GIANTIN AL EXPRESAR VP11/12-GFP
Considerando que Giantin es una proteína de la matriz del aparato de Golgi que sufre una redistribución producto de la mitosis celular, se sincronizaron los cultivos celulares para evitar la
mal interpretación de resultados. Con este fin se realizó una deprivación de suero (2% SFB)
durante 48 horas, previas a la transfección. Una vez sincronizados los cultivos en fase G0/G1 del
ciclo celular se realizó la transfección con el plásmido pGUL46 y luego una IFI contra Giantin.
La alteración de su distribución se observa en células N2A (Figura 7), H4 (Figura 8), HT22
(Figura 9) y cultivo primario de neuronas corticales de ratón (Figura 10). En todas las líneas
celulares (excepción células H4, ver figura 8) se observó la pérdida de la distribución normal de
esta proteína y un aumento del fenotipo alterado tras la expresión de esta proteína viral. Al
expresar VP11/12-GFP en células N2A el fenotipo alterado ascendió a un 60% y la distribución
de Giantin se redujo a un patrón de tipo puntiforme dentro del citoplasma (figura 7). En células
H4 el fenotipo alterado alcanzó poco más de un 20% y no se observaron cambios en la
distribución de Giantin con respecto al control (figura 8). Mientras que en células HT22 el
fenotipo alterado alcanzó poco más del 40% al expresar esta proteína viral observándose la
pérdida de la distribución normal de Giantin, por una de carácter más segmentado y disperso
(figura 9). Finalmente en neuronas corticales el fenotipo alterado correspondió a un 50% de las
células transfectadas. Se observó dispersión de Giantin dentro de la región perinuclear (figura
10). La figura 11 presenta un resumen de los resultados obtenidos para el fenotipo alterado en
todas las líneas celulares utilizadas. El efecto de la expresión de esta proteína viral sobre Giantin
a las 4 y 15 h.p.t. se puede observar en la figura 12. A las 4 y 15 h.p.t. se observó alteración en el
fenotipo de Giantin siendo mayor el porcentaje de células transfectadas a las 15 h.p.t., a pesar de
la reducción en la viabilidad a un 40%. Los experimentos fueron realizados en triplicado.
43
A)
B)
Figura 7. Expresión de la proteína viral VP11/12-GFP causa alteración de la distribución de
Giantin en células N2A. A) Células N2A fueron transfectadas con el plásmido pGUL46. Posttransfección se realizó una IFI con un anticuerpo específico para Giantin. Los núcleos fueron
teñidos con DAPI. Las imágenes fueron tomadas con aumento 63X. C: control T: transfección.
B) Caracterización fenotípica de Giantin. La distribución del anticuerpo fue clasificado en dos
categorías: normal y alterado. Los resultados obtenidos fueron graficados usando el programa
GraphPad Prism 5.
44
A)
B)
Figura 8. Expresión de la proteína viral VP11/12-GFP causa una leve alteración de la
distribución de Giantin en células H4. A) Células H4 fueron transfectadas con el plásmido
pGUL46. Post- transfección se realizó una IFI con un anticuerpo específico para Giantin Los
núcleos fueron teñidos con DAPI. Las imágenes fueron tomadas al 63X. C: control T:
transfección. B) Caracterización fenotípica de Giantin. La distribución del anticuerpo fue
clasificado en dos categorías: normal y alterado. Los resultados obtenidos fueron graficados
usando el programa GraphPad Prism 5.
45
A)
B)
Figura 9. Expresión de la proteína viral VP11/12-GFP causa alteración de la distribución de
Giantin en células HT22. A) Células HT22 fueron transfectadas con el plásmido pGUL46. Posttransfección se realizó una IFI con un anticuerpo específico para Giantin. Los núcleos fueron
teñidos con DAPI. Las imágenes fueron tomadas al 63X. C: control T: transfección. B)
Caracterización fenotípica de Giantin. La distribución del anticuerpo fue clasificado en dos
categorías: normal y alterado. Los resultados obtenidos fueron graficados usando el programa
GraphPad Prism 5.
46
A)
B)
Figura 10. Expresión de la proteína viral VP11/12-GFP causa una leve alteración de la
distribución de Giantin en neuronas corticales. A) Neuronas corticales fueron transfectadas
con el plásmido pGUL46. Post- transfección se realizó una IFI con un anticuerpo específico para
Giantin. Los núcleos fueron teñidos con DAPI. Las imágenes fueron tomadas al 63X. C: control
T: transfección. B) Caracterización fenotípica de Giantin. La distribución del anticuerpo fue
clasificado en dos categorías: normal y alterado. Los resultados obtenidos fueron graficados
usando el programa GraphPad Prism 5.
