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Congreso de Estudiantes
Centro de Ciencias Genómicas
UNAM
Jueves 8 de febrero de 2007
Hora
10:00-10:30
Autor
José Luis Acosta Rodríguez
10:30-11:00
Luis F. Lozano Aguirre Beltrán
11:00-11:30
Víctor Manuel Serrano Solis
11:30-12:00
Santiago Castillo
12:00-12:30
Mildred Castellanos Escamilla
12:30-13:00
Edgardo Sepúlveda S.H.
13:00-13:30
Ramón Cervantes Rivera
13:30-14:00
América P. Rivera Urbalejo
Tema
Caracterización
de
Polimorfismos
Nucleotidicos
de Sitio Único SNP´s en
Poblaciones
Nativas
de
Rhizobium etli.
Evolución de Secuencias de
Inserción en Poblaciones de
Rhizobium
Consecuencias
de
la
Transferencia
Horizontal
Mediada por Bacteriófagos en
la
Microevolución
de
Rhizobium etli
Análisis de la congruencia
evolutiva
de
los
genes
ortólogos dentro del orden
Rhizobiales
La
Migración
de
los
Intermediarios de Holliday es
Importante para la Conversión
Génica en Rhizobium etli.
Regulación de la Transferencia
Conjugativa
del
Plásmido
Simbiótico de Rhizobium etli.
Elementos Requeridos para
Activar
el
Origen
de
Replicación de un plásmido
repABC
Análisis Genético y Molecular
del Papel de un Pequeño RNA
Antisentido, una Estructura
Tallo-Asa y un Oligopéptido en
la Regulación de la Traducción
de la Proteína de Inicio de la
Replicación de un Plasmido
repABC
Viernes 9 de febrero de 2007
Hora
10:00-10:30
Autor
Niurka Meneses Moreno
10:30-11:00
Andrés Andrade Domínguez
11:00-11:30
Cristina Landeta Escamilla
11:30-12:00
Ana Laura Ramos Vega
12:00-12:30
Napoleón González Silva
12:30-13:00
Oswaldo Valdés Lopéz
13:00-13:30
Bernardo Sachmann Ruiz
Tema
Estudio del Secretoma de
Rhizobium
etli
Utilizando
Proteómica
Análisis
Proteómico
y
Transcriptómico
de
la
Interacción
Saccharomyces
cereviseae-Rhizobium etli en
biofilms
Identificación
de
Genes
Cruciales para el Metabolismo
en el p42e de Rhizobium etli.
Caracterización de la Proteina
Acarreadora de Grupos Acilo
SMb20651 de Sinorhizobium
meliloti
Genes
de
Burkholderia
cenocepacia
J2315
Involucrados en la Biosíntesis
de Lipidos de Ornitina
Caracterización
de
las
Respuestas Fisiologicas y
Moleculares de Frijol Negro
Jamapa a la Deficiencia de
Fósforo y a la Toxicidad por
Manganeso
Ecología Molecular y Genética
de Poblaciones de Bacterias
Potencialmente Patogenas del
Río Apatlaco, Mor.
“Caracterización de polimorfismos nucleotídicos de sitio-único (SNPs) en
poblaciones nativas de Rhizobium etli”
Acosta J.,* Hernández I.,* Santamaría R.,* Fernández J.,* Bustos P.,* Fruns L.,**
Dávila G.,* González V.*
*Centro de Ciencias Genómicas, UNAM, Méx. **Instituto de Ecología, UNAM, Méx.
Estudios previos en Rhizobium etli se ha observado que la capacidad de nodulación,
se puede relacionar con la distribución geográfica y con la interacción con el anfitrión
(Phaseolus vulgaris), sugiriendo una coevolución,1 en tanto que la recombinación y
la migración tienen un efecto en el desequilibrio de ligamiento observado,2
generando una diferenciación genética inter e intra especies, y un flujo genético
restringido3. En contraste, poblaciones locales de Rhizobium etli, indican una
diferenciación genética menor lo cual sugiere un mayor intercambio genético4.
Existiendo una gran diversidad local pero no a gran escala5, 6. Lo cual sugiere que
etli, presentaría patrones diferentes de SNPs (son los cambios de nucleótidos que se
presentan en dos o mas secuencias homologas de ADN, debidos a mutaciones
como las transiciones o trasversiones7) en el cromosoma y los plasmidos, siendo
distribuidos por la recombinación entre replicones como en las poblaciones. La
caracterización y distribución de SNPs es de suma utilidad para cuantificar de
manera directa la variación genética en poblaciones 8. Como el caso del plásmido
simbiótico de R. etli donde se observo que los patrones de SNPs no se presentan al
azar, existen también regiones muy polimórficas y estas son compartidas entre
cepas, originadas tal vez por un proceso de recombinación 9.
Se comparo 8 cepas de Rhizobium etli de distinto origen geografico, CFN42
(México) CR652(Costa Rica), GR56(España), IE4771(México), KIM5(USA),
S20(España), CIAT894(Colombia) Y BRASIL5(Brasil). Secuenciadas 1X, excepto
CFN42 (completa) y CR652 (3x), para esto se diseño una metodología para
identificar SNPs en genomas con baja cobertura, presentándo una divergencia < 20
% entre las cepas, con respecto a CFN42, También se observo que aprox. < 30%
del genoma de cada cepa no es compartida con CFN42.
1.- Aguilar M. O., Riva O. and Peltzer. 2004. Analysis of Rhizobium etli and of its
symbiosis with wild Phaseolus vulgaris supports coevolution in centers of host
diversification. PNAS 101:13548-13553.
2.- Guttman. S. D. 1997. Recombination and clonality in natural populations of
Escherichia coli. Tree 12.
3.-Souza V., Nguyen T.T., Piñero D and Lenski R.E., 1992. Hierarchical analisis of
linkage disequilibrium in Rhizobium populations: Evidence for sex. PNAS 89:83898393.
4.- Silva C., Vinuesa P., Eguiarte L.E., Martinez E. and Souza V. 2002. Rhizobium
etli and Rhizobium gallicum Nodulate Common Bean (Phaseolus vulgaris ) in
Traditionally Managed Milpa Plot in Mexico: Population Genetics and Biogeographic
Implications. Applied and environmental microbiology. 69:884-893.
5- Vinuesa P., Silva C., Werner D., Martinez E., 2005 Population genetics and
phylogenetic inference in bacterial molecuar systematcs: the roles of migration and
recombination in Bradyrhizobium species cohesion and delineation. Molecular
Phylogenetics and Evolution , 34, 29-54.
