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INFORME TECNICO DEL PROYECTO 20070538 Diversidad genética de las bacterias endofiticas y simbioticas de los nódulos de las leguminosas Conzattia, frijol y colorín Responsable: Dr. Entao Wang Hu, Departamento de Microbiología, ENCB­IPN RESUMEN Por este proyecto, se realizaron el aislamiento y la caracterización de los rizobios de frijol y de colorín. Se confirmaron que 1) los rizobios principales de colorín fue Bradyrhizobium, similar a B. japonicum, en suelos ácidos y neutros en México; 2) los rizobios de frijol son diferentes en suelo ácido y neutro y las variedades de frijol no hubo efecto tan fuerte como el pH de suelo sobre la población de rizobio; 3) los rizobios de frijol en un suelo ácido mexicano fueron Rhizobium leguminosarum y R. giardinii, los cuales solo reportaron en Europa anteriormente. Estos resultados forman la base para más investigaciones y indicaron la necesitad de uso inoculantes de rizobio para diferentes suelos. El trabajo sobre las bacterias endofiticas de Conzattia no se podría realizar porque el alumno correspondiente a esto estudio se dio de baja del programa sin terminar su tesis.
1 INFORME TECNICO DEL PROYECTO 20070538 RESPONSABLE: Dr. ENTAO WANG HU Departamento de Microbiología, ENCB­IPN 1. INTRODUCCIÓN En la naturaleza, todas plantas forman asociaciones con los microorganismos, incluyendo las bacterias. Entre las formas de relación bacteria­planta se encuentra la formación de nódulos o agallas, los cuales son estructuras que pueden formarse en raíces, corona, tallos u hojas de la planta. Una de sus funciones es la fijación de nitrógeno como lo que se encuentra en los nódulos de leguminosas. En éstos, se han aislado diversas clases de bacterias simbióticas y endofíticas. Las bacterias simbióticas de las leguminosas tienen genes de nodulación y de fijación de nitrógeno, y pueden inducir la formación de nódulos. Las bacterias endofíticas son aquellas que viven sin causar daño en el interior de células y/o tejidos de plantas superiores. Las poblaciones de bacterias simbióticas y endofíticas se afectan por condiciones del hábitat de las plantas. Es muy importante el estudio de los microorganismos endofíticos tanto para comprender su relación con las plantas como para explorar los biorecursos nuevos con potencial de diferentes usos, así como selección de inoculo de microorganismos que pueden mejorar el crecimiento de la planta o producción de antibióticos nuevos. En México se encuentran muchas leguminosas nativas, las cuales son importantes económicamente o ecológicamente. En el presente proyecto, se investigarán la diversidad de las bacterias endofíticas o simbióticas de tres leguminosas: el árbol Conzattia multiflora, el árbol colorín (Erythrina mexicana), y el fríjol (Phaseolus vulgaris L.).
2 El fríjol es originado de México y forma nódulos radicales con varias bacterias de los géneros de Bradyrhizobium, Rhizobium y Sinorhizobium (Mnasri et al. 2007) en distintas zonas (Han et al. 2005). Las cepas de Bradyrhizobium y de R. tropici se encontraron en suelos ácidos en China y en otros países. En México, hay muchas zonas donde tienen suelos ácidos, pero los rizobios de fríjol cultivado en suelos ácidos de México no han sido investigados. En nuestro laboratorio, han sido aisladas 100 cepas de rhizobia de fríjol en suelo con pH 4.5. Por las características coloniales y fenotípicas, estas cepas son diferentes a R. etli, el rhizobio más común de fríjol en México. Además de los rizobios en los nódulos de las leguminosas, también se encentraron bacterias endofíticas. Una de las bacterias endofíticas más estudiadas de los nódulos de leguminosas es Agrobacterium. Estas cepas se pueden inhibir específicamente la formación de nódulo por R. gallicum en frijol (Mrabet et al. 2006), pero no se demostró efecto sobre nodulación y crecimiento de Melilotus (Wang et al. 2006). Otros tipos de bacterias endofiticas de los nódulos, incluyendo Bacillus, Pantoea, Serratia, Burkholderia y Acinetobacter, han sido reportadas (Li et al. 2008), las cuales tienen las capacidades de fijar nitrógeno, producir IAA y disolver fósforo. En el mismo estudio, también se observó que hubo transferencia lateral del gen de fijación de nitrógeno de simbionte Bradyrhizobium al endofito Bacillus. Conzattia multiflora, una leguminosa arbórea de Ceasalpinioideae, es nativa de México. En el campo, encontramos que esta planta forma “nódulos” en su tronco y solo algunas enterobacterias se aislaron de estos nódulos (Wang et al. 2006). Sin embargo, estas bacterias no causan la formación de nodulos. Debido a que este nódulo es un tipo nuevo en las leguminosas, es interesante investigar si en ellos existen bacterias fijadoras de nitrógeno y bacterias de nodulación por métodos moleculares.