47
Figura 11. Expresión de la proteína viral VP11/12-GFP causa alteración fenotípica de
Giantin en distintas líneas neuronales. Gráfica que reúne los porcentajes fenotípicos alterados
de Giantin en células sin expresar VP11/12-GFP (control) versus células transfectadas (resumen
de los resultados anteriores). Los resultados obtenidos fueron graficados usando el programa
GraphPad Prism 5 utilizando el análisis estadístico Two-way ANOVA. Nota: el porcentaje
fenotípico normal de Giantin de las células control asciende a un 80-90% en todas las líneas
celulares. Los resultados obtenidos también fueron observados a 4 horas post-transfección.
48
A)
B)
Figura 12. Expresión de la proteína viral VP11/12-GFP causa una redistribución de Giantin
y una disminución de la viabilidad celular. Células HT22 fueron transfectadas durante 4 y 15
horas. Posterior a la transfección, las células fueron fijadas en 4% de PFA y se realizó una IFI
para Giantin. A) Efecto de expresión de VP11/12-GFP sobre el marcador específico de AG
Giantin. B) Viabilidad celular de células HT22 post-transfección. El control corresponde al
promedio de núcleos positivos para DAPI en células sin transfectar; h.p.t: horas posttransfección. Imágenes tomadas a aumento 63X. Los resultados obtenidos fueron graficados con
el programa GraphPad Prism 5 y se utilizó el análisis estadístico One-way ANOVA.
49
4.4 LOCALIZACIÓN Y DISTRIBUCIÓN DE GIANTIN Y GM130 DURANTE
INFECCIÓN NEURONAL CON VHS-1
Cultivos primarios de neuronas corticales fueron infectados con VHS-1 (MOI 10) para evaluar
posibles cambios en la localización y distribución de dos proteínas de la matriz del AG (Giantin y
GM130) durante infección productiva. Los resultados obtenidos se exponen a continuación
(Figuras 13 y 14). A partir de las 4 hpi se observó dispersión de tipo puntiforme en la distribución
de Giantin la que se extiende hasta las 24 hpi. Para GM130 los cambios comenzaron a observarse
a partir de las 8 hpi extendiéndose hasta las 24 hpi. Los cambios observados tanto para Giantin
como para GM130 indican un cambio en la distribución, posiblemente por fragmentación o
retención en otro compartimento, puesto que desde una localización característica en la zona
perinuclear se observa una localización a lo largo del citoplasma, esto observado a través de la
inmunoreacción puntiforme generada por los anticuerpos. La caracterización de la infección se
detalla en las gráficas presentadas en la Figura 15. En esta caracterización se obtuvo que a
medida que progresa la infección viral aumenta el porcentaje de infectividad, evaluado a través
de células reactivas para el marcador viral ICP8. Conjunto a este aumento se observó
disminución de viabilidad celular, medido a través de células reactivas para DAPI, esta
disminución comenzó a partir de las 2 horas y alcanzó un 40% a las 18-24 hpi. Con respecto a la
caracterización fenotípica, el fenotipo alterado obtuvo su valor máximo a las 8 hpi, alcanzando un
60%, para luego disminuir hasta un 40% a las 24 hpi. Los resultados corresponden a tres
experimentos independientes.
50
Figura 13. Infección neuronal por VHS-1 causa alteración de la distribución de la proteína
del Golgi Giantin. Cultivo primario de neuronas corticales fue no-infectado (mock) o infectado
con VHS-1 (MOI 10) durante una hora. Después de la infección las células fueron fijadas a las 2,
4, 8, 18 y 24 hpi y se realizó una inmunofluorescencia indirecta. Las células fueron teñidas con
anticuerpos específicos para Giantin e ICP8. Los núcleos fueron teñidos con DAPI. Imágenes en
63X.
51
Figura 14. Infección neuronal por VHS-1 causa alteración de la distribución de la proteína
del Golgi GM130. Cultivo primario de neuronas corticales fue no-infectado (mock) o infectado
con VHS-1 (MOI 10) durante una hora. Después de la infección las células fueron fijadas a las 2,
4, 8, 18 y 24 hpi y se realizó una inmunofluorescencia indirecta. Las células fueron teñidas con
anticuerpos específicos para GM130 e ICP8. Los núcleos fueron teñidos con DAPI. Imágenes en
63X.
52
Figure 15. Caracterización de infección neuronal con VHS-1. A) Infectividad B) Viabilidad
celular C) Fenotipo de Golgi. Cultivos primarios de neuronas corticales fueron infectados con
VHS-1 y luego se realizó una IFI. Las células fueron teñidas con anticuerpos específicos para
ICP8 como marcador de infección, DAPI como marcador de células vivas. Para efectos de
análisis de fenotipo, la marca específica del anticuerpo Giantin se clasificó en dos categorías:
normal y alterado, entendiéndose por alterado cualquier distribución diferente a la normal. Los
resultados corresponden a 3 experimentos independientes y fueron graficados usando el programa
GraphPad Prism 5.