6.-Young M., Park D., and Weir D. 2004 Diversity of 16S rDNA sequences of
Rhizobium spp. Implications for species determinations. Microbiology letters 238:125131.
7.- Brown T. A. 2002. Genomes. Editorial Wiley-liss. 2 ediccion. New York, USA.
8.- Silva C., Vinuesa P., Eguiarte L., Souza V., Martinez E., 2005 Evolutionary
genetics and biogeographics structure of Rhizobium gallicum sensu lato, a widely
distributed bacterial simbiont of diverse legumes Molecular Ecology 14, 4033-4050.
9.-Flores M., Morales L., Avila A., González V., Bustos P., García D., Mora Y., Guo
X., Collado J., Piñero D., Dávila G., Mora J. and Palacion R., 2005 Diversification of
DNA Sequences in the Symbiotic Genome of Rhizobium etli. American Society for
Microbiology 187:7185-7192.
EVOLUCIÓN DE SECUENCIAS DE INSERCIÓN
EN POBLACIONES DE Rhizobium etli
Lozano, L.1, Bustos, P. 1, Santamaría R. 1, Hernández, I. 1, Fernández, J. 1, Dávila, G.
1
, y González, V. 1
1
Laboratorio de Genómica Evolutiva. Centro de Ciencias Genómicas, UNAM.
Las rhizobias son un grupo extenso de bacterias del Orden Rhizobiales, capaces
de fijar nitrógeno y de formar nódulos en las raíces de distintas leguminosas.
Actualmente se conocen los genomas completos de 17 bacterias pertenecientes al
Orden Rhizobiales, entre ellas el de Rhizobium etli (1). El genoma de esta bacteria
consta de un cromosoma circular de ~4.4 Mbs y 6 plásmidos de 200 a 650 Kbs. El
análisis de los genomas de las rhizobias ha revelado que los plásmidos y las islas
simbióticas tienen gran cantidad de secuencias de inserción (ISs). Las ISs son
segmentos de ADN (<2.5 Kb) con una organización genética sencilla, ya que sólo
codifican para aquellas funciones relacionadas con su movilidad y tienen la
capacidad de insertarse en múltiples sitios del genoma (2). En el genoma de R. etli
hay 40 ISs, la mayoría distribuidas entre el cromosoma, el plásmido conjugativo y el
plásmido simbiótico (1). En el presente trabajo se muestran los avances del análisis
de las ISs en distintas poblaciones de R. etli, con la finalidad de conocer su dinámica
evolutiva y su efecto en la evolución genómica de esta bacteria. A diferencia de otros
trabajos (3), la aproximación experimental que hemos decidido adoptar, consiste en
evaluar inicialmente aquellas ISs que se encuentren en la misma localización
genómica en muchas cepas de distintas poblaciones. Para esto nos basamos en la
anotación del genoma de R. etli CFN42. Las ISs que se encuentren en la misma
localización, nos permitirán evaluar el papel de la selección en su prevalencia en
poblaciones naturales. Los datos necesarios para este proyecto se obtuvieron a
partir de la secuenciación parcial del genoma de 10 cepas de R. etli, y del análisis de
3 diferentes poblaciones de R. etli previamente analizadas, seleccionando 30 cepas
en cada una de las poblaciones.
A partir del genoma anotado de R. etli CFN42, se caracterizaron las ISs
completas en el cromosoma y plásmidos mediante comparaciones con el “IS
Database” y GenBank. Para cada ISs se diseñó un par de oligos en los genes
aledaños y se realizaron reacciones de PCR para identificar si las ISs de R. etli
CFN42 están en la misma localización en todas las cepas, y obtener un perfil de
ausencia/presencia de ISs. Por otro lado, se diseñaron oligos para 5 genes
“housekeeping”: argS, ruvB, dnaX, dnaB y glyA. Hasta el momento se han
seleccionado 3 ISs para secuenciarlas las cuales corresponden a ISs presentes en
el plásmido simbiótico y se encuentran bordeando la regíon simbiótica del mismo.
Resulta interesante encontrar que estas son las ISs que se hallan en mayor número
presentes en las poblaciones analizadas. Actualmente hemos obtenido secuencias
de 2 ISs (ISAs1 y IS5) para distintas cepas de todas las poblaciones y secuencias de
los genes housekeeping para las cepas de distinto origen geográfico. Al tiempo que
se vayan obteniendo las secuencias se van a estar realizando los experimentos de
Southern Blot para verificar si las ISs secuenciadas se encuentran en otra
localización en las cepas analizadas. Una vez que se tengan todas las secuencias
de las ISs y los genes “housekeeping” se realizará en análisis para determinar la
dinámica evolutiva(3) de las ISs, mediante la realización de filogenias de estas ISs y
se determinará el tipo de selección (neutral, positiva o purificadora) que actúa en
cada IS. Estos mismos análisis se realizaran en varios genes “housekeeping”
secuenciados de las cepas que tuvieron ISs para poder comparar ambos resultados.
1. González, V. et al. 2006. The partitioned Rhizobium etli genome: genetic and metabolic
redundancy in seven interacting replicons. PNAS 103(10):3834-3839.
2. Mahillon, J. and Chandler, M. 1998. Insertion sequences. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:725-774.
3. Kalia, A. et al. 2004. Evolutionary dinamics of insertion sequences in Helicobacter pylori. J.
Bacteriology. 186:7508-7520.
Consecuencias de la Transferencia Horizontal Mediada por Bacteriófagos en la
Diversificación y la Microevolución del Genoma de Rhizobium etli
Serrano-Solís V.M.1, Dávila J.G.1.
1
Laboratorio de Genómica Evolutiva, Centro de Ciencias Genómicas, UNAM,
Apartado Postal 565-5-A, Cuernavaca, México.,
Los bacteriófagos son virus que infectan bacterias. Son ubicuos en ambientes donde
existen bacterias (Mendum, 2001; Hendrix, 2003). Los bacteriófagos modifican la
ecología de las poblaciones bacterianas (Middelboe, 1996; Wommack, 2000),
transfieren genes por transducción (Ashelford et al, 1999) y aumentan biodiversidad
por la inserción de DNA (Freifelder y Meselson, 1970). Los profagos, que son los
genomas virales insertados en los genomas bacterianos, pueden constituir hasta el
20% del DNA bacteriano total, contribuyendo así, a la diversificación entre individuos
de la misma especie (Casjens, 2003). Se han aislado fagos que infectan a R.
leguminosarum (Mendum et al, 2000), a R. leguminosarum bv. trifolii, bv. viciae, bv.
phaseoli (Sharma, 2002; Dhar et al, 1993), Sinorhizobium meliloti (Werkin et al,
1988, 1989;) y Mesorhizobium loti (Turska-Szewczuk, 2000).