3 El árbol colorín (Erythrina americana) es un árbol de la subfamilia Papiloionoideae de leguminosa nativa en México. En condiciones normales, suele desarrollarse mejor a altitudes de 1000 a 2100 m.s.n.m, en bosques caducifolios, matorral subtropical, selva alta perennifolia y regiones de vegetación secundaria. (Lozoya, op cit). En México, el colorín se usa como árboles de ornato en las calles porque sus flores son muy bonitas. Una investigación anterior indica que el colorín produce erythroidina, una sustancia con importancia química y farmacológica (Folkers y Major 1937). Hasta la fecha, no se encuentra información sobre la nodulación de colorín y sobre sus rizobios. Actualmente ya se ha reportado que Sinorhizobium fredii puede formar nódulos en dos especies de Erythrina: E. variegata y E. vespertilio, bajo condiciones de laboratorio; y que tres cepas de Erythrina costarricenses se han identificadas como Bradyrhizobium por sus secuencias del gen 16S rRNA. En este proyecto, se estudió la diversidad de los aislados de fríjol y colorín por los métodos similares al trabajo sobre los rhizobia de colorín, mientras se estudió la diversidad de las bacterias en Conzattia multiflora. El objetivo general es conocer los rhizobia asociados con la Erithryna americana Mill y con frijol en suelo acido y neutro, e investigar la existencia de bacterias simbióticas en nódulos de Conzattia multiflora. Otro objetivo es la realización de tesis para los alumnos mediante estos trabajos. 2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1 Aislamiento de los rizobios asociados a colorín 2.1.1 Muestro. Se muestrearon suelos rizosféricos y semillas de colorín en la ciudad de Cuernavaca del Estado de Morelos y en el área metropolitana de la ciudad de México. También se colectaron nódulos radicales de plántulas de colorín (10 individuas en cada
4 zona). Los suelos se guardaron en bolsas negras de plástico a refrigeración (4°C). Las plántulas que presenten nódulos se mantuvieron en bolsa con suelo para ser utilizados el mismo o segundo día posterior a su recolección. 2.1.2 Extracción de rizobios en las muestras de suelo por nodulación. Las semillas de colorín se lijaron en papel de arena (para romper su corteza) y se desinfectaron en una solución al 10% de hipoclorito de sodio bajo condiciones asépticas (Vincent 1970). Después, las semillas se germinaron en la oscuridad a 28ºC en papel de filtro mojado con agua estéril en vasos previamente esterilizados. Las semillas germinadas se sembraron en vasos de plástico limpios que contendrán vermiculita mojada en la solución nutritiva (se aumenta nitrógeno) para plantas (Vincent 1970), y se inocularon con 1 gramo de la muestra de suelo. Las plantas se incubaron en invernadero bajo la luz de sol a temperatura ambiente. Después de 6 semanas de crecimiento, las plantas se recolectaron y los nódulos radicales se recogieron para el aislamiento de rhizobia. 2.1.3 Aislamiento y purificación de rhizobia en los nódulos. Los nódulos obtenidos en campo o en laboratorio se lavaron usando agua destilada para quitar el exceso de suelo. Después de la desinfección (Vincent 1970), cada nódulo se molió en un micro tubo con 50 µl de agua estéril bajo la condición aséptica. Una gota de la extracción del nódulo se sembró en una caja de Petri con medio de cultivo YMA por la técnica de estría cruzada. Las cajas se incubaron a 28ºC de 3 a 14 días hasta observar la formación de colonias bacterianas. Se transfirió cada tipo de colonia a una caja nueva con el mismo medio de cultivo por la técnica de estría cruzada y se incubaron las cajas como se mencionó anteriormente. Mientras se anotaron las características de cada tipo de las colonias como su