53
5. DISCUSIÓN
El rol individual de proteínas del tegumento del virus herpes simplex tipo 1 (VHS-1) sobre
proteínas del aparato de Golgi durante una infección productiva es hasta la fecha desconocido. Si
bien existe evidencia de que se generan cambios morfológicos en este compartimento celular en
líneas epiteliales bajo efecto de una infección por VHS-1, lo que sucede a nivel de proteínas
virales, tanto en epitelio como en neuronas, permanece sin ser dilucidado.
Bajo esta premisa el objeto de estudio de esta tesis lo constituyó el análisis del rol de la proteína
tegumentaria de VHS-1 VP11/12 sobre una proteína de la matriz del aparato de Golgi tanto en
líneas neuronales como en cultivo primario de neuronas corticales. Como paso inicial se
caracterizó el plásmido que expresa esta proteína, con y sin GFP, a través de PCR y digestión con
enzimas de restricción. Los resultados obtenidos corroboraron la presencia del gen UL46 dentro
del plásmido (ver figuras 4 y 5), permitiéndonos además, confirmar la presencia del ORF de
GFP. Como paso siguiente se estandarizó la técnica de transfección usando el reactivo de
transfección Lipofectamina 2000, luego de haber sido comparada su eficiencia de transfección
con otro reactivo comercial disponible (ver Anexos). Si bien existen líneas celulares que se
encuentran modificadas genéticamente para ser fácilmente transfectadas, las líneas neuronales
usadas en este trabajo no presentan tales modificaciones, por lo que la eficiencia con la que
fueron transfectadas osciló entre un 13% y 19%, este porcentaje disminuye drásticamente al
tratarse de cultivo primario de neuronas corticales, donde se obtuvo un 2,74% (Figuras 5 y 6). El
objetivo de este análisis fue constituir un precedente para la implementación de esta técnica en el
laboratorio. El resultado obtenido permitió establecer las líneas celulares óptimas para continuar
54
estudios en esta área. Optimizar los valores obtenidos permitirá la incorporación de otras técnicas
bioquímicas como Western blot para el análisis de los efectos de expresión de estas proteínas virales
sobre los niveles relativos de mRNA y proteína de factores celulares implicados durante la infección por
VHS-1.Las variaciones observadas entre estas líneas (ver figura 11) podrían atribuirse a las
características propias de cada línea celular así como al método de transfección utilizado. Los
factores a considerar para el análisis de estas diferencias son la composición y propiedades de sus
membranas plasmáticas, la polaridad celular, su tasa de crecimiento, así como su morfología y
distribución. Las células de neuroblastoma de ratón N2A, son una línea celular de morfología
neuronal y propiedades adherentes (ATCC CCL-131TM). Son sensibles a las modificaciones de
sus condiciones ambientales, por lo que se estresan fácilmente. Crecen formado una monocapa,
por lo que se facilita la comunicación entre células y por tanto, la transmisión del contenido
genético foráneo, sin embargo al ser un agente externo no es incorporado a todas las células, solo
ocurre entre células vecinas. Las células de neuroglioma humano H4, por otro lado, poseen una
morfología epitelial con propiedades adherentes; crecen en agregados facilitando la transfección
(ATCC HTB-148TM). Es considerada una línea anfitriona para transfecciones, lo que concuerda
con lo observado, ya que se obtuvo un 19,35% eficiencia de transfección, la más alta entre todas
las líneas utilizadas en este estudio. Por otra parte, las células HT22 corresponden a una línea
inmortalizada de hipocampo de ratón. Poseen un fenotipo adherente; crecen formando una
monocapa y la transfección ocurre entre células vecinas. La eficiencia de transfección en esta
línea fue de un 16%. En cultivo primario de neuronas corticales de ratón, la eficiencia resultó ser
de un 2,74%; estas diferencias se deben a que las neuronas se encuentran en un estado postmitótico del ciclo celular, son cultivos de carácter finito y por lo tanto, mucho más sensibles a las
condiciones ambientales, por lo que presentan resistencia a ser transfectadas. No crecen
55
formando monocapas por lo que la tasa de éxito de la técnica depende del número de conexiones
que se establezcan, y por lo tanto, de la calidad del cultivo. Los resultados obtenidos arrojaron
que tanto las líneas celulares H4 y HT22, al presentar los % más altos de transfección,
constituyen modelos neuronales óptimos para la realización de experimentos posteriores que
requieran esta técnica. Los valores obtenidos con esta técnica pueden mejorarse con el uso de
reactivos y técnicas especialmente estandarizadas para este tipo celular, como electroporación,
nucleofección, electroporación de células únicas, lipofección, adenovirus, virus asociados con
adeno, vectores lentivirales y micro-inyecciones, entre otras (Karra et al., 2010). O también
mediante
el
uso
de
kits
comerciales
especializados
como
neuVitro
(http://www.neuvitro.com/neuron-transfection-kit.htm) o sucesores de la Lipofectamina 2000, de
la empresa InvitrogenTM.
