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ANALISIS DE MUTACIONES DEL GEN CFTR MEDIANTE SECUENCIACION DE PRÓXIMA GENERACION (NGS) Granados P.1; Lubovich S.2; Fernández M.1; Rodriguez V. 2; Repetto L.; Zaragoza S.2; Luna M. C.1; Teper A.2; Marques J.M.3 1. Centro Nacional de Genética Médica “Dr. Eduardo Castilla”. ANLIS Bs. As. Argentina 2. Hospital de Niños “Dr. Ricardo Gutierrez” Bs. As. Argentina 3. Laboratorio GeniaGeo. Biotecplaza-Zonamérica, Uruguay Introducción El diagnóstico de fibrosis quística (FQ) combina características clínicas, test de sudor y estudios moleculares. Además de la presentación clásica de la enfermedad, ciertas mutaciones en CFTR causan trastornos relacionados a CFTR (CFTR-RD), como ausencia bilateral congénita de conductos deferentes (CBAVD), pancreatitis crónica y bronquiectasias. Se han descrito más de 1900 mutaciones en bibliografía, con variaciones en las distintas poblaciones, siendo mayoritaria siempre la delF508. Los reportes indican gran heterogeneidad alélica, incluyendo variantes de nucleótido único (SNVs), inserciones y deleciones cortas (InDels) y grandes variantes estructurales o grandes rearreglos (SVS). El estudio de mutaciones frecuentes del gen CFTR basado en test diagnósticos presentes en el mercado tiene una tasa de detección que depende de las mutaciones incluidas en dichos test y de la heterogeneidad de la población en estudio, pero por lo general no son capaces de caracterizar molecularmente todos los enfermos de FQ. Esto hace que la FQ y los CFTR-RD requieran en muchos casos la secuenciación completa del gen CFTR, para ello la técnica más recomendada por su exactitud, sensibilidad y velocidad de procesamientos es la secuenciación masiva. Objetivo El objetivo de este trabajo fue evaluar la secuenciación de próxima generación (NGS) para su aplicación en el diagnostico molecular de la FQ y las CFTR-RD. Resultados Paciente Motivo del estudio 1 Fibrosis quística M3120+1 G→A/pQ1100P Resultado 2 Fibrosis quística ∆F508/1811+1,6 Kb. A→G 3 Fibrosis quística ∆F508/3849+10 Kb. C→T 4 Fibrosis quística 1811+1,6 Kb. A→G/ no identificada 6 Fibrosis quística S4X/5T I601F/Q685 9 Fibrosis quística 11 Fibrosis quística ∆F508/W1282X 13 Fibrosis quística ∆F508/3849+10 Kb. C→T 14 Fibrosis quística ∆F508/W1282G Pacientes diagnosticados por test del sudor patológico y clínica compatible Paciente Motivo del estudio Resultado 5 Test del sudor dudoso, TIR Normal, 1 primo C8G→C/ no encontrada FQ (polimorfismo benigno) 7 Rinitis, hermano fallecido FQ, test del sudor dudoso/patológico S549R/L997F 8 Test del sudor dudoso, síntomas respiratorios leves, oligospermia. No identificada/no identificada 10 Test del sudor dudoso y sintomatología leve ∆F508/no identificada 12 Ausencia Bilateral de Conductos Deferentes 5T/5T, 11TG/11TG 15 Test del sudor dudoso, sintomatología leve p.E92K/del 22-24 Pacientes con Test de sudor dudoso con sintomatología leve. Materiales y Métodos Se seleccionaron 15 pacientes para este estudio. De éstos 9 eran FQ, a los cuáles se les había estudiado por otros métodos moleculares alternativos, que sirven para detectar mutaciones frecuentes, quedando algunos parcialmente genotipificados. Otros 6 pacientes presentaban sintomatología leve y test del sudor dudoso, a los cuales se deseaba caracterizar molecularmente. El procesamiento del ADN de estos 15 pacientes se realizó en el laboratorio Genia. El ADN recibido fue cuantificado por PCR en Tiempo Real. Se amplificaron las muestras mediante un Community Panel para CFTR diseñado con el software Ampliseq ™ para el gen CFTR. Se realizó la librería utilizando Ampliseq 2.0 kit, y se realizó la amplificación clonal y por último se secuenció mediante Post-LightTM Ion Semicondutor Sequencing (Next Generation Sequencing) en la plataforma Ion Personal Genome Machine ® System. Se realizó también la secuenciación por el método Sanger de la región del intrón 8 próxima al exón 9 con repetidos TG y un poli-T. Además en algunos casos donde se sospechó presencia de grandes deleciones por estudio del equilibrio entre amplicones del NGS, se confirmó mediante la técnica de MLPA. Regiones secuenciadas por NGS: La amplificación mediante la utilización de este pool de primers permite amplificar un 100 % de la secuencia codificante del gen CFTR y regiones intrónicas flanqueantes, además de 2 regiones intrónicas profundas de interés en búsqueda de mutaciones conocidas cómo causantes de FQ (1811+1.6kb A>G y 3849 + 10 kb C>T). En 8 pacientes de los 9 pacientes FQ se identificaron 2 mutaciones. De este grupo en 1 paciente se caracterizó una única mutación. Se describieron 7 variantes de muy baja frecuencia a nivel global, y en los casos que ya se conocían las mutaciones éstas se confirmaron. En el grupo Test del Sudor dudoso (30 y 60 mEq/l) con sintomatología leve, el paciente N°7 presentó una mutación FQ que también tiene su madre y una variante que está presente en su padre, el paciente Nº 15 presentó una mutación puntual y una gran deleción que fue confirmada por MLPA confirmándose el diagnóstico. En total se detectaron 10 variantes de muy baja frecuencia mundial, ninguna de las 10 variantes se hubieran detectado usando el panel de rutina . Debido a la heterogeneidad alélica y al desafío diagnóstico en los CFTR-RD es recomendable en este tipo de pacientes realizar secuenciación completa del gen CFTR. Conclusiones Este trabajo nos permite concluir que la secuenciación completa del gen CFTR por NGS es un enfoque preciso, rápido y rentable para el estudio molecular de la FQ y de los CFTR RD susceptible de ser aplicado a la rutina clínica complementando los métodos moleculares básicos. Planteamos, para la caracterización molecular de estos pacientes, un estudio en 2 fases: Análisis de mutaciones frecuentes seguido de la secuenciación completa del gen por tecnología de NGS. En los casos que amerite deberá realizarse estudios por MLPA.