5 tamaño, textura, borde, luz transmitida, color, etc. Se repitió la técnica de estría cruzada hasta que todas colonias en la misma caja tuvieron formas y características idénticas. Se realizó la tinción de Gram en cada aislado para confirmar que es puro (todas las células tuvieron el mismo tamaño en su ancho). Una copia de cada aislado puro se guardó a –20ºC en 20% de glicerol estéril y otra copia se mantuvo en un tubo con medio YMA en refrigeración a 4°C para usarla en los siguientes análisis. 2.2 Aislamiento de rizobios de frijol 2.2.1 Muestreo de variedades y suelos rizosféricos de frijol. Con base en su morfología, las variedades del frijol se dividieron en 6 tipos (Figura 1). Para investigar el efecto de pH y cultivares de frijol sobre la población de rizobios, se tomó un suelo de pH casi neutro (7.38) del estado de Zacatecas y seis cultivares de frijol: Flor de durazno (FD), Negro perla (NP), Bayomex (BM) correspondiente a tipo I, y Flor de mayo M38 (FM), Negro 8025 (N8), Mayo INIFAP (BI) correspondiente a tipo III. Fig. 1. Tipos de frijol varíeles por su morfología (Citada de WWW. fao.org)
6 2.2.2 Extracción y aislamiento de rizobios en las muestras de suelo. Estos análisis se realizaron mediante los métodos anteriormente mencionados en aislamiento de rizobios de colorín. 2.3 Caracterización de los rhizobia por métodos de biología molecular. Se realizan para unos aislados que tienen diferentes características el análisis de RFLP (polimorfismo en el tamaño de los fragmentos de restricción) del gen 16S rDNA amplificado por PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa). Para hacer este análisis, se extrajo el DNA total de cada aislado, se amplificó el gen 16S rRNA usando los iniciadores fD1 y rD1, se digirieron los productos de PCR con las endonucleasas de restricción (HaeIII, HinfI, AluI y Sau3AI), se separaron los fragmentos de la restricción en gel de agarosa, después se visualizaron las bandas de DNA por la tinción de bromuro de etidio (Wang et al. 1998). Los aislados se agruparon en base a los patrones de RFLP representativos. De cada grupo de RFLP de los aislados se usó un aislado representativo para un análisis de secuencia del gen 16S rRNA (Wang et al. 1998). Las secuencias obtenidas se compararon con otras relacionadas en una base de datos y se construyó un árbol filogenético usando un programa de computadora (Clustal W) para determinar la identidad de los aislados. 2.4 Amplificación y secuenciación del gen nodC. El gen nodC es esencial para la formación de nódulos por los rizobios y su filogenia es una ruta para estimar la evolución de los rizobios. En este trabajo se amplificó este gen del DNA extraído de las cepas o de nódulos usando los iniciadores de NodCfor540 (5′­TGA TYG AYA TGG ART AYT GGC T­3′) y NodCrev1160 (5′­CGY GAC ARC CAR TCG CTR TTG­3′), y el protocolo de PCR
7 reportado por Sarita et al. (2005). Los productos de PCR se secuenciaron directamente de la misma forma que se mencionó en el análisis del gen 16S rRNA. 2.5 Caracterización de suelo. Las muestras de suelo se analizaron sobre su pH, humedad y contenido de materiales orgánicos y nutrientes, por métodos recomendados. Para determinar la humedad y el pH del suelo se usaron los métodos de Lemos et al. (2002). Para la determinación de compuestos orgánicos volátiles se colocó en un crisol a peso constante una muestra de 10 gramos de suelo seco en una mufla a 500 °C durante 2 horas, posterior a esto se colocó el crisol en un desecador y se pesó, la operación fue repetida tantas veces hasta obtener el crisol con suelo a peso constante, por último se sacó la diferencia entre el peso inicial del suelo seco y después de que se ha calcinado. Para conocer la cantidad de nutrientes se pretende enviar la muestra de suelo a un laboratorio especializado. 2.7 Análisis de los datos de rizobios. Los datos obtenidos de cada análisis se combinaron para conocer las relaciones entre factores ambientales y las características rhizobianas, así como para evaluar la diversidad de los rhizobia asociados con colorín presentes en cada ecosistema analizado, aunque no es posible comparar dichas poblaciones debido a que las condiciones ambientales de cada sitio estudiado son diferentes, lo anterior nos servirá como parámetro para conocer en qué condiciones se logra la interacción simbiótica entre Rhizobium y planta de una manera más efectiva. 2.8 Analisis de las bacterias endofiticas de los nódulos de Conzattia multiflora.
