Download Ver/Descargar Memoria Final del Proyecto (PDF

MEMORIA FINAL DEL PROYECTO :
ESTUDIO DE LOS GENES SUPRESORES TUMORALES
LKB1 Y BRG1 EN TUMORES DE MAMA DE ORIGEN
ESPORADICO Y FAMILIAR.
Montse Sanchez-Cespedes, Genes and Cancer Group, Cancer Epigenetics and Biology
Program (PEBC), Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL). 08907, Hospitalet de
Llobregat, Barcelona, Spain
El
proyecto financiado por la Fundación Sandra Ibarra ha dado lugar a los siguientes
resultados:
1.- Determinación de la presencia de mutaciones en BRG1, en línea germinal de
pacientes con cáncer de mama familiar negativas para BRCA1 y BRCA2
Se ha determinado la presencia de mutaciones en BRG1 en sangre periférica de 15
pacientes con historial de cáncer de mama familiar, negativos para mutaciones en los genes
BRCA1 y BRCA2 . El material de análisis procedía de colaboraciones con el Dr Javier Benítez
(del Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas) y el Dr. Ignacio Blanco (del Institut
Catala d'Oncologia).
Para ello se procedió a la secuenciación automática y directa del DNA: 33 exones
codificantes (zonas codificantes y regiones intrónicas adyacentes)
Resultados:
 No se identificó ninguna mutación germinal
 Se identificaron diversos SNPs (del inglés single nucleotide polymorphisms)
 Se identificaron variantes intrónicas de significado biológico desconocido que muy
probablemente no estén asociadas a la enfermedad.
Se adjunta una tabla con los resultados (Tabla 1). En la figura 1 se muestra uno de los
polimorfismos identificados.
Estudio de BRG1 y LKB1 en cáncer de mama
1
Tabla 1: Descripción de las variantes obtenidas en el análisis de mutaciones en BRG1 en sangre periférica de
pacientes con cáncer de mama familiar y negativas para mutaciones en BRCA1 y BRCA2.
Figura 1: Cromatograma mostrando una de las variantes identificadas en una de las
pacientes con cáncer de mama familiar. Este cambio constituye un polimorfismo sin
relevancia funcional
Estudio de BRG1 y LKB1 en cáncer de mama
2
2.- Evaluación de la frecuencia de inactivación bi-alelica en los genes supresores
tumorales BRG1 y LKB1 en tumores de mama de origen esporádico.
Se ha seleccionado un panel de 10 líneas celulares de cáncer de mama. Dada que la presencia
de mutaciones en BRG1 y LKB1 origina ausencia de proteína en un 90% de los casos (RodriguezNieto S, Sanchez Cespedes M. Carcinogenesis 2009) se
procedió en primer lugar en realizar western-blot de
los mencionados supresores tumorales en el panel de líneas celulares de cáncer de mama
seleccionadas (BT-549, UACC3199, MDA-MB-231, MDA-MB-435, MDA-MB-436, MDAMB-453, SK-BR-3, Hs578T, ALAB, MCF7) (ver ejemplo en Figura 2). Además, y en paralelo,
se realizó secuenciación automática de cada uno de los exones codificantes de las líneas
celulares.
Figura 2: Western-blot que muestra la presencia de proteína BRG1 en las líneas
celulares de cáncer de mama indicadas. Como control de carga se utilizó GAPDH,
tal y como se indica en la figura.
Los resultados derivados del proceso de screening permitieron identificar mutaciones
inactivadoras en dos de las líneas estudiadas. Las líneas Hs578T y ALAB. La línea Hs578
presentaba un cambio de nucleótido en el exón 4 tal y como se indica en la figura 2. Este
cambio de aminoácido se presenta en una región altamente conservada. Por su parte la línea
ALAB presentaba un cambio a un stop prematuro (exón 10) que originaba una proteína
truncada (Fig.3).
Estudio de BRG1 y LKB1 en cáncer de mama
3
Figura 3. Representación esquemática de los exones del gen BRG1 en la que se muestra la localización de las
mutaciones en las líneas celulares de cáncer de mama Hs578T y ALAB
No se identificaron mutaciones en el gen LKB1 en las líneas celulares estudiadas.
3.- Estudio funcional de las mutaciones en BRG1
Además del proyecto relacionado con la Fundación Sandra Ibarra, otro proyecto que llevamos
a cabo en el laboratorio es el estudio funcional y significado biológico de la pérdida del gen
BRG1 en el cáncer de pulmón. En relación a este estudio hemos llevado a cabo observaciones
muy interesantes entre las cuales cabe destacar que la inactivacion de BRG1 en el cáncer de
pulmón conlleva una pérdida de respuesta a la señalización por ácido retinoico. El ácido
retinoico es una de las principales formas activas de la vitamina A y se considera una hormona
esteroide ya que se une a receptores intracelulares específicos que posteriormente se unen al
DNA y afectan a la síntesis de proteínas implicadas en la regulación del crecimiento y la
diferenciación celular. El acido retinoico es fisiológicamente muy relevante, especialmente
durante el desarrollo embrionario. En el organismo adulto juega también un papel muy
importante en varios procesos fisiológicos relacionado con la diferenciación e inflamación,
entre otros procesos. Teniendo en cuenta estas observaciones de nuestro grupo en cáncer de
pulmón, y dentro del contexto del proyecto financiada por la Fundación Sandra Ibarra, nos
propusimos comprobar si las mutaciones en BRG1 en cáncer de mama también conllevan una
pérdida de respuesta al ácido retinoico.
