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AVANCES SOBRE EL DESARROLLO DE VARIEDADES DE PAPA MEJORADAS GENÉTICAMENTE CON RESISTENCIA A LA POLILLA GUATEMALTECA (Tecia solanivora) Diego Villanueva, Javier Torres, Ana Valderrama, Esperanza Rodríguez y Rafael Arango. Unidad de Biotecnología Vegetal CIB - UNALMED LIMA , Marzo 24 de 2009 1 INTRODUCCIÓN 2 EL CULTIVO DE LA PAPA Cuarto alimento basico mundial Tercer lugar en producción nacional. 162.000 Ha cultivadas. 2.721.396 toneladas en el 2006 (Agrocadenas 2007). 90.000 familias. (Espinal et al., 2006). Cultivo disperso, aislado de pequeños y medianos productores. Uso intensivo de fertilizantes y plaguicidas. FUENTE: http://www.potato2008.org • Según FEDEPAPA-CORPOICA (1994) en el país se cuenta con 10 variedades de papa, Solanum tubesorum spp. andigena de importancia comercial. • Estas variedades son susceptibles a insectos plaga y enfermedades, siendo el producto agrícola que posee la mayor demanda de fungicidas e insecticidas (Martínez et al., 2004). • Entre los insectos plaga que afectan el tubérculo, se conocen el gusano blanco Premnotrypes vorax Hustache, la polillas Tecia solanivora Povolny y Phthorimaea operculella Zeller, además de chisas y trozadores (LópezÁvila, 1996). Tecia solanivora Povolny (Lepidoptera: Gelechiidae) Guatemala (1956) Venezuela (importación, 1983) Colombia (1985) Principales zonas de Producción: Cundinamarca, Boyacá, Santander, Antioquia, Nariño Foto: www.iicasaninet.net Ciclo Biológico de T. solanivora Huevo Larva Adulto Fotos: D. Villanueva Pupa Tubérculos de papa afectados por la polilla Pérdidas entre el 25 - 50% de la producción total. Afecta indiscriminadamente semilla almacenada y tubérculos en campo. Considerada como una de las plagas de mayor impacto económico en papa. Manejo Integrado de Plagas Prácticas Culturales Control Etológico Control Químico Control Biológico Bacillus thuringiensis Mejoramiento Genético Bacillus thuringiensis (Bt) • Formador de esporas • Inclusiones cristalinas (δendotoxinas) • Selectivamente tóxicas para ciertos ordenes de la clase Insecta, así como para algunos nemátodos y platelmintos Fotos: Sansinenea (2000) Ventajas de la Ingeniería Genética de plantas para expresar genes cry de Bt • Protección de tejidos internos de las plantas. • Protección independiente del tiempo. • Mayor estabilidad de las proteínas Cry. • Pocas aplicaciones de otros insecticidas. • Menor impacto ambiental que los insecticidas químicos. Bt no afectaría insectos benéficos; solo los que se alimentan del tejido interno de la planta. Plantas transgénicas de papa • Resistentes al ataque de Leptinotarsa decemlineata cry3A (Japòn, Australia, Filipinas, canadà: Consumo humano y animal) 1996-2004. Todas de Monsanto • Resistentes al ataque de Pthorimaea opercullella cry1Ac (Ebora et al., 1994) cry1Ab (Jansens et al., 1995, Cañedo et al., 1998) cryV (Li et al., 1998; Douches et al., 1998; Mohammed et al.,2000). OBJETIVO Desarrollar líneas transgénicas de variedades colombianas de papa, potencialmente resistentes a la polilla de la papa mediante la introducción de genes cry1Ac de Bacillus thuringiensis. 12 METODOLOGÍA 13 1. Ligación promotores + gen cry1Ac en vector pCAMBIA Ingeniería genética en E.coli 2. Transferencia a Agrobacterium T-DNA 3. Transformación de hojas 4. Regeneración en medio selectivo 3. Transformación de hojas 6. Evaluación molecular y biológica 5. Detección de transformantes Evaluación de la presencia de los genes integrados PCR Primers: Específicos para el gen cry1Ac y promotores Evaluación de la expresión y presencia de proteínas Cry RNA REAL TIME PCR No. Copias Transgen RT-PCR DAS-ELISA Establecimiento de la colonia de T. solanivora Londoño y Montoya (1994) Cámara Oviposición Cámara Incubación Posturas Cámara Adultos Bioensayos en laboratorio Larvas 1er instar Incubación (8 días) % Mortalidad Endurecimiento y cultivo bajo condiciones de invernadero Bioensayos en invernadero Análisis de resistencia Obtención de las líneas transgénicas de papa en campo a escala semicomercial BIOENSAYOS Peso total de tubérculos Peso de tubérculos afectados Porcentaje de daño Porcentaje de eficacia Porcentaje de control Pruebas con tubérculos transgénicos almacenados Pruebas de inocuidad Evaluación de la equivalencia sustancial tubérculos modificados genéticamente Vs tubérculos convencionales Evaluación del flujo de genes -Determinar movimiento del polen. -Evaluación de la sincronía de la floración de especies cultivadas con especies silvestres. -Compatibilidad sexual entre especies especies silvestres relacionadas. -Ecología de las especies receptoras. cultivo y RESULTADOS 25 Construcciones genéticas en E. coli CaMV35S cry1Ac NOS TER Ubiquitina cry1Ac