8 2.8.1 Extracción de DNA metagenómico de los nódulos. En este trabajo, se coleccionaron los nódulos del tronco de C. multiflora. Los nódulos se desinfectaron como reportado en Wang et al. (2006) y se fraccionó la corteza del nódulo para macerarla en solución reguladora a 10 min. Después de precipitar durante 10 min, el sobrenatante fue transferido a tubos para centrifugar. Los precipitados se juntaron en un solo tubo para tener 0.5 g de biomasa (mezcla de bacterias y tejidos vegetales) la cual se usó a extraer DNA metagenómico mediante el método de Zhou et al. (1995). 2.8.2 PCR­amplicación y clonación de los genes 16S rRNA. Los genes de 16S rRNA se amplificaron con métodos de Wang et al. (2006). Los amplificados se clonaron utilizando los plásmidos pJET1/blunt de 3128 pb y pTZ57R/T de 2886 pb como vectores para transformar la cepa DH5a de E. coli (químicamente competente) empleando los kits de clonación de Fermentas de acuerdo a las indicaciones del fabricante, las clonas obtenidas se inocularon en el medio de Luria Bertani con 100 mg/mL de Amplicilina y se realizó la extracción de plásmidos por el método de lisis alcalina según el procedimiento reportado en el Manual de Clonación Molecular de (Sambrook y Russell, 2001.) 2.8.3 Caracterización de las clonas por análisis de polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción Una vez que se haya realizado la extracción de los plásmidos estos se digieren con enzimas de restricción como a continuación se describe:
· 10 mL de muestra (4.4 ng)
· 2 mL de regulador de enzimas de restricción 10 x
· 0.5 mL de enzima (5 U/mL)
· 7.5 mL de agua miliQ
9 Se utilizan las enzimas MspI, HindI, HhaI, y XbaI, pues son de corte frecuente ya que cortan fragmentos de 4 pb y ofrecen buenos resultados para este trabajo, se corren en gel de agarosa al 3% a 100 V durante 90 min para verificar los patrones de RFLP. Los patrones se agruparon usando el coeficiente de similitud Sj (Sj=2c/(a+b) (donde c es numero de bandas que ocurrieron en ambas clonas; a y b son números totales en clona a y clona b), y por el método de UPGMA (Sneath y Sokal, 1973). 3. RESULTADOS 3.1 Estudio de los rizobios de colorín. 3.1.1 Muestreo y caracterización de los suelos. Para la caracterización del suelo, se determinaron la textura, pH, porcentaje de humedad y porcentaje de materia orgánica a través de métodos estandarizados. Los resultados obtenidos para el análisis del suelo se presentan en Tabla 1. Tabla 1. Características de los suelos muestreados Lugar de muestreo Textura del suelo pH % humedad % materia orgánica Estado de Morelos Arcillo arenoso 4.8 45.0 17.45 Ciudad de México Arcillo arenoso 4.5 22.5 14.95 Estado de México Arcillo arenoso 6.5 31.5 8.72
3.1.2 Extracción y aislamiento de los rizobios. De las plantas noduladas que se recolectaron en el muestreo de campo, así como obtenidas en el laboratorio en condiciones de invernadero se extrajeron los nódulos radicales (Figura 2) con lo que se consiguió un total de 227 nódulos, los cuales presentaron un color que varió desde el rosa pálido hasta púrpura intenso y su tamaño fue de 1 hasta 12 mm de diámetro. Posteriormente se sembró el extracto de cada nódulo en placas. De estos nódulos, se obtuvieron 227 aislados puros de 10 los cuales el 82.4 % producen álcali y crecen lentamente, el 12.8% produce ácido, polisacárido y es de crecimiento rápido (Figura 3), el 4.8% restante no generó ácido ni álcali y su morfología colonial fue muy diversa entre sí. Sin nóodulo Sin nóodulo Sin nódulo Con nódulo B. A Figura 2. Fotos de coloín demostrando el efecto de nodulación sobre crecimiento de la planta (A) y morfología de nódulos (B) de colorín. La Figura 2A muestra dos plantas obtenidas en el laboratorio, la primera de ellas no presenta desarrollo de nódulos y se caracteriza por poseer hojas de color amarillo debido a la clorosis ocasionada por la falta de nutriente de nitrógeno, mientras que la segunda planta si desarrolló nódulos y su aspecto es básicamente el de una planta sana. En la Figura 2B se observa la planta que si tiene nódulos, de los cuales se extraen las bacterias fijadoras de Nitrógeno. La Figura 3 presenta la diferencia entre las bacterias que crecen lentamente y producen álcali (izquierda), y las que crecen rápidamente y producen ácido en medio de cultivo YMA después de someterlas a incubación durante 5 días a 28 °C. A. Colonias que producen