Los resultados obtenidos tanto en las líneas celulares como en cultivo primario al ser
transfectadas con el plásmido pGUL46 indican que la proteína tegumentaria VP11/12 de VHS-1,
posee una distribución subcelular que va desde una localización perinuclear, de tipo puntiforme
(células N2A y HT22) hasta una que se extiende a lo largo del citoplasma de acuerdo a la línea
celular, como por ejemplo, H4 y neuronas corticales (Figura 5). Esta localización subcelular
perinuclear responde al sitio de ensamblaje del virión durante una infección productiva por VHS1 (Kato et al., 2000), lo que sugiere que es capaz de migrar por sí sola a este sitio en ausencia de
otras proteínas virales de la cápside y del tegumento interno responsables de reclutar motores
microtubulares como dineína, dinactina, kinesina-1 y kinesina-2 para el transporte retrógrado y
anterógrado de la cápside viral (Radtke et al., 2010). No se ha detectado interacción directa entre
VP11/12 y estos motores microtubulares (Radtke et al., 2010) lo que sugiere que esta proteína
podría estar haciendo uso de otra ruta celular para alcanzar su ubicación, sin embargo, hasta la
56
fecha, aún no se han descrito posibles interacciones entre esta proteína tegumentaria y proteínas
celulares implicadas en el tráfico celular. En células VERO infectadas con VSH-1, su
localización también resultó ser perinuclear (Kato et al., 2000). Una posible explicación para esta
ubicación se apoya en el hecho de que se ha demostrado que VP11/12 colocaliza con la proteína
tegumentaria VP16 (Vittone et al., 2005) modulando su función en la expresión de los genes alfa
(inmediatamente tempranos) durante el ciclo replicativo del virus en el núcleo de la célula
huésped. Otra explicación posible se apoya en lo descubierto en oligodendrocitos, donde un virus
recombinante de VHS-1 en el que VP11/12 ha sido marcada con GFP, colocaliza con una
pequeña GTPasa denominada Rab27a en la red trans-Golgi (TGN). Esta GTPasa no sólo
colocaliza con VP11/12 en el TGN sino que con glicoproteínas virales como gH y gD (BelloMorales et al., 2012). Continuando con esta idea, en cultivos de células VERO infectadas con un
virión recombinante de VHS-1 que expresa VP11/12-GFP, se observó una distribución
citoplasmática con presencia de concentraciones en la región perinuclear (Willard, 2002). En
células tipo-fibroblasto COS7, la distribución de esta proteína también resultó ser principalmente
citoplasmática (Xing et al., 2011). Esto último también fue observado en células VERO
infectadas con un virión recombinante VHS-1 VP11/12-GFP, en donde además se observó
asociación a membranas independiente de la presencia de otras proteínas virales y la cápside
(Murphy et al., 2008). Estos resultados sugieren que esta proteína tendría una localización
citoplasmática, sin descartar su presencia en la región perinuclear. No se debe excluir el hecho de
que todos estos resultados fueron obtenidos en líneas celulares epiteliales. Lo descrito en el
presente trabajo de tesis, sin embargo, corresponde a células de origen neuronal.
La importancia de estudiar ésta y otras proteínas del tegumento reside en el hecho de que son
alrededor de 23 proteínas, cuyas funciones no se encuentran plenamente esclarecidas. Son
57
liberadas al citoplasma luego de que ha ocurrido la fusión de la envoltura viral con la membrana
plasmática de la célula a infectar, algunas de ellas median el transporte de la cápside al núcleo
celular y de regreso a la membrana celular a través de uniones a motores de dineína y kinesina.
Las proteínas más abundantes del tegumento son VP11/12, VP13/14, VP16 y VP22, presentes
con 1000-2000 copias (Kelly et al., 2009) y sus funciones incluyen: regulación de la
transcripción dependiente de VP16, transcripción viral y ensamblaje de microtúbulos (Kelly et
al., 2009). Sin embargo, ya sea la deleción del gen de una de estas proteínas o de todas, no tiene
efectos en el ciclo replicativo del virus (Kelly et al., 2009) lo que sugiere la existencia
mecanismos compensatorios por parte del virus, en el que dos o más proteínas cumplen la misma
función, de manera de continuar con el proceso infeccioso. Con respecto a VP11/12, se ha
descubierto recientemente que además de su conocida asociación a VP16, también estaría
interaccionando con la proteína tegumentaria Us3 y la gliproteína viral gM (Lee et al, 2008).
Estas interacciones demuestran el amplio rango de acción de las proteínas de tegumento y
resaltan la necesidad creciente de caracterizar sus roles en un proceso infectivo.
Uno de los organelos celulares utilizados por el virus durante el ciclo replicativo para la
maduración y egreso de los viriones es el aparato de Golgi. Este es uno de los organelos centrales
en la vía secretoria. Desempeña un papel bien establecido como estación de procesamiento y
clasificación en el transporte de proteínas de carga solubles y transmembrana a sus destinos
finales (Wilson et al., 2012).
