Download Identificación de genes catabólicos

Aplicación
p
de técnicas moleculares para
p
el estudio de la biodegradación de
hidrocarburos
Presenta: M. en B. Olivia Tzintzun Camacho
Laboratorio de Residuos Sólidos
W-108 y W-103
INTRODUCCIÓN
Ó
Sitios contaminados por petróleo
Técnicas de remediación de suelos
Técnicas tradicionales o
establecidas
Técnicas innovadoras
Incineración
Extracción de vapores del suelo
Mezclar enterrar y cubrir
Mezclar,
Aspersión de aire
Dispersión sobre el terreno
Desorción térmica
Solidificación
Deshalogenación química
Reuso y Reciclado
Enjuague del suelo in situ
Extracción con solvente
-Bajo
Bajo costo
-Degradación del
contaminante
Lavado del suelo
Medidas Fitocorrectivas
Biorremediación
-No
No perjudica las
propiedades del
suelo1
1. Rahman et al., 2002
Biorremediación
Uso de consorcios
microbianos para
p
la remediación
Consorcios
Biodegradación de hidrocarburos
La degradación de hidrocarburos puede darse por:
Cultivos puros
Cultivos mixtos
Biodegradación de hidrocarburos
La degradación de hidrocarburos puede darse por:
Efectos sinérgicos entre las
poblaciones
(M k d ett al.,
(Mukred
al.
l , 2008)
La cooperación entre las
actividades metabólicas de las
poblaciones
(Wang et al.,
al., 2006)
Cultivos mixtos
Degradación por cultivos mixtos
La capacidad de degradación de un consorcio microbiano depende
Asociaciones poblacionales que se establecen
Los mecanismos
pueden ser complejos
Capacidad
metabólica de cada
una de las cepas
¿ De dónde se
g
compuestos
p
Degradar
Remover metabolitos
obtienen
bti
llos
oxidados parcialmente
producidos por otras
microorganismos ?
poblaciones
(Ghazali et al., 2004).
Aislamiento de microorganismos
g
degradadores
Pantano contaminado en
Veracruz
Identificación de microorganismos
degradadores
Electroforesis en Gel con Gradiente de Desnaturalización
(DGGE)
Técnica de huella, rastreo o
t
trazado
d molecular
l
l (molecular
( l
l
fingerprinting )
Identificación de microorganismos
degradadores
Procedimiento para DGGE
1. Extracción de DNA
Lisis celular
(SDS)
Digestión con
(RNAasa)
Lavado del
DNA (etanol)
Hidratación
Hid
t ió
del DNA
(Buffer TE)
Precipitación
de proteínas
Recuperación
d DNA
de
(isopropanol)
Identificación de microorganismos
degradadores
Procedimiento para DGGE
2. Amplificación de la región variable V6-V8 del gen 16SrDNA por
PCR
Identificación de microorganismos
degradadores
Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR)
DNA molde
dNTPs
MgCl2
Taq polimerasa
Primers
Buffer
Identificación de microorganismos
degradadores
3. Visualización de los productos de la región variable V6-V8 del
gen 16SrDNA por PCR
PCR región
ió V6
V6- V8
16SrDNA
1
470
pb
2
3
4
5
Identificación de microorganismos
degradadores
4. Preparación del gen de poliacrilamida y desarrollo del DGGE
Agentes
desnaturalizantes: urea
y formamida
44%
54%
Identificación de microorganismos
degradadores
4. Preparación del gen de poliacrilamida y desarrollo del DGGE
Muyzer et al., 1996
Identificación de genes catabólicos
gen alk
alkB
B
Pseudomonas oleovorans:
Peters J, Witholt B. Biochim Biophys
Acta (1994) 1196(2): 145-53.
β-Oxidación
(Whyte et al.,
al., 2002)
Identificación de genes catabólicos
El plásmido OCT
de Pseudomona
oleovorans
contiene
dos
operones
alkBFGHJKL
y
alkST.
¿Qué se hace
experimentalmente?
(van Beilen et al., 1994)
Identificación de genes catabólicos
Etapa
°C
Tiempo
Ciclos
Desnaturalización
inicial
94°C
1 min
1
Desnaturalización
94°C
1 min
Alineamiento
50°C
1 min
Extensión
72°C
2 min
Extensión final
72°C
10 min
30
1
Identificación de genes catabólicos
Identificación de genes catabólicos
S
Secuenciación
i ió
Identificación de genes catabólicos
S
Secuenciación
i ió
Identificación de genes catabólicos
S
Secuenciación
i ió
Uso de herramientas moleculares para
estudiar la biodegradación de hidrocarburos
9Identificar cepas bacterianas
(
(DGGE)
)
9Dinámica de las poblaciones
durante la degradación de
hidrocarburos.
9Identificación
de
catabólicos (PCR)
genes
9Expresión de los
catabólicos (PCR-TR)
genes
Díaz-Ramírez et al., 2008
Uso de herramientas moleculares para
estudiar la biodegradación de hidrocarburos
9Expresión de los
catabólicos (PCR-TR)
Powell et al., 2006
genes
Grupo de trabajo del Laboratorio de Residuos Sólidos