11 B. Colonias que producen ácido
Figura 2. Colonias demostrando la diferencia entre Bradyrhizobium (A) y rizobios de crecimiento rápido (B) en medio de cultivo YMA. De las cepas obtenidas cuyo crecimiento es lento y producen álcali se realizó la selección al azar de algunas de ellas para extraer su ADN, también se ha observado su morfología colonial la cual se presenta en la siguiente Tabla 2. Las morfologías demostraron que los aislados son diversos. 3.1.3. Amplificación del gen nodA. En la Figura 4 se ve el resultado de una PCR de gen nodA, las cepas que presentan una banda marcada similar a la de la cepa USDA 1002 y SH 22622 indican la presencia de genes simbióticos, y las que no presentan esa banda, es probable que sean bacterias contaminantes. La línea 1 mostrada en la PCR, es un testigo que solamente contiene los reactivos y se ha sometido al mismo tratamiento que el resto de las cepas, se utiliza con la finalidad de verificar que no existen interferencias en la prueba, las cepas de interés se compararon con las cepas de referencia, las cuales presentan gen de nodulación, así, las que presenten las mismas bandas, son seleccionadas para su posterior análisis. 12 Tabla 2. Características morfológicas de los rizobios de colorín Colonia Tamaño Color Forma Elevación Superficie Aspecto Borde Luz transmitida Luz reflejada Consistencia Producción de H9­3 2 beige circular convexa lisa húmedo completo H7­4 1 amarillo circular convexa lisa húmedo completo H­27 1 amarillo puntiforme plana lisa húmedo completo H4­6 8 beige circular plana lisa húmedo completo H9­2 1 amarillo circular convexa lisa húmedo completo 101­7 2 beige irregular convexa lisa húmedo completo Neza3­1 1 amarillo circular convexa lisa húmedo completo H­28 1 amarillo circular convexa lisa húmedo completo opaca opaca traslucida opaca opaca opaca opaca opaca brillante mucoide alcalino brillante butirosa alcalino brillante butirosa alcalino brillante butirosa ácido brillante butirosa ácido brillante butirosa ácido brillante butirosa alcalino brillante butirosa ácido Incubación (d) 11 8 10 11 9 11 8 9 Colonia Sur 1­7 Sur 3­2 H5­1 H5­8 B1­8 B1­17 H5­10 Tamaño (mm) Color Forma Elevación Superficie Aspecto Borde Luz transmitida Luz reflejada Consistencia Producción de: Incubación (d) 1 amarillo circular convexa lisa húmedo completo 2 beige circular convexa lisa húmedo completo 1 amarillo circular convexa lisa húmedo completo 8 beige circular plana lisa húmedo completo 2 beige irregular convexa lisa húmedo completo 1 beige puntiforme convexa lisa húmedo completo 1 amarillo puntiforme plana lisa húmedo completo opaca opaca traslucida opaca opaca opaca traslucida brillante butirosa ácido 9 brillante mucoide alcalino 11 brillante butirosa alcalino 11 brillante butirosa ácido 11 brillante butirosa ácido 11 brillante butirosa ácido 12 brillante butirosa alcalino 10
3.1.4 Caracterización genotípica. Las cepas utilizadas en las pruebas anteriores fueron obtenidas del Estado de México: A­3, B1­19, B1­17; Estado de Morelos: H7­4,21­3, H­1; Ciudad de México:101­7, Neza4­8. Se observó que todas las cepas presentaron movilidad en medio PY al 0.75% de agar. Su tiempo de generación varió entre 9 y 48 horas. Estos datos están dentro del rango reportado para Bradyrhizobium (más de 8 horas). El rango en 13 el cual crecieron los microorganismos varía de 5 a 9 hrs. La tolerancia a las sales se presenta en la Tabla 3. 2­1 6­17 2­8 6­8 2­6 2­4 6­8 6­4 2­4” 1­2 2­8” Figura 4. Amplificación de nodA para confirmar la capacidad de nodulación.