Está dispuesto como una pila de estructuras de membranas
aplanadas (cisternas) ordenadas y puede ser esquemáticamente dividido en tres grandes
compartimentos: cis, medial y trans Golgi. Si bien su función principal está dada por la
destinación de proteínas provenientes de la vía secretoria, no es la única que posee. Un número
cada vez mayor de proteínas han mostrado localizarse en este organelo, lo que sugiere que estaría
58
involucrado en diversos procesos celulares, como señalización y apoptosis (Hicks et al., 2005).
Una de las proteínas de matriz más importantes del AG es Giantin, se encuentra en la cara cis y
tiene un peso aproximado de 400 kDa (Linstedt et al., 1993). Contiene dominios de unión
específicos para p115, otra proteína de este complejo, lo cual le permite mantener la estructura
compacta de este organelo en forma de cisternas aplanadas sin fusión de las pilas y regular el
tráfico de proteínas cargo en la vía secretoria (Lesa et al., 2000). Otra de las proteínas
importantes en este organelo es GM130, es una proteína periférica de membrana unida
fuertemente a la membrana del AG. Junto a p115, Giantin y GRASP65, facilita la fusión de
vesículas a la membrana del Golgi como un factor de unión vesicular. Está involucrada en la
mantención de la estructura del AG y desempeña un rol importante en el ensamblaje y desensamblaje durante la mitosis. Existe evidencia emergente que sugiere que estaría involucrada en
el control de la glicosilación, la progresión del ciclo celular y funciones de orden superior en las
células como la polarización celular y la dirección de la migración celular (Nobuhiro et al.,
2010).
La fragmentación de este organelo es un fenómeno fisiológico durante la mitosis. El AG se
fragmenta reversiblemente en vesículas y túbulos que se distribuyen equitativamente en las dos
células hijas durante la citoquinesis (Fan et al., 2008). Sin embargo, durante la apoptosis la
fragmentación es de carácter irreversible e involucra la participación de varias caspasas
responsables del clivaje de proteínas de la matriz del AG como Giantin (Fan et al., 2008).
Además de estos fenómenos fisiológicos, el uso de compuestos farmacológicos produce la
fragmentación del AG. Entre estos compuestos se encuentra Brefeldina A, que produce el
desensamble del AG en túbulos, que contienen proteínas residentes del AG, y se fusionan con el
retículo endoplásmico (RE), presentando una distribución puntiforme (Klausner et al., 1992).
59
El VHS-1 hace uso de parte de la vía secretoria para su propio beneficio, es así como además del
procesamiento de glicoproteínas virales, la cápside y el tegumento viral utilizan la red transGolgi (TGN) para la adquisición de su envoltura, produciendo la reorganización del AG y el
TGN de tal manera que los marcadores de Golgi se distribuyen de manera más uniforme por todo
el citoplasma y los marcadores de TGN aparecen en la membrana plasmática (Johnson & Baines,
2011). Los primeros registros del efecto de una infección viral por VHS-1 en el AG datan de
1993, en los que se detectó la fragmentación y dispersión de proteínas del Golgi, así como
también la redistribución de glicoproteínas y glicolípidos procesados a través del AG luego de
una infección (Campadelli et al., 1993). En estos estudios células HEp-2 y VERO fueron
infectadas con VHS-1 y se analizó la distribución de dos proteínas residentes del AG. A través de
observaciones por microscopía electrónica y fluorescencia, se determinó que las proteínas
residentes mostraban una asociación con pequeñas y numerosas estructuras dispersas en el
citoplasma. Esta fragmentación presentó un patrón morfológico distinto al observado en células
tratadas con Brefeldina A y mostró ser un evento tardío en el ciclo replicativo del virus,
coincidiendo con las fases de ensamblaje del virión y exocitosis (Campadelli et al., 1993).
Siguiendo esta misma línea de investigación, en 1995 se elucidó el rol de los microtúbulos y el
AG en la exocitosis de los viriones. Los resultados obtenidos mostraron que los microtúbulos
experimentaron fragmentación en la periferia celular para luego reorganizarse en bultos en las
cercanías del núcleo (Avitabile et al., 1995). Concluyeron que la fragmentación de los
microtúbulos no es suficiente para la fragmentación del AG. Al tratar las líneas infectadas con
Nocodazol observaron la fragmentación y distribución del AG y un incremento en la
depolimerización de los microtúbulos en células VERO y HEp-2 (Avitabile et al., 1995). La
administración de Taxol, impidió la depolimerización de los microtúbulos y la fragmentación del
60
AG, pero no tuvo efecto en la exocitosis viral. Este proceso resultó ser independiente de la
fragmentación del AG y de la integridad de los microtúbulos, lo que sugiere que el virus ha
desarrollado una vía exocítica alterna.
