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V Congreso Internacional de Ingeniería Bioquímica
XVI Congreso Nacional de Ingeniería Bioquímica
VI Jornadas Científicas de Biomedicina y
Biotecnología Molecular
Clave: (354042)
Fecha: (1/27/2008)
DISEÑO DE UNA PCR-DGGE PARA EL DIAGNOSTICO DIFERENCIAL DE
ENTAMOEBA HISTOLYTICA Y ENTAMOEBA DISPAR USANDO EL GEN
adh112
Martínez-López M.C; López-López P; Boldo-León X.M., Brindis Fuentes E.M., Estrella Gómez R.
Av. Mendez 2838-A colonia TamulteCP.86150 Tel 01993 3581500 ext 6313
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Recientemente la OMS determinó que no se debe dar tratamiento a todos los pacientes
portadores y asintomático de amibiasis porque más del 70% de los casos de amibaisis intestinal
son ocasionados por Entamoeba dispar (no patógena) y 30% por Entamoeba histolytica (patógena)
y no deben ser sometidos a riesgos innecesarios. El gen adh112 codifica para una adhesina de
257 aa en la membrana de ambas especies, la secuencia de 2040 nucleotidos tienen una
homología del 96%.Objetivo hacer una PCR-DGG para diagnostico diferencial de ambas
especies usando el gen adh112. Metodología, se purifico DNA de heces de pacientes con
amibaisis intestinal y se usó una doble PCR técnica in vitro sencilla, sensible y relativamente rápida
para la amplificación directa de fragmento de DNA. La electroforesis
por gradiente de
desnaturalización (DGGE), detecta pequeñas diferencias de reacción de fusión de fragmentos de
DNA (200-1000 pb) que difieren hasta por una base, cuando los fragmentos sujetan su fusión
parcial a un ambiente donde se incrementa la desnaturalización física (calor + formamida + urea)
se comporta como un zipper, cambiando la forma física. De tal forma que migran más lentamente
durante la electroforesis que los que mantiene completa la doble hebra. Como control usamos la
amplificación y digestión enzimatica (Dra1 y Sau) del rDNA de ambas especies. Resultados por
BLAST obtuvimos las secuencias AF127375.0 del gen adh112 de E histolytica y otra
AANV010002298 de E. dispar, se tomo un fragmento de 223 pb con 7 diferencias de nucleótidos.
Los iniciadores son: F.- 5’ GCA GAA AAA AAT AAT AAT AAC y R.- 3’; TGA AAG TAA AAC AAA
TGA A 3’, mas una cola de CG de 80 pb dando un producto de 302 pb .La Tm fue de 47oC. Los
productos de PCR fueron corridos por DGGE (acrilamida 10% con gradiente de desnaturalización
de 10-30 % (Formamida .4-1.2 M, Urea .7-2.1 M). Conclusión, hemos diseñado una PCR-DGGEadh112, que permite el diagnostico diferencial entre especies sin necesidad de cultivo y digestión
enzimática.
Palabras clave: DGGE, E.histolytica, E.dispar
Área: Biomedicina y salud
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