Nuestro modelo de estudio es la bacteria Rhizobium etli, simbionte de Phaseolus
vulgaris al fijar nitrógeno atmosférico en los nódulos radiculares. La secuencia
genómica total de Rhizobium etli cepa CFN42, constituida por un cromosoma y seis
plásmidos circulares (p42a, b, c, d, e y f), fue recientemente publicada (González et
al., 2006). El plásmido p42d (pSym) que contiene la mayoría de los genes
indispensables para la simbiosis (genes nod y fix) ha sido utilizado en estudios de
microevolución para entender las bases de la diversificación de las secuencias de
DNA (Flores et al., 2005; González et al., 2003).
La presencia de genes propios de bacteriófagos integrados en el genoma de R. etli,
muestra que es posible aislar tanto secuencias completas de bacteriófagos
específicos para R. etli, como secuencias virales relacionadas a R. etli para así,
poder explicar los procesos de recombinación por TH, tomando como vector
probable a los Bacteriófagos transductantes. A la fecha, no existe literatura
publicada, relacionada a la descripción de fagos específicos para R. etli.
Contrastando con esto, nosotros estamos caracterizando un Bacteriófago específico
para R. etli cepa CFN42 con lo cual demostramos que R. etli si es afectada por virus
y por tanto puede ser sujeto de transducción.
1. Ashelford KE, et al., 1999 In situ population dynamics of bacterial viruses in a
terrestrial environment. Appl Environ Microbiol; 65(1):169-74.
2. Casjens, S., (2003). Prophages and bacterial genomics: what have we learned so
far?. Molecular Microbiology. 49(2), 277-300.
3. Dhar, B., Upadhyay, K. K. and Singh, R. M. (1993) Isolation and characterization
of bacteriophages specific for Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli. Can. J.
Microbiol. 39: 775-779.
4. Flores, M., Morales, L., Avila, A., Gonzalez, V., Bustos, P., Garcia, D., Mora, Y.,
Guo, X., Collado-Vides, J., Pinero, D., Davila, G., Mora, J., Palacios, R., (2005)
Diversification of DNA sequences in the symbiotic genome of Rhizobium etli. J
Bacterial.187:7185-92.
5. Freifelder, D., and Meselson, M. (1970) Topological relationship of prophage
lambda to the bacterial chromosome in lysogenic cells. Proc Natl Acad Sci USA
65: 200–205.
6. Gonzalez V, Bustos P, Ramirez-Romero MA, Medrano-Soto A, Salgado H,
Hernandez-Gonzalez I, Hernandez-Celis JC, Quintero V, Moreno-Hagelsieb G,
Girard L, Rodriguez O, Flores M, Cevallos MA, Collado-Vides J, Romero D,
Davila G. (2003) The mosaic structure of the symbiotic plasmid of Rhizobium etli
CFN42 and its relation to other symbiotic genome compartments. Genome Biol.
4(6):R36.
7. Gonzalez V, Santamaria RI, Bustos P, Hernandez-Gonzalez I, Medrano-Soto A,
Moreno-Hagelsieb G, Janga SC, Ramirez MA, Jimenez-Jacinto V, Collado-Vides
J, Davila G. (2006). The partitioned Rhizobium etli genome: genetic and metabolic
redundancy in seven interacting replicons. Proc Natl Acad Sci U S A. 103;38343839.
8. Hendrix, R. W., (2003). Bacteriophage genomics. Current Opinion in
Microbiology. 6:506-511.
9. Mendum, T. A., Clark, I. M. and Hirsch, P. R. (2001) Characterization of two
novel Rhizobium leguminosarum bacteriophages from a field release site of
genetically-modified rhizobia. Antonie van Leeuwenhoek 79: 189–197.
10. Middelboe M, Jorgensen N, Kroer N. Effects of Viruses on Nutrient Turnover and
Growth Efficiency of Noninfected Marine Bacterioplankton. (1996) Appl Environ
Microbiol. 62:1991-1997
11. Sharma, R. S., Mohemmed, A. and Babu, C. R. (2002) Diversity among
rhizobiophages from rhizospheres of legumes inhabiting three ecological regions
on India. Soil Biol. Biochem. 34:965-973.
12. Turska-Szewczuk, A. Russa, R. 2000 A New Mesorhizobium Ioti HAMBI 1129
Phage Isolated from Polish Soil Current Microbiology 40; 341-343.
13. Werquin, H. W. Ackermann and R. C. Levesque. (1989). Characteristics and
comparative study of five Rhizobium meliloti bacteriophages. Current
Microbiology 18:307–311.
14. Wommack K. E., Colwell R. R., (2000) Virioplankton: vViruses in aquatic
ecosystems. Microbiol Mol Biol Rev. 69-114.
Análisis de la congruencia evolutiva de los genes ortólogos dentro del orden
Rhizobiales.
Santiago Castillo y Víctor González. Programa de Genómica Evolutiva, Centro de
Ciencias Genómicas, UNAM.