Una vez definida la distribución subcelular de esta proteína tegumentaria, se evaluó el efecto de
su expresión en la distribución y morfología de la proteína de la matriz del aparato de Golgi
denominada Giantin. Durante la mitosis celular, el aparato de Golgi se des-ensambla temprano en
profase y se re-ensambla durante la telofase (Gonatas et al., 2006). Debido a esta variante, fue
necesario sincronizar los cultivos celulares en la fase G0/G1 del ciclo celular que corresponde al
período de interfase, previo a la mitosis. Para este efecto los cultivos fueron sometidos a
deprivación de suero (2% SFB) durante 48 horas, según protocolo de Bruner et al, 2010 donde se
señala que durante este período, existe una reducción en los niveles de los factores de crecimiento
y citoquinas, hormonas, vitaminas, carbohidratos, ácidos grasos y lípidos, proteínas de transporte
y séricas, presentes en el suero. Estas variaciones en el ambiente extracelular son detectadas por
las células, las cuales entran en un período de reposo dentro del ciclo celular, con el fin de
minimizar el uso de nutrientes.
Estando sincronizados los cultivos, éstos fueron transfectados con el plásmido y luego se evaluó
el efecto de la expresión de esta proteína viral en la expresión y distribución de la proteína
Giantin. Tanto en líneas celulares como en neuronas corticales sin transfectar, esta proteína
presentó una distribución perinuclear con forma de media luna, lo cual guarda relación con la
localización subcelular del AG (Brownhill et al., 2009). Al expresar VP11/12 se observó un
cambio en la distribución y morfología de Giantin. Salvo en células H4 donde hubo una leve
61
variación en la distribución de la proteína con respecto al control, las demás líneas neuronales y
neuronas corticales, presentaron una redistribución de la marca del anticuerpo; cabe destacar que
las células H4 corresponden a una línea inmortalizada de origen glial mientras que las demás
líneas neuronales y cultivo primario poseen un origen neuronal. En la caracterización fenotípica
se observó un aumento en el porcentaje de células expresando un fenotipo alterado para Giantin
de alrededor de un 45-50%, donde las diferencias más significativas se obtuvieron en células
N2A, H22 y neuronas corticales (ver figura 11). El fenotipo alterado estuvo caracterizado por la
fragmentación de la marca del anticuerpo y redistribución a lo largo de la región perinuclear y
citoplasma. Es posible observar, en menor medida, un porcentaje de células control que también
presentan un fenotipo alterado que no sobrepasa el 10%. Explicaciones posibles para este
fenómeno son los procesos fisiológicos y patológicos propios de la célula, como mitosis y
apoptosis. Si bien los cultivos fueron sincronizados para evitar que las células entren en mitosis,
no es posible afirmar que la totalidad del cultivo se encuentre en interfase. Para determinar si el
porcentaje de fenotipo alterado observado en las células control corresponde a células en
procesos apopóticos sería necesario detectar la presencia de marcadores de apoptosis tal como
caspasa-3. Finalmente, los valores observados pueden atribuirse a características propias del
cultivo celular, donde es posible la existencia de una población heterogénea de células, con una
morfología del aparato de Golgi que no siempre es completamente perinuclear y contínuo.Los
resultados obtenidos en las líneas celulares y cultivo primario marcan un precedente en la
caracterización de la función de la proteína de tegumento VP11/12 en el aparato de Golgi
neuronal. Al realizar el ensayo de viabilidad por inmunofluorescencia se obtuvo que a las 15
horas post-transfección, la viabilidad celular de los cultivos transfectados disminuye a alrededor
de un 45%, lo que sugiere que las diferencias observadas en el fenotipo de Giantin podrían
62
atribuirse a procesos apopóticos, pues existe evidencia de que esta proteína es clivada por
caspasas durante muerte celular por apoptosis. VP11/12-GFP podría estar gatillando este
fenómeno debido a que su localización coincide con los pools de caspasa-2 observados en la
región del TGN, para esclarecer este punto sería adecuado determinar si existe interacción directa
entre ambas proteínas, ya sea durante transfección o infección productiva por VHS-1. Se ha
observado que en infección productiva en linfocitos y células T, VP11/12 es fosforilada y a su
vez fosforila a quinasas de la familia Src, como Lck (Wagner et al., 2009). La activación de Src
por fosforilación induce a su vez la vesiculación dramática de cisternas en distintos tipos
celulares, contribuyendo a la desregulación de la integridad del AG (Weller et al., 2010).