Resistencia en la planta NOS Gen reportero TER CaMV35S cry1Ab NOS TER Ubiquitina cry1Ab Higromicina Gus Plus Higromicina GFP Kanamicina Gus NOS TER Ubiquitina cry1Ac NOS TER CaMV35S cry1Ac NOS TER CaMV35S 2X AMV cry1Ac NOS TER 1998 – 2000. El grupo de Biotecnología Vegetal UNALMED-CIB desarrolló un sistema de transformación mediado por Agrobacterium para las variedades de papa colombianas Diacol Capiro y Parda Pastusa, junto con un sistema de regeneración a partir de explantes de hoja. 2001 – 2004. Transformación de variedades de papa Diacol Capiro, Parda Pastusa, Pandeazúcar y Puracé con genes cry1Ab y cry1Ac (acuerdo de transferencia, Illimar Altosar). Promotores constitutivos del virus del mosaico del coliflor (Camv35S) y ubiquitina. Transformación de explantes de hoja Diacol Capiro, Parda Pastusa, Pandeazúcar y Puracé DETECCIÓN DEL GEN cry1Ac C- DC- DC MG PP- PP MG DETECCIÓN DE PROTEÍNAS Cry1Ac (0.02-1% de proteínas solubles de la hoja) (Jouanin et al., 1998). Cry3Bb1 protein in various plant tissues, were measured by ELISA and were found to vary between 0.01 to 0.081 ug/mg fresh weight of plant tissue, depending on the tissue type and the time of harvest. Fuente: Valderrama et al, 2007 Se definieron 36 líneas de las variedades de papa Diacol Capiro (11), Pardo Pastusa (8) y Pan de Azúcar (17), transformadas con el gene cry1Ac de Bacillus thuringiensis bajo la expresión de los promotores Ubiquitina y CaMV35S. Confirmación de la integración del gene cry1Ac en el genoma de las plantas, una muy buena expresión del mismo y adecuada cantidad de proteína Cry1Ac expresada en los tubérculos de plantas transgénicas. 2004-2006. Secuenciación de la región codificadora de los genes cry1Ac y cry2 de la cepa nativa CBT-12 de Bacillus thuringiensis ClustalW BIOEDIT Sequence Alignment Editor V7.0.5.2. (Hall, 1999) •Diseño de primers secuencias conservadas Detección del transgen por PCR en Tiempo Real • Sybr Green como Formato de detección • Cuantificación absoluta • Gen endógeno de una sola copia: Nitrato Reductasa (Harris et al, 2000) (230pb) – NitRedFw: 5‘ GAATGTGTGCAAGCCTCACAAG 3’ – NitRedRv: 5’ATGTCCATGGACTATGATCCAAG 3‘ • Gen cry1Ac (211pb) – LCM: 5' GTTCTGCCCAAGGTATCGAA 3‘ – RCM: 5' GCAACGATACGTTGTTGTGG 3’ Cuantificación Absoluta: Determinación del numero de copias del transgen INVERNADERO DE BIOSEGURIDAD INVERNADERO DE BIOSEGURIDAD CIB INVERNADERO DE BIOSEGURIDAD CORPOICA TESTIGO DC 40.5 DC 40.72 DC 40.7B DC 40.7B DC TESTIGO PP 40.a PP 28 PP 28.1 PP 40.3 PP Unidades de propagación Unidades de bioensayos Andenes periféricos Pocetas de recolección de lixiviados Pocetas de desinfección Puertas Figura 2: casa de malla Cubículos de la casa de malla Plantas sembradas en Corpoica tibaitatá Cámaras húmedas Primer aporque en PP 48 dds Plantas 8 dds Plantas 34 dds Segundo aporque en PP 60 dds Primer aporque en DC 60 dds CREACIÓN DEL PROGRAMA Mejoramiento no tradicional de semilla de papa (Solanum tuberosum) mediante el desarrollo de líneas resistentes a Tecia solanivora 2007-2010 Articula cuatro proyectos de investigación objetivos ligados al uso racional y mediambientalmente seguro de lineas transgenicas de papa. Primer proyecto: Validar la utilidad de las líneas transgenicas existentes a escala mayor (invernadero y campo) bajo condiciones confinadas. Segundo proyecto: Generar nuevas líneas resistentes, sin genes de resistencia a antibióticos. transgenicas Tercer proyecto: Estudiar la entomofauna visitante de los cultivos de papa y sus cargas polínicas, para conocer riesgo de dispersión de polen. Cuarto Proyecto: Determinar la diversidad de papas silvestres asociadas cultivos, así como el posible flujo genético existente entre estas. ENTIDADES PARTICIPANTES Corporación para Investigaciones Biológicas CIB Universidad Nacional de Colombia, Medellín Universidad Nacional de Colombia, Bogotá CORPOICA C.I. Tibaitatá Centro Internacional de la Papa (CIP) Federación Colombiana de Productores de Papa FEDEPAPA Secretaría de Agricultura de Antioquia. AgroBio ENTIDADES FINANCIADORAS COLCIENCIAS CEVIPAPA BOLSA NACIONAL AGROPECUARIA SECRETARIA DE AGRICULTURA DE ANTIOQUIA MINISTERIO DE AGRICULTURA Y DESARROLLO RURAL 51 PLÁSMIDOS DE INTERÉS PARA LA CONSTRUCCIÓN Formación de Tejido verde Muerte progresiva Regeneración de brotes Regeneración de tallo Especies silvestres con habitats cerca de campos cultivados S. bukasovii alrededor de Peruanita en un campo cerca de Huancayo, 3600 m.a.s.l (Junín). 2002 Amarilla peruana (S. goniocalix; nativa) S. bukasovii (silvestre) Amarilla del centro (S. goniocalix; nativa) nativa) S. bukasovii (silvestre) Fuente: Scurrah et al. 2007 Diversidad de papa Entomofauna Asociada al cultivo de la papa FLUJO DE GENES GRACIAS POR SU ATENCIÓN!!!! 58