La estudios previos, tanto en alfaproteobacteria como en gamaproteobacteria, han
estudiado la congruencia de las historias evolutivas de familias de genes sin llegar a
resultados concluyentes (1,2,3,4). La idea central de este proyecto es determinar si
los ortólogos presentes en el orden Rhizobiales presentan una historia evolutiva
común. 631 grupos de ortólogos fueron identificados. Estos grupos de ortólogos
están enriquecidos en funciones que tienen que ver con metabolismo. Por otra parte,
no hay casi elementos de origen externo y cerca de un 12 % esta pobremente
clasificado. Por otra parte, 41 % de los grupos de ortólogos coocurren en las
unidades transcripcionales R. etli CFN42. Se construyero 631 filogenias con los 631
grupos de ortólogos. 317 topologías diferentes fueron encontradas entre las 631
filogenias; lo cual indica que no hay una solo historia evolutiva. Pero por otra parte,
el árbol consenso y la filogenia del megaalineaminto coinciden. Esta claro que el
parecido en las historias evolutivas de 631 grupos de ortólogos se diferencia de un
proceso aleatorio. Tanto el árbol consenso como las biparticiones de las 631
filogenias parecen indicar, que si bien no hay una sola historia, las historias
particulares de los grupos de ortólogos tienen muchos tramos en común. Por
ejemplo, para el árbol consenso la mayoría de sus nodos son apoyados por más de
la mitad de los grupos de ortólogos. Por otro lado, casi el 70% de las biparticiones
caen dentro del árbol consenso. Solo hubo 73 biparticiones diferentes, lo cual esta a
dos ordenes de magnitud del número de biparticiones diferentes para las filogenias
de arreglo aleatorio. Es decir, las filogenias se han circunscrito a pocos rutas y no
hay tantas como fuera posible. Cada filogenia difiere de otra en 4 biparticiones. Por
otra parte, el criterio de ortología aquí utilizado no parece que este pueda ser la
razón de la incongruencia. Puede que el error sistemático este actuando en este
conjunto de datos pero tanto el tipo de moléculas utilizadas, es decir; proteínas,
como el método de reconstrucción “maximum likelihood” son mas robustos frente a
este problema tanto que otras moléculas DNA y que otros métodos (3).
LA MIGRACIÓN DE LOS INTERMEDIARIOS DE HOLLIDAY ES IMPORTANTE PARA LA
CONVERSIÓN GÉNICA EN Rhizobium etli.
Castellanos M., Rodríguez C., Martínez J. y Romero D
Centro de Ciencias Genómicas, UNAM. Av. Universidad s/n. Col. Chamilpa, Cuernavaca,
Mor.
Tel: 01(777)3175867 Fax: (52)777 3175581 Correo electrónico: mcastel @ccg.unam.mx
La recombinación homóloga permite la transferencia recíproca de información
(recombinación) así como otro fenómeno conocido como conversión génica (CG), en
el cual existe una transferencia no recíproca de información. Secuencias homólogas
y más de 20 proteínas participan en la recombinación. Entre ellas se encuentran las
responsables de la migración de los intermediarios de Holliday (RuvAB, RecG y
RadA).
RuvB forma un anillo hexamérico con actividad de helicasa, que en conjunto
con RuvA (tetrámero que sirve como plataforma para la estructura de Holliday), es
como el motor que desenrolla al DNA, en una reacción dependiente de ATP.
Funciona alargando las regiones heteroduplex1. RecG puede mover al intermediario
de Holliday tanto lejos del punto de inicio de la recombinación (actividad
recombinogénica) como al contrario (actividad antirrecombinogénica). Dado que
ambas actividades, al menos in vitro, se presentan en magnitud similar, el efecto
neto es el de limitar la migración2. La evidencia de que RadA está involucrada en la
migración es genética, ya que una doble mutante recG ruvA muestra solamente una
deficiencia moderada en recombinación. Sin embargo, en una triple mutante recG
ruvA radA los niveles de recombinación decaen más drásticamente3.
En nuestro grupo, Santoyo G. analizó la frecuencia con que aparecía la CG
en la cepa silvestre de Rhizobium etli, utilizando un sistema de dos plásmidos que
poseen, cada uno, una copia del gen nifH. Una de estas copias fue modificada
insertándole sitios de restricción cada 100 pb aproximadamente, los cuales sirvieron
como marcadores para definir la longitud y anatomía de los eventos de conversión.
En este sistema la selección se hizo para cointegrados, los cuales fueron el
resultado de un entrecruzamiento que pudo estar o no asociado a CG. Usando la
misma estrategia, estamos analizando mutaciones en los genes responsables de la
migración de los intermediarios de Holliday (ruvAB, recG y radA) y cómo afectan a la
conversión 4.
Hasta ahora, hemos analizado 4 mutantes: radA, recG, ruvBrecG y ruvBradA.
En la doble mutante ruvBrecG (donde sólo se encuentra RadA en el sistema), hay
tractos de conversión más cortos que en la WT; más aún, muchos de los
cointegrados no están asociados a conversión. De modo contrario, en la mutante
radA la anatomía de los tractos de conversión se afecta ligeramente. En conjunto,
estos resultados nos indican que RadA y/u otras proteínas no participan en
conversión génica tan eficazmente como RuvAB y/o RecG.
En la mutante recG, hemos detectado tractos de conversión más largos que
en la cepa silvestre, por ello, suponemos que la actividad de recG es
antirrecombinogénica. Basándonos en esto, en la doble mutante ruvBradA (donde
sólo RecG está presente), debería haber tractos muy cortos. Ésto no fue así, ya que
los tractos en esta doble mutante fueron tan largos como en la silvestre. Esas
observaciones pueden explicarse
si suponemos que RuvAB es totalmente
recombinogénica y más efectiva y rápida que RecG, la cual, en contraste, posee
una actividad bidireccional. Además, tomando en cuenta los resultados de la
mutante recG, parece que ésta proteína representa un obstáculo para los sistemas
de reparación, así, cuando no está presente, dichos sistemas pueden actuar
libremente.
1. J. Bacteriol 181, 5543-5550 (1999); 2. Cell 75, 341–350 (1993);
3. J. Bacteriol 184, 6836-6844 (2002); 4. J. Bacteriol 187(12):4116-26 (2005)
RctA, UN REGULADOR TRANSCRIPCIONAL QUE REPRIME LA
TRANSFERENCIA CONJUGATIVA DEL PLÁSMIDO SIMBIÓTICO DE Rhizobium
etli
Sepúlveda, E. 1, Pérez-Méndoza, D. 2, Muñoz , S. 2, Ramírez-Romero, M.A. 1, Soto,
M.J. 2, Cervantes, L. 1, Herrera-Cervera, J.A. 3, López-Lara, l.1, Geiger, O. 1, Sanjuán,
J. 2, Brom , S. 1, y Romero, D. 1
1
Centro de Ciencias Genómicas, UNAM. A.P. 565-A, Cuernavaca, Mor. México.
2
Estación Experimental del Zaidín-CSIC. , 18008 Granada, España. 3Departamento
de Biología Vegetal, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, 18071
Granada, España. [email protected] Tel. 56227691 Fax. (01) 7773175581
El plásmido simbiótico de Rhizobium etli (p42d) posee todos los genes necesarios
para codificar un sistema conjugativo tipo IV, sin embargo solo se había reportado su
movilización en condiciones de laboratorio por cointegración con otro plásmido
automovilizable (p42a).