2­2 2­8b 2­9” Figura 3. Amplificación de nodA para confirmar la capacidad de nodulación. Tabla 3. Características fisiológicas de los rizobios de colorin 0.10 0.15 0.20 0.25 0.15 0.05 ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ + + + ­ + + + ­ + + ­ ­ + + + ­ ­ + ­ + + + + + + + + + ­ ­ ­ + + ­ ­ ­ ­ + + ­ ­ ­ ­ + + + + + ­ + + ­ ­ + ­ + + ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 14 0.10 0.20 ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 3.1.5. Secuenciación del gen 16S rRNA. 0.05 0.15 A ­3 + ­ ­ ­ + + + + B1­19 + + ­ ­ + + + + B1­17 + + + ­ + + + + H7­4 + + ­ ­ + + + + 101­7 + + ­ ­ + + + + 21­3 + ­ ­ ­ + + + + H­1 + + ­ ­ + + + + N4­8 + ­ ­ ­ + + + + + Indica crecimiento bacterial en las cajas; ­Indica ausencia de crecimiento bacterial en las cajas. 0.20 0.10 NaCl 0.05 PbSO4 0.20 0.15 0.10 0.05 BaCl2 0.20 0.15 0.10 Cepas 0.05 CuSO4 % (w/v) de sales CdCl2 La secuencia obtenida de 16S rDNA de la cepa B1­13 tiene 1411 pb (Figura 5) y 99% similitud con el mismo gen de Bradyrhizobium japonicum USDA110 (número de registro: BA000040). La de la cepa N3­1 tiene 1440 bp y 99% similitud con Bradyrhizobium japonicum USDA135 (número de registro: AF208511). Estos datos demostraron que la mayoría de los rizobios de colorín fueron relacionados a B. japonicum. B1­13 (1441 bp) CGGCAGGCTT AACACATGCA AGTCGAGCGG GCGTAGCAAT ACGTCAGCGG CAGACGGGTG AGTAACGCGT GGGAACGTAC CTTTTGGTTC GGAACAACAC AGGGAAACTT GTGCTAATAC CGGATAAGCC CTTACGGGGA AAGATTTATC GCCGAAAGAT CGGCCCGCGT CTGATTAGCT AGTTGGTAGG GTAACGGCCT ACCAAGGCGA CGATCAGTAG CTGGTCTGAG AGGATGATCA GCCACATTGG GACTGAGACA CGGCCCAAAC TCCTACGGGA GGCAGCAGTG GGGAATATTG GACAATGGGG GCAACCCTGA TCCAGCCATG CCGCGTGAGT GATGAAGGCC CTAGGGTTGT AAAGCTCTTT TGTGCGGGAA GATAATGACG GTACCGCAAG AATAAGCCCC GGCTAACTTC GTGCCAGCAG CCGCGGTAAT ACGAAGGGGG CTAGCGTTGC TCGGAATCAC TGGGCGTAAA GGGTGCGTAG GCGGGTCTTT AAGTCAGGGG TGAAATCCTG GAGCTCAACT CCAGAACTGC CTTTGATACT GAAGATCTTG AGTTCGGGAG AGGTGAGTGG AACTGCGAGT GTAGAGGTGA AATTCGTAGA TATTCGCAAG AACACCAGTG GCGAAGGCGG CTCACTGGCC CGATACTGAC GCTGAGGCAC GAAAGCGTGG GGAGCAAACA GGATTAGATA CCCTGGTAGT CCACGCCGTA AACGATGAAT GCCAGCCGTT AGTGGGTTTA CTCACTAGTG GCGCAGCTAA CGCTTTAAGC ATTCCGCCTG GGGAGTACGG TCGCAAGATT AAAACTCAAA GGAATTGACG GGGGCCCGCA CAAGCGGTGG AGCATGTGGT TTAATTCGAC GCAACGCGCA GAACCTTACC AGCCCTTGAC ATGTCCAGGA CCGGTCGCAG AGATGTGACC TTCTCTTCGG AGCCTGGAAC ACAGGTGCTG CATGGCTGTC GTCAGCTCGT GTCGTGAGAT GTTGGGTTAA GTCCCGCAAC GAGCGCAACC CCCGTCCTTA GTTGCTACCA TTTAGTTGAG CACTCTAAGG AGACTGCCGG TGATAAGCCG CGAGGAAGGT GGGGATGACG TCAAGTCCTC ATGGCCCTTA CGGGCTGGGC TACACACGTG CTACAATGGC GGTGACAATG GGATGCTAAG GGGCGACCCT TCGCAAATCT CAAAAAGCCG TCTCAGTTCG GATTGGGCTC TGCAACTCGA GCCCATGAAG TTGGAATCGC