Resultados sin publicar de nuestro laboratorio han demostrado que durante infección neuronal
productiva por VHS-1, se fosforila y activa la quinasa Src. Se puede inferir que esta activación
podría estar mediada por VP11/12. Para comprobar esta afirmación es necesario determinar si
durante la expresión de esta proteína existe fosforilación de Src. Otra de las posibles
explicaciones para el fenómeno observado podría atribuirse a modificaciones a nivel del
citoesqueleto neuronal por esta proteína viral. Una de las principales proteínas asociadas a
integridad neuronal es Tau. Se asocia a los microtúbulos y se encuentra enriquecida en
membranas del AG y RE (Fan et al., 2008). En enfermedades neurodegenerativas como
Alzheimer, degeneración corticobasal y demencia, Tau sufre hiperfosforilación y acumulación en
compartimentos somatodendríticos (Fan et al., 2008). Existe evidencia de que el estado de
fosforilación de Tau está involucrado en la mantención de la organización del AG neuronal. La
sobre-expresión de una isoforma de Tau humana en cultivo primario de astrocitos mostró una
disminución de los microtúbulos estables, lo cual resultó en la fragmentación del AG (Yoshiyama
et al., 2003). Estas evidencias sugieren que Tau, indirectamente, a través de su asociación a
63
microtúbulos, tendría un efecto en la integridad del AG. Trabajos realizados por nuestro
laboratorio han demostrado que la infección por VHS-1 en cultivo primario de neuronas resulta
en daño y muerte neuronal. En este modelo, las neuronas manifestaron alteraciones en la
dinámica microtubular e hiperfosforilación de Tau (Zambrano et al., 2008). Toda esta
información sugiere que el VHS-1 tendría un posible efecto en la dinámica del AG de manera
indirecta a través de la desregulación de la dinámica microtubular y modificaciones de Tau. Es
posible considerar la opción de que los cambios en la distribución de Giantin observados en
cultivos neuronales al expresar VP11/12 sean resultado de modificaciones a nivel de Tau. Para
validar esta opción es necesario expresar VP11/12 y evaluar los cambios en los patrones de
fosforilación de Tau, lo cual podría entregar más luces acerca del efecto de esta proteína viral en
un proceso infeccioso por VHS-1.
Los resultados obtenidos al expresar esta proteína tegumentaria sobre la distribución del AG se
observan de igual modo al realizar una infección productiva con el virión completo. Esta
observación reafirma la hipótesis de que VP11/12 podría estar involucrada en la alteración del
AG observada durante un proceso infeccioso. En ambas cinéticas de infección, tanto para Giantin
como para GM130, la alteración de la distribución comienza a partir de las 4 hpi, siendo a las 8
hpi cuando se observa un fenotipo más alterado y una reducción en la inmunodetección de ambas
proteínas. En la transfección con VP11/12 estos cambios se evalúan a tiempos más tardíos (15-18
horas post-transfección) por lo que se desconoce lo que puede inducir a tiempos más cortos de
transfección. Establecer una cinética de transfección sería útil para dilucidar otras posibles
funciones de VP11/12 durante infección neuronal. Con respecto a la caracterización de la
infección, la infectividad se evaluó cuantificando el número de células que fueron positivas para
el marcador de infección viral ICP8, proteína viral de unión a ADN de hebra simple, esencial
64
durante el proceso de replicación viral (Tolung et al., 2013), mientras que la viabilidad se midió
contabilizando el número de células mostrando la tinción nuclear de DAPI. Los resultados
obtenidos revelaron que a medida que progresa la infección aumenta el número de células que
expresan ICP8 en su interior y disminuye el número de células vivas, representadas por la tinción
con DAPI. Para efectos del análisis fenotípico, se utilizó un anticuerpo específico contra Giantin
como marcador del AG durante infección productiva neuronal y se clasificó su patrón de
expresión en dos categorías: normal y alterado. De acuerdo a esta clasificación, durante infección
por VHS-1 aumenta el porcentaje de células con un AG alterado alcanzando un nivel máximo a
las 8 hpi, para posteriormente disminuir hasta alcanzar niveles cercanos al 20% a las 24 hpi. Los
resultados obtenidos presentan evidencia de la participación de una infección por VHS-1 sobre la
estructura del AG neuronal, y se establecen como un precedente para futuras investigaciones. Al
tratarse del virión completo no es posible atribuir este fenotipo a una proteína en particular, sino
que al conjunto de ellas, puesto que se ha observado que poseen funciones similares como un
mecanismo compensatorio durante una infección. Es posible que el virus al utilizar parte de la vía
secretoria celular durante su egreso, esté gatillando vías de señalización responsables de
interrumpir el proceso infeccioso a través de la redistribución y fragmentación de un organelo
celular tan importante como el AG. Sin embargo, esta alteración del AG es revertida en tiempos
tardíos de infección, quizás gatillado por el virus para preservar la célula durante todo el proceso
de replicación viral.
65
6. CONCLUSIÓN
Al expresar la proteína del tegumento de VHS-1 VP11/12 en cultivos neuronales se observa un
cambio en la distribución de la proteína de la matriz del aparato de Golgi Giantin, análogo a lo
observado durante horas tempranas durante una infección neuronal con VHS-1.