Por medio de mutación al azar hemos identificado cepas mutantes capaces de
transferir el plásmido simbiótico en ausencia del p42a; estas mutantes nos
permitieron identificar a un gen, rctA, como regulador negativo de la conjugación del
plásmido simbiótico. El gen rctA se encuentra adyacente al operón virB y se
transcribe divergentemente de éste, además se encuentra conservado en
localización y secuencia en el pA de Sinorhizobium meliloti y en el pATc58 de
Agrobacterium tumefaciens.
Este gen codifica para una proteína de 124
aminoácidos y presenta un dominio de unión a DNA del tipo de helice alada, lo que
lo ubica como un fuerte candidato para un regulador a nivel transcripcional. Para
determinar el mecanismo por el cual rctA regula negativamente la expresión del
operón virB hemos mapeado los promotores de rctA y del operón virB. El primero se
localiza en la región intergénica entre ambos y el segundo en la región codificante de
rctA. Por medio de PCR hemos aislado el gen y lo clonamos en el plásmido pET16B,
generando una fusión traduccional a una etiqueta de histidinas. Esta fusión es capaz
de restaurar el fenotipo de represión conjugativa en cepas mutantes en rctA. La
proteína se sobrexpresó y purificó (por medio de una columna de Ni-Sepharosa y
eluyendo con imidazol) y fue usada en ensayos de retardo de migración
electroforética (EMSA) utilizando como blanco las regiones del genoma en donde
fueron mapeadas los promotores mencionados previamente. Realizando recortes de
estas regiones hemos podido identificar un fragmento de 100 pb (abarcando el
promotor del operón virB) como la región mínima necesaria para la unión de RctA al
DNA. Ensayos de competencia han demostrado que esta unión es específica.
Un análisis de la región equivalente en S. meliloti, A. tumefaciens y R. etli reveló una
zona conservada de nueve nucleótidos entre las cajas -10 y -35 del promotor de virB
y otra de cuatro nucleótidos localizada después del sitio de inicio de la transcripción
de este gen. Actualmente realizamos la mutación de estas regiones para, mediante
ensayos de retardo, de footprinting y fusiones transcripcionales, determinar si son
los motivos reconocidos por RctA para su unión a DNA.
1.-Pérez-Mendoza D., Sepúlveda, E., Pando, V., Muñoz, S., Nogales, J., Olivares, J., Soto, M. J., HerreraCervera, J. A., Romero, D., Brom, S & Sanjuán, J.(2005). Identification of the rctA gene required for repression of
conjugative transfer of rhizobial symbiotic megaplasmids. J. Bacteriol.187:7341-7350
Elementos requeridos para activar el origen de replicación de un plásmido
repABC
Cervantes-Rivera, R. y Cevallos, G. M. A. Programa de Genómica Evolutiva, Centro
de Ciencias Gnómicas-UNAM.
El pSym de Rhizobium etli es un plásmido de bajo número de copias (1-2 por
cromosoma) que pertenece a la familia de replicadores repABC. Los replicadores
repABC se caracterizan por la presencia de tres genes conservados, repA, repB y
repC, así como dos regiones de incompatibilidad inca e incb. RepA y RepB
participan en la estabilidad del plásmido. RepA, además, es el regulador negativo del
sistema. RepB se une a incb donde se localiza el sitio par. En inca hay un RNA
antisentido que regula la expresión de RepC. El presente trabajo se centra en el
estudio de la replicación del pSym.
Trabajos previos del laboratorio demostraron que las deleciones de repC impedían
que el plásmido replicara. En primer lugar se planteo delimitar el origen de
replicación. Se clonó repC en un vector suicida bajo el promotor PLac, se conjugó a
R. etil, se observó que la construcción replica eficientemente, lo que indica que el
origen de replicación está dentro de la región codificante de repC y que RepC podría
ser la proteína iniciadora de la replicación.
Una región rica en A+T es una característica típica de los orígenes de replicación.
Un análisis in silico de la secuencia de repC, identificó una región rica en AT de 200
nucleótidos en la parte central del gen. Mutaciones sinónimas de dicha región
impiden la replicación, lo que sugiere una función importante en el inicio de la
replicación.
Los análisis preliminares de los intermediarios de replicación en electroforesis de dos
dimensiones sugieren que el oriV podría estar entre el nucleótido 400 y 800, y que
este plásmido podría estar replicando por un mecanismo theta bidireccional.
Con los experimentos anteriores ya habíamos delimitado la región de inicio de la
replicación, para tener una descripción más detallada, se decidió determinar el
nucleótido en el que inicia la replicación, para lo que usamos la técnica RIP. Los
resultados preliminares sugieren que la replicación en cadena líder inicia en el
nucleótido 586, en tanto que en la cadena retardada inicia en el 695, lo que nos da
un margen de 109 nucleótidos entre el inicio de la replicación entre una cadena y
otra.
La incompatibilidad es una más de las características de las proteínas iniciadoras de
la replicación. Experimentos con diferentes quimeras, entre repC del pSymd de R.
etli y repC del pSymA de R. meliloti nos han sugerido que la incompatibilidad de
RepC está determinada por 123 aminoácidos del extremo carboxil.
Análisis genético y molecular del papel de un pequeño RNA antisentido, una
estructura tallo-asa, y un oligopéptido en la regulación de la traducción de la
proteína de inicio de la replicación de un plásmido repABC
Proyecto de Doctorado de América Rivera Urbalejo
La cepa CFN42 de Rhizobium etli contiene el plásmido p42d, cuyo replicón básico
es un operón repABC.
Un análisis genético de este operón demostró que en la región intergénica repBrepC (inc-alfa) contiene al menos tres elementos reguladores que participan en la
regulación de la expresión de RepC: A) un gen que codifica para un RNA antisentido
(ctRNA) de 59 pb. B) Una estructura tallo-asa localizada inmediatamente arriba del
gen repC y C) Un pequeño péptido de 10 residuos de aminoácidos codificado
dentro del elemento S .
OBJETIVO
Identificar los mecanismos moleculares mediante los cuáles el ctRNA, el elemento S,
y el oligopéptido regulan la replicación del plásmido p42d.
HIPOTESIS
1.- El SD del gen repC es deficiente para replicar y el estar ocluido dentro del
elemento S, entorpece su funcionamiento ya de por si, poco eficiente.
2.- Suponemos el SD del péptido que se codifica dentro del elemento S
es mejor que el SD de repC.
Debido a que el codón de termino del péptido sobrelapa con el SD
de repC, es que sugerimos que hay un acoplamiento traduccional.