TAGTAATCGT GGATCAGCAC GCCACGGTGA ATACGTTCCC GGGCCTTGTA CACACCGCCC GTCACACCAT GGGAGTTGGT TTTACCTGAA GACGGTGCGC TAACCCGCAA GGGAGGCAGC CGGCCACGGT AGGGTCAGCG ACTGGGGTGA AGTCGTAACA A N3­1 (1440 bp) CCAACGGCTT AACAGCCTGC TTAGACATGC AAGTCGAGCG GGCGTAGCAA TACGTCAGCG GCAGACGGGT GAGTAACGCG TGGGAACGTA CCTTTTGGTT CGGAACAACA CAGGGAAACT TGTGCTAATA CCGGATAAGC CCTTACGGGG AAAGATTTAT CGCCGAAAGA TCGGCCCGCG TCTGATTAGC TAGTTGGTGA GGTAATGGCT CACCAAGGCG ACGATCAGTA GCTGGTCTGA GAGGATGATC AGCCACATTG GGACTGAGAC ACGGCCCAAA CTCCTACGGG AGGCAGCAGT GGGGAATATT GGACAATGGG GGCAACCCTG ATCCAGCCAT GCCGCGTGAG TGATGAAGGC CCTAGGGTTG TAAAGCTCTT TTGTGCGGGA AGATAATGAC
15 GGTACCGCAA GAATAAGCCC CGGCTAACTT CGTGCCAGCA GCCGCGGTAA TACGAAGGGG GCTAGCGTTG CTCGGAATCA CTGGGCGTAA AGGGTGCGTA GGCGGGTCTT TAAGTCAGGG GTGAAATCCT GGAGCTCAAC TCCAGAACTG CCTTTGATAC TGAAGATCTT GAGTTCGGGA GAGGTGAGTG GAACTGCGAG TGTAGAGGTG AAATTCGTAG ATATTCGCAA GAACACCAGT GGCGAAGGCG GCTCACTGGC CCGATACTGA CGCTGAGGCA CGAAAGCGTG GGGAGCAAAC AGGATTAGAT ACCCTGGTAG TCCACGCCGT AAACGATGAA TGCCAGCCGT TAGTGGGTTT ACTCACTAGT GGCGCAGCTA ACGCTTTAAG CATTCCGCCT GGGGAGTACG GTCGCAAGAT TAAAACTCAA AGGAATTGAC GGGGGCCCGC ACAAGCGGTG GAGCATGTGG TTTAATTCGA CGCAACGCGC AGAACCTTAC CAGCCCTTGA CATGTCCAGG ACCGGTCGCA GAGATGTGAC CTTCTCTTCG GAGCCTGGAA CACAGGTGCT GCATGGCTGT CGTCAGCTCG TGTCGTGAGA TGTTGGGTTA AGTCCCGCAA CGAGCGCAAC CCCCGTCCTT AGTTGCTACC ATTTAGTTGA GCACTCTAAG GAGACTGCCG GTGATAAGCC GCGAGGAAGG TGGGGATGAC GTCAAGTCCT CATGGCCCTT ACGGGCTGGG CTACACACGT GCTACAATGG CGGTGACAAT GGGATGCTAA GGGGTGACCC TTCGCAAATC TCAAAAAGCC GTCTCAGTTC GGATTGGGCT CTGCAACTCG AGCCCATGAA GTTGGAATCG CTAGTAATCG TGGATCAGCA CGCCACGGTG AATACGTTCC CGGGCCTTGT ACACACCGCC CGTCACACCA TGGGAGTTGG TTTTACCTGA AGACGGTGCG CTAACCCGCA AGGGAGGCAG CCGGCCACGG TAGGGTCAGC CAGCTGGGGT TAAGTGTTAA TTTTGCTAAT CTCGCCCTCT Figura 5. Secuencias del 16S rDNA de los rizobios de colorín 3.2 Caracterización de rizobios de frijol 3.2.1 Filogenia de rizobio aislados del suelo ácido. Anteriormente, los aislados se agruparon en tres grupos con base en el análisis de las características fenotípicas. En el presente proyecto, se obtuvieron secuencias de 16S rDNA de 7 cepas representativas de estos grupos. Por análisis filogenético, se agruparon respectivamente a las especies Rhizobium leguminosarum, R. giardinii y Agrobacterium tumefaciens (Figura 6). En la amplificación de nodC, la cepas de A. tumefaciens no presentaron el producto corresponde, indicado que no fue una bacteria simbiotica igual que los reportes anteriores (). Las secuencias del nodC de 6 cepas se usaron en la construcción de árbol filogenético (Figura 7) y las 6 cepas se agruparon en dos grupos los cuales fueron muy similares que el árbol de 16S rDNA.