66
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71
8. ANEXOS
Figura 16. Placa de agar-LB con ampicilina (100 mg/mL) que contiene colonias de E. coli
transformadas con el plásmido pGUL46. Posterior a la transformación, se tomó una alícuota de
medio LB con ampicilina que contenía el plásmido y se sembró en una placa de agar-LB durante
24 horas a 37°C. Los puntos blancos representan las colonias bacterianas que han incorporado el
plásmido y que presentan por tanto resistencia a ampicilina.
72
Para analizar la distribución subcelular de esta proteína se realizaron experimentos de
transfección en diferentes líneas celulares. Al ser una técnica nueva dentro del laboratorio fue
necesario estandarizar las condiciones de transfección. Para ello se comparó la eficiencia de
transfección de dos reactivos disponibles en el mercado: Lipofectamina 2000 y Fugene HD.
Siguiendo las indicaciones de cada fabricante, se transfectaron células N2A durante 24 horas.
Transcurrido el tiempo necesario se realizó una microscopía de fluorescencia y se calculó el % de
eficiencia de transfección obtenido con ambos reactivos como se muestra en la Figura 17. Los
resultados obtenidos a partir de este experimento nos permitieron seleccionar a Lipofectamina
2000 como nuestro reactivo de transfección pues la eficiencia con este producto alcanzó un 10%,
lo cual contrasta con la nula transfección obtenida con el otro reactivo.
73
Figura 17. Transfección transiente de células N2A con el plásmido pGUL46 utilizando
Lipofectamina 2000 y Fugene HD. A) Immunofluorescencia de células transfectadas con
Lipofectamina 2000 (columna L) y Fugene HD (columna F). Las células fueron transfectadas de
acuerdo a los protocolos de los fabricantes. Luego de 24 horas post-transfección se realizó una
microscopía de fluorescencia para la detección de la proteína viral y la tinción de los núcleos
(DAPI). Imágenes a 63X. B) Cálculo de eficiencia de transfección. Para ello se fotografiaron 5
campos de cada ensayo y se hizo conteo de células totales (teñidas con DAPI) y células
transfectadas (células expresando VP11/2-GFP). El experimento fue realizado en triplicado y los
resultados obtenidos fueron graficados con el programa GraphPad Prism 5.
74
CONTROLES DE TRANSFECCIÓN
Una vez caracterizada la localización subcelular y el porcentaje de eficiencia de transfección de
la proteína VP11/12-GFP en las líneas celulares y neuronas corticales, se realizaron controles de
transfección, para descartar mal interpretación de los resultados. Para ello se realizaron
transfecciones en células HT22 (Figuras 18, 19 y 20), cambiando distintas variables, el detalle del
experimento se encuentra en las figuras a continuación. Los resultados obtenidos nos permiten
afirmar que el efecto obtenido al expresar VP11/12-GFP sobre la proteína Giantin, corresponde a
efecto directo de esta proteína viral y no representan un artilugio de la técnica ni de los reactivos
utilizados durante la transfección. En la figura 19 se evaluó el efecto del plásmido que contiene el
ORF de GFP (GFP-N1), el plásmido donde se clonó nuestra proteína viral (pcDNA3.1), el
plásmido sin GFP (pUL46) y con GFP (pGUL46) sobre la distribución de Giantin. Los resultados
obtenidos a partir de este experimento permiten confirmar que la alteración en la distribución de
esta proteína del AG corresponde a la expresión de esta proteína viral y no al material foráneo
incorporado, como un plásmido vacío (pcDNA3.1).
75
A
B
C
Figura 18. Controles de transfección transiente en células HT22. Células HT22 fueron
transfectadas A) control sin transfectar B) sin Lipofectamina 2000 C) con el plásmido GFPN1 D) sin el ADN plasmidial pGUL46; durante 18 horas. Pasado el tiempo de transfección
se realizó una IF directa contra la proteína viral mientras que los núcleos fueron teñidos con
DAPI. Las imágenes fueron tomadas en aumento 63X.
D
76
A
Figura 19.
B
C
Controles de transfección transiente en células HT22 (continuación).
A
B
C
Células HT22 fueron transfectadas A) sólo Optimem B) el plásmido pUL46 que expresa la
proteína viral VP11/12 C) con el plásmido pGUL46; durante 18 horas. Pasado el tiempo de
transfección se realizó una IF directa contra la proteína viral mientras que los núcleos fueron
teñidos con DAPI. Las imágenes fueron tomadas en aumento 63X.
77
Figura 20. Distribución de Giantin en controles de transfección transiente en células HT22.
Células HT22 fueron transfectadas A) control sin transfectar B) con el plásmido GFP-N (codifica
para GFP) C) con el plásmido pcDNA3.1 vacío D) sólo Optimem E) con el plásmido pUL46
(codifica para VP11/12) F) con el plásmido pGUL46 (codifica para VP11/12 acoplada a GFP).;
durante 18 horas. Transcurrido el tiempo de transfección se realizó una IFI con un anticuerpo
específico para Giantin, los núcleos fueron teñidos con DAPI. Las imágenes fueron tomadas en
aumento 63X.