3.- Suponemos que la interacción del ctRNA con el RNAm del operón
induce que este tome una conformación tal (formación del elemento
S) que impida que el péptido se traduzca y por consiguiente que
repC tampoco lo haga.
4.- En ausencia de la interacción del ctRNA y el RNAm del operón se
tendría un plegamiento alternativo que favorecería la traducción.
Suponemos también que el paso del ribosoma sobre el elemento S,
cuando esta traduciendo el péptido , facilita la apertura de la
estructura tallo-asa, liberando así el SD de repC.
Estudio del Secretoma de Rhizobium etli utilizando proteómica.
Meneses Moreno Niurka
Tutor: Dr. Sergio Encarnación Guevara
Resumen:
En nuestro trabajo estudiaremos las proteínas que son secretadas al medio por
Rhizobium etli en los estadios tempranos de crecimiento, la fase estacionaria,
además en vida libre ante la presencia del inductor naringenina y durante la
formación del biofilm. Esto lo analizaremos valiéndonos de herramientas de la
proteómica para identificar las proteínas secretadas “secretoma”, y definir el papel de
estas en el funcionamiento celular en las etapas que planteamos estudiar.
Actualmente contamos con los primeros resultados, que concuerdan con los
reportados en otras especies.
ANALISIS PROTEÓMICO Y TRANSCRIPTÓMICO DE LA INTERACCIÓN
Saccharomyces cerevisiae – Rhizobium etli EN BIOFILMS.
Andrade-Domínguez A1. y Encarnación G. S1.
1.-Programa de Genómica Funcional de Procariotes, Centro de Ciencias Genómicas,
UNAM. Circuito Universidad, Cuernavaca, Morelos, México.
Existen evidencias que sugieren que la comunicación entre miembros de la misma
especie, y entre especies diferentes, son necesarias para la sobre vivencia de los
microorganismos en diversos nichos ecológico. Para investigar a nivel molecular la
interacción eucarionte-procariote durante la formación de biofilms, proponemos
como modelo de estudio el cocultivo de R. etli y S. cerevisiae. Nuestro estudio se
enfoca en el análisis de la transcripción global de los genes, y de las proteínas
sintetizadas por S. cerevisiae y R. etli durante los estados tempranos y tardíos de la
formación del biofilm en cocultivos. El análisis con microscopia óptica a las 24 hrs,
revela que el biofilm mixto S. cerevisiae-R. etli esta formado por agregados celulares
de S. cerevisiae rodeados por microcolonias de R. etli.
Para tener una vista global de los cambios en el proteoma de ambas especies,
nosotros usamos electroforesis en gel en dos dimensiones, y espectrometría de
masas (MALDI-TOF) para identificar las proteínas de interés. Cuantificaciones
relativas de aproximadamente 900 proteínas para R. etli y 500 de S. cerevisiae,
fueron obtenidas y analizadas estadísticamente para identificar aquellas que
muestran cambios significativos en su nivel de expresión durante la formación del
biofilm en cocultivo o en monocultivos. Los análisis preliminares revelan que en
nuestro modelo, ambas especies presentan diferencias en sus perfiles proteicos al
comparar cocultivos contra cultivos puros. En ambas condiciones de cultivo las
células sésiles de R. etli carecen de las Flagelinas Flo1 y Flo2, lo cual coincide con
lo reportado para otros procariotes1. Además, son notables los cambios en los
niveles de expresión de Proteínas transportadoras tipo ABC.
En S. cerevisiae, aproximadamente 60 proteínas muestran cambios en su nivel de
expresión. Por ejemplo, en cocultivo se sobreexpresan dos proteínas de Heat shock,
Kar2 y Hsp60, la primera es una ATPasa que participa en el plegamiento y
exportación de proteínas solubles en el RE2. HSP60 es una chaperona esencial para
el plegamiento y ensamble de complejos proteicos en la mitocondria3.
1.-An, D., Danhorn, T., Fuqua,W.C. and Parsek, M. R., 2006. Quorum sensing and
motility mediate interactions between Pseudomonas aeruginosa and Agrobacterium
tumefaciens in biofilm cocultures, Proc. Natl. Acad. Sci. USSA,103:3828-3833.
2.- Plemper, R.K., Bohmler, S., Bordallo, J., Sommer, T., and Wolf, D.H. 1997.
Mutant analysis links the translocon and BiP to retrograde protein transport for ER
degradation. Nature. 388:891-895
3.- Cheng MY, F.-ULRICH HARTL* & ARTHUR L. NORWICH.1990. The
mitochondrial chaperonin hsp60 is required for its own assembly. Nature
348(6300):455-8
IDENTIFICACIÓN DE GENES CRUCIALES PARA EL METABOLISMO EN EL
PLASMIDO p42e DE Rhizobium etli
Landeta C., Romero D.,
Departamento de Ingeniería Genómica, Centro de Ciencias Genómicas, UNAM,
Cuernavaca, México.
A pesar del uso de sistemas de selección positiva particularmente eficientes
resultó imposible el obtener una cepa carente de p42e (505 Kb). Únicamente se
obtuvo una cepa con una deleción de aproximadamente 250kb en dicho plásmido,
designada como p42eΔ. Si bien nuestra incapacidad para eliminar totalmente p42e
pudiera deberse a un control particularmente eficiente para segregación de este
plásmido, creemos que esta incapacidad se debe más bien a la posible existencia de
genes esenciales en este plásmido. En apoyo a lo anterior, encontramos que la cepa
que porta p42eΔ muestra una marcada reducción en velocidad de crecimiento tanto
en medio rico como en medio mínimo, además de ser incapaz de degradar
melibiosa.
La reciente publicación de la secuencia completa del genoma de Rhizobium
etli CFN42 nos permitió el hacer un análisis in silico de posibles funciones esenciales
para metabolismo localizadas en p42e. Los resultados de este análisis se muestran
en la siguiente figura y tabla. Cerca del 10% de los genes en este plásmido podrían
participar en funciones metabólicas más centrales, ya sea en biosíntesis,
degradación, exclusión de iones y otras funciones celulares. Para algunos de estos
genes, como los empleados en la vía de salvamento de tiamina los de degradación
de asparagina existe evidencia sugerente de su funcionalidad. Esta concentración
de posibles funciones metabólicas no se observa en ningún otro de los plásmidos en
esta bacteria.