16 3.2.2 Aislamiento y caracterización de rizobios de suelo neutro. Los resultados de nodulación de las 6 variedades se presentan en Tabla 3. Estos resultados indicaron que el número de rizobio que nodulan distintas variedades fueron diferentes. De los nódulos obtenidos, se aislaron 59 cepas de rizobio. Ya se realizó el análisis de PCR­RFLP de 16S rDNA de 30 cepas. Solo una tenía patrones diferentes a otras (Figura 8). Nos parecen que la mayoría de estas cepas no son R. leguminosarum y R. giardinii. Estos resultados demostraron que en suelo de pH neutro, la población de rizobio es diferente a la de suelo ácido. Tabla 4. Resultado de nodulación de frijol inoculados con suelo de pH neutro Variedad NP BM FD FM N8 BI Dilución de suelo 10 ­3 10 ­4 10 ­5 + + + + ­ ­ + + + ­ + ­ ­ ­ + ­ ­ ­ + + + ­ + ­ + + + + ­ ­ + ­ + + ­ ­ Tipo I I I III III III 3.3 Estudio de bacterias endofiticas de Conzzatia. En este estudio, se construyó una biblioteca genética de los genes de 16S rRNA. Pero no obtuvimos más resultados por que el alumno Rolando Hernádez se dió de baja del programa sin terminar su tesis.
17 R. leguminosarum PB223 (EF525233) SH9 88 SH36 R. leguminosarum WSM2304 (DQ838519) 99 SH44 R. leguminosarum LMG 14904 (AM181757) 69 R. leguminosarum USDA 2370(U29386) R. tropic B CIAT899(U89832) R. tropic A LMG9517(X67234) 72 100 Ag. rhizogenes IFO 13257T (D14501) 67 56 R. lusitanum P1­7(AY738130) 21 R. etli CFN42(U28916) R. indigoferae CCBAU71042(AY034027) R. sullae IS123(Y10170) 96 74 R. yanglingense SH22623(CCBAU71623)(A... 55 R. gallicum R602sp(U86343) 57 R. mongolense USDA1844(U89817) 61 R. hainanense I66(CCBAU57015)(U71078) R. lossense CCBAU7190B(AF364069) R. galegae ATCC43677(D11343) 62 100 R. huautlense S02(AF025852) SH35 SH42 100 R. sp. 24.8 (DQ499520) R. giardinii R­4385 (AM181755) SH26 62 Ag. vitis NCPPB3554(D14502) Ag. rubi IFO13261(D14503) 99 SH5 100 Ag. tumefaiens IAM13129(D12784) 100 A. tumefaciens NCPPB 2437 (AB247617) A. tumefaciens LMG 140 (AM181758) 0.005 Figura 6. Árbol filogenético del gen 16S rRNA demostró las relaciones de los rizobios de frijol en un suelo acido.
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R. giardinii H152 (AF217267) 45 Rhizobium sp. RPA02 (EU123544) 100 SH42 SH26 99 61 75 SH35 R. gallicum UPRM8043B (AY166849) S. meliloti 4H41 (DQ333891) R. etli bv. phaseoli CFN42 (AF217268) 97 Rhizobium sp. CCBAU 65255 (DQ010038) 100 R. leguminosarum VF25­2 (AY664623) Rhizobium sp. CCBAU 83482 (EF050779) 100 98 89 SH36 SH44 SH9 Bradyrhizobium sp. CCBAU 65066 (EU056343) 0.05
Figura 7. Árbol filogenético del gen nodC demostró las relaciones de los rizobios de frijol en un suelo acido. RFLP HaeIII FD1­10 Figura 8 Una foto demostró los dos tipos de PCR­RFLP del 16S rDNA de los rizobios aislados de suelo neutral. 19 Impacto de los resultados 1. Rizobios de colorín. En esta parte, los resultados por primera vez indicaron claramente qué esta planta principalmente forma nódulos con las cepas de Bradyrhizobium, probablemente las de B. japonicum. Estos son la base para más investigaciones a fin de conocer el efecto de estas bacterias sobre el crecimiento de la planta. Mientras, dos alumnas realizaron su estudio de tesis de licenciatura. En este proyecto, teníamos problemas con la preservación de las cepas. A ­20˚C en 20% de glicerol, la mayor parte de las cepas de Bradyrhizobium se murieron. Por eso, necesitamos en un futuro detectar un método eficaz para preservar este tipo de bacteria. 2. Rizobios de frijol. Anteriormente, solo Rhizobium etli y R. gallicum se aislaron en México. La identificación de R. leguminosarum y R. giardinii en suelo ácido de México amplió la diversidad de rizobios asociados a frijol en México, e indicó que en suelo ácido, tal vez existen rizobios diferentes que en suelo neutro. Estos resultados demostraron que el pH de suelo puede ser un factor selectivo para las poblaciones de rizobios, y que distintos inoculantes de rizobio se necesitan en diferentes suelos. BIBLIOGRAFÍA SELECTIVA (no presenta)
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