Funciones
Biosíntesis
NAD
Cobalamina
Tiamina
(salvamento)
Cardiolipina
Selenocisteína
Degradación
Asparagina
Ác. Protocatéquico
Histidina
Melibiosa
Exclusión
Cobre
Potasio
Funciones celulares
Formación de septo
Oxidasa terminal
Genes
nadABC
cobFGHIJKLM
thiMED
actP-hmrR
cobFGHIJKLM
nadABC repABC
cyoABCD
minCDE
500 000
pcaBGHC
hutUGHI
hutC
hutE2
agpT
cls
selA
100 000
400 000
ansRPAB
pcaIJF y pcaBGHC
hutUGHI, hutC y hutE2
agpT, agaL1-agpA-unkunk-agaL2
agaL1 agpA un agaL2
Rhizobium etli p42e
(505334 bp)
asnRPAB
selA
thiMED
300 000
200 000
kdpABCDE
actP-hmrR
kdpABCDE
cls
pcaIJF
minCDE
cyoABCD
Al comparar la secuencia de R. etli CFN42 con la secuencia de Rhizobium
leguminosarum bv. viciae 3841, encontramos una alta colinearidad solamente en las
comparaciones cromosoma de etli vs. el cromosoma de leguminosarum y en las
comparaciones p42e vs. pRL11. El pRL11 muestra, de hecho una alta conservación
de todos los genes que detectamos en p42e.
CARACTERIZACIÓN DE LA PROTEÍNA ACARREADORA DE ACILOS SMb20651
DE Sinorhizobium meliloti.
Ana Laura Ramos-Vega1, Sandra L. Beltrán-Escobar1, Sandra Contreras2, Sergio
Encarnación2, Otto Geiger1 e Isabel M. López-Lara1.
1
Programa de Ecología Genómica, 2Programa de Genómica Funcional de
Procariontes, Centro de Ciencias Genómicas, Universidad Nacional Autónoma de
México. Apdo. Postal 565-A, CP 62210, Cuernavaca, Morelos, México.
Las proteínas acarreadoras de grupos acilo (ACPs) son proteínas pequeñas y ácidas
que en su forma funcional, poseen el grupo prostético de 4’-fosfopanteteína, por
medio del cual, portan a los residuos acilo o cétido formados durante las reacciones
de elongación y transferencia en la biosíntesis de ácidos grasos y policétidos. La 4’fosfopanteteína es transferida desde la coenzima A (CoA) a la ACP por la enzima
holo ACP sintasa (AcpS). En Escherichia coli K12 existe sólo AcpP, una proteína
constitutiva y esencial. En cambio, en rhizobia se han caracterizado 4 diferentes
ACPs: AcpP, NodF, AcpXL y RkpF. El genoma de Sinorhizobium meliloti 1021 revela
además la presencia de dos ORFs que probablemente codifican para ACPs. El
primero, smc01553, está en cromosoma y duplicado en pSymB. El segundo ORF,
smb20651, se encuentra en pSymB y forma parte de un posible operón formado por
cuatro genes. Existen homólogos a SMb20651, y a algunas de las proteínas
codificadas por el probable operón, en microorganismos tan diversos como
Mesorhizobium, Methanosarcina, Agrobacterium, Azoarcus, Pseudomonas y
Sorangium. SMb20651 sobreproducido en E. coli es capaz de incorporar in vivo la
[H3] β-alanina, el bloque biosintético de la 4’-fosfopanteteína, demostrando que esta
proteína es una ACP. Curiosamente, en el sistema heterólogo usado, se necesitan
copias extras de AcpS de E. coli o la presencia de AcpS de S. meliloti para una
eficiente conversión a su forma funcional. SMb20651 se purificó a partír de cultivos
de E. coli y tras ser incubado con AcpS de S. meliloti se comprobó por
espectrometría de masas un aumento de 338.1 u.m.a. que confirma la incorporación
de la 4’-fosfopanteteína. Adicionalmente, se han obtenido anticuerpos policlonales
contra His-SMb20651, con los cuáles es posible detectar a SMb20651 en cantidades
significativas en S. meliloti durante la fase exponencial de crecimiento. Actualmente,
se está purificando la proteína desde S. meliloti para el análisis por espectrometría
de masas de las posibles formas aciladas que esta proteína acarrea. Por otra parte,
se han generado mutantes de S. meliloti 1021 deletadas en SMb20651, estas
forman ligeramente menos nódulos en plantas de alfalfa con respecto a la cepa
silvestre.
GENES DE Burkholderia cenocepacia J2315 INVOLUCRADOS EN LA
BIOSÍNTESIS Y MODIFICACIONES DE LÍPIDOS DE ORNITINA
González-Silva N.1, Reyes-Lamothe R.1, Solares-Pérez A.1, Taylor A.2, Sumpton D.2,
Thomas-Oates J. E.2, López-Lara I. M.1 y Geiger O.1
1
Programa de Ecología Genómica, Centro de Ciencias Genómicas, UNAM, Av.
Universidad s/n, Apdo. postal 565-5-A, CP 062210, Cuernavaca, Morelos, México,
2
Department of Chemistry, University of York, Heslington, York, UK.
Burkholderia cenocepacia J2315 es una bacteria Gram-negativa conocida como un
patógeno oportunista de humanos con fibrosis quística, con alto grado de
patogenicidad y transmisibilidad entre individuos enfermos. Los principales lípidos de
membrana de la cepa J2315 crecida en LB a 30˚C son cardiolipina (CL),
fosfatidilglicerol (PG), fosfatiletanolamina (PE), lípidos que contienen el aminoácido
ornitina (LO), así como derivados hidroxilados de PE y LO. Ambas hidroxilaciones de
los derivados hidroxilados se encuentran en el carbono 2 (2OH) de ácidos grasos.
En el LO la 2OH esta en el acilo esterificado y en PE en el acilo unido en la posición
sn-2 del residuo de glicerol. Los LO son lípidos sin fósforo en su estructura,
presentes en las membranas de muchas bacterias Gram-negativas y Grampositivas, funcionan como potentes inmunoactivadores no tóxicos del sistema
inmune de mamíferos y se conoce poco sobre la función que desempeñan en la
membrana de las bacterias. Recientemente, se identificaron en S. meliloti 1021 los
genes estructurales olsB y olsA que se requieren para la biosíntesis de LO y B.
cenocepacia tiene genes que codifican para proteínas homólogas a OlsB y OlsA. Sin
embargo, no se conoce el gen que modifica con la 2-hidroxilación al ácido graso
esterificado del LO. Con el objetivo de identificar el gen que produce el LO-2OH
realizamos una búsqueda en el genoma de la cepa J2315 con la hidroxilasa LpxO de
Salmonella typhimurium. La LpxO realiza una 2-hidroxilación en un residuo de
miristato del lípido A. Se identificaron dos orfs homólogos a la LpxO, denominados
LpxO1 y LpxO2, se clonaron y se expresaron en las cepas silvestres 1021 y J2315.
Como resultado de la expresión del gen lpxO2 en la cepa 1021 se detectó por
cromatografía en capa fina de dos dimensiones la síntesis de un nuevo lípido (NL) y
en la J2315 se formaron dos nuevos lípidos (NL1 y NL2). Los datos de
espectrometría de masas sugieren que el NL formado en la cepa 1021 se trata de
una forma hidroxilada de LO al igual que el NL1 producido por la cepa J2315 y que
el NL2 se trata de un LO dihidroxilado. Los nuevos LO que se forman dependientes
de la expresión del lpxO2, sorprendentemente, tienen una hidroxilación en el ácido
graso amidificado. Lo anterior indica que la proteína LpxO2 no es responsable de
generar la 2-hidroxilación en el ácido graso esterificado. Además, una mutante en el
gen lpxO2 derivada de la cepa J2315 tiene un perfil de lípidos similar a la cepa
silvestre y un sintetiza LO-2OH. El gen olsB participa en el primer paso de síntesis
de LO. Una mutante derivada de la cepa J2315 en el gen olsB no sintetiza ninguna
forma de LO. Con los resultados anteriores se puede concluir que LpxO2 es una
hidroxilasa especifica para LO.
Caracterización de las Respuestas Fisiologicas y Moleculares de Frijol Negro
Jamapa a la Deficiencia de Fósforo y a la Toxicidad por Manganeso.
Valdés-López1, O, Ramírez, M1, Lara, M1, Graham M2, Tesfaye M3, Reddy PM1,
Girard L1, Vance CP3,5, Reyes, JL4, Sánchez, F4, Hernández G*1.
* [email protected]
1. Centro de Ciencias Genómicas-Universidad Nacional Autónoma de México,
Cuernavaca, México.
2. USDA-ARS, Corn Insects and Crop Genetics Research Unit, Ames, IA, USA
3. University of Minnesota, St. Paul, MN, USA
4. Instituto de Biotecnología-Universidad Nacional Autónoma de México.
Cuernavaca, México.
5. USDA-ARS, Plant Research Unit, St. Paul, MN, USA.
Tanto el fósforo (Pi) como el manganeso (Mn+2) son dos elementos esenciales para
el crecimiento óptimo de las plantas. Sin embargo, una de las limitantes en la
producción de frijol es la baja disponibilidad del Pi y los elevados niveles de Mn+2
que hay en los suelos en los que se produce. En este estudio se han analizado las
respuestas fisiológicas y moleculares de frijol común creciendo tres semanas bajo la
limitación de fósforo (5µM Pi) y toxicidad por Mn+2, lo cual se realizó bajo
condiciones simbióticas y no simbióticas. Como se ha reportado en otros estudios de
limitación de fósforo, nosotros también hemos observado el incremento en la
proporción raíz/tallo y la disminución en el área foliar, en la fotosíntesis neta, en la
actividad de la nitrogenasa, en el número de nódulos, entre otros parámetros
fisiológicos. Por otro lado, las respuestas fisiológicas del frijol a la toxicidad de Mn+2
consistieron en la disminución en la actividad de la nitrogenasa, en la fotosíntesis
neta, en los pigmentos fotosintéticos y un incremento en la concentración de Mn+2
presente en todos los órganos analizados. En lo que respecta a las respuestas
moleculares de frijol, en nuestro grupo hemos realizado análisis in silico y perfiles
transcripcionales de raíces de frijol estresadas con limitación de fósforo, con los
cuales se han identificado posibles genes claves en la tolerancia del frijol a la
deficiencia de fósforo(Graham, et. al. 2006. Hernández, et. al. 2006). Entre los genes
claves destacan el factor transcripcional PHR1, Rnase H, fosfatasas ácidas, entre
otros. Algunos de estos genes candidatos han sido seleccionados para analizar
mediante RNAi o micro RNA artificiales (amiR) su probable relevancia fisiológica en
la limitación de fósforo. Hasta el momento tenemos diferentes construcciones de
RNAi, las cuales han sido introducidas a la cepa K599 de A. rhizogenes y usadas
para generar plantas “compuestas” de frijol (plantas con raíces transgénicas), con las
cuales se analizará el posible fenotipo de cada gen silenciado. Por último,
actualmente estamos analizando el perfil transcripcional de frijol común creciendo en
toxicidad por Mn+2.
Ecología molecular y genética de poblaciones de bacterias potencialmente
patógenas del río Apatlaco, Mor.
Resumen de tesis de doctorado del M. en C. Bernardo Sachman.
El Salto de San Antón (que forma parte del río Apatlaco) representa un atractivo
turístico en medio de la ciudad de Cuernavaca que se ha convertido en receptor de
los desechos agroindustriales y el cual funciona como parte de la red de desagüe de
la población, lo cual ha generado su grave deterioro, convirtiéndolo probablemente
en un foco de infección de enfermedades bacterianas. El estudio de la composición
de la comunidad bacteriana y de poblaciones de especies potencialmente patógenas
es indispensable para determinar la magnitud del problema. Se proponen dos
aproximaciones analíticas complementarias: I) Análisis de la diversidad de especies
y estructura genética de poblaciones de bacterias cultivables aisladas en medios
selectivos para los grupos representativos que resulten resistentes a múltiples
antibióticos. II) Análisis comparativo de la composición de comunidades bacterianas
en el río Apatlaco (Salto de San Anton) vs. un río no contaminado (río Tembembe)
mediante fingerprints de comunidades (RISA). En este contexto se construirán
también librerías de genes de interés a partir de muestras de DNA ambiental que
ayuden a determinar la diversidad y potencial patogénico de micobacterias no
tuberculosas presentes en las aguas de dichos ríos. Las secuencias generadas en
los apartados I y II se analizarán mediante métodos filogenéticos y de genética de
poblaciones. Además se determinarán los valores de diversos parámetros
ambientales (físicos y químicos) que se usarán para buscar correlaciones con la
composición de la comunidad bacteriana en cada zona.