Para ellos seleccionamos la línea Hs578T y la
transfectamos por una lado con un vector que contenía BRG1 salvaje y otro que tenía una
mutación (E668-Q758 del.)
(Medina et al. 2008).
Posteriormente, tratamos a la línea con ATRA
(acido trans-retinoico) a 0.1 y 0.5 micromolar. Con el objeto de evaluar la respuesta a ATRA se
eligió un marcador CYP26A1, que es un enzima que metaboliza dicho compuesto y que está
establecido como una diana muy general y especifica del tratamiento con ATRA. Es decir el
Estudio de BRG1 y LKB1 en cáncer de mama
4
tratamiento con acido retinoico aumenta los niveles del CYP26A1
(Rochette-Egly C et al. 2000).
Los
resultados mostraron claramente que las células sin BRG1 o transfectadas con la forma
mutante de BRG1 eran refractarias al tratamiento con ATRA (es decir no aumentaban los
niveles del CYP26A1) mientras que al restaurar la expresión de BRG1 salvaje las células
recuperaban su capacidad de incrementar los niveles del CYP26A1, y por lo tanto, de
responder al ácido retinoico (Fig.4).
Figura 4. Q-RT-PCR que muestra los
niveles del marcador CYP26A1 en
respuesta al tratamiento con ATRA en
la línea de cáncer de mama Hs578T
después de reintroducir la forma BRG1
wild type (wt) y mutante (Mut). Se
observa que la forma wt, pero no la
mutante es capaz de incrementar los
niveles del CYP26A1 y, por lo tanto,
recupera la capacidad de responder a
ácido retinoico.
Relative levels of CYP26A1
Hs578T
0
0.1
0.5
ATRA (micromolar)
Los resultados de este trabajo constituyen una parte de un trabajo que estamos preparando
para enviar a publicar
(Romero et al.. In preparation)
y en el que se agradece la contribución de la
Fundación Sandra Ibarra.
4.- Estudiar el posible papel de BRG1, así como de otros miembros de la familia
SWI/SNF (BRM principalmente), en la predisposición a cáncer de mama familiar.
Teniendo en cuenta la presencia de mutaciones inactivadoras en el gen supresor BRG1, así
como su relevancia funcional, otro de los objetivos que nos planteamos en el presente trabajo
fue buscar otros genes de la familia SWI/SNF que pudieran estar genéticamente inactivados en
cáncer de mama. En primer lugar seleccionamos los genes de interés mediante una búsqueda
exhaustiva de deleciones homocigóticas en regiones que contuvieran miembros clave de la
familia SWI/SNF. Para ellos buscamos en bases de datos públicas (Sanger, principalmente) y
analizamos los datos procedentes de microarrays de SNPs en líneas celulares de cáncer de
Estudio de BRG1 y LKB1 en cáncer de mama
5
mama. De este análisis varios genes se mostraban candidatos a estar alterados en cáncer de
mama, de entre ellos seleccionamos el gen BRD7, ya que detectamos en la base de datos una
delecion homocigótica en una línea celular de cáncer de mama (CAMA1). Para este análisis
realizamos secuenciación automática de todos los exones codificantes (son 17) en el siguiente
panel de células: BT-474, BT-549, COLO-824, HCC-1143, HCC-1937, UACC-812,Hs-578T
HBL-100, MCF7, MDA-MB-157, MDA-MB-231, MDA-MB-436, MDA-MB-453, UACC3199, SKBR-3, T47D ,ZR-75-2. Se han detectado diversos polimorfismos, que posiblemente
no tengan ninguna importancia funcional en el desarrollo del cáncer de mama, ya que o bien
son intronicos, alejados de las zonas consenso para splicing o bien no cambian el aminoácido.
Tan solo hemos identificado un cambio que de lugar a una sustitución (M548I). El cambio es
heterocigoto, por lo que es improbable que constituya una mutación. Así pues, nuestros datos
indican que el gen BRD7 es improbable que este genéticamente alterado en el cáncer de mama,
al menos con una frecuencia elevada.
Conclusiones
En el presente trabajo hemos demostrado que las alteraciones en BRG1 no parecen contribuir
de forma significativa al cáncer de mama familiar, aunque si que son relevante en el desarrollo
del cáncer de mama de origen esporádico, ya que alrededor de un 20% de estos tumores
presentan inactivación genética de BRG1. Además, hemos demostrado que la inactivación de
BRG1 en el cáncer de mama, afecta a la respuesta de las células al tratamiento con ácido
retinoico, volviendo a las células refractarias a la actividad de dicho compuesto. Asimismo,
nuestros resultados muestran que la restitución de BRG1 en líneas deficientes revierte la
resistencia a dicho tratamiento. Por otra parte, las mutaciones en otro gen supresor importante,
LKB1, no son frecuentes en el cáncer de mama.
En definitiva, BRG1 juega un papel importante en el desarrollo de cáncer de mama de origen
esporádico, por lo que resulta de vital importancia caracterizar en profundidad el perfil
mutacional y funcional de BRG1 en el cáncer de mama así como identificar otros miembros
del complejo SWI/SNF que puedan contribuir al este tipo de cáncer.
Estudio de BRG1 y LKB1 en cáncer de mama
6
Referencias
-Medina PP, Romero OA, Kohno T, Montuenga LM, Pio R, Yokota J, Sanchez-Cespedes M.
(2008). Frequent BRG1/SMARCA4-inactivating mutations in human lung cancer cell lines.
Hum. Mut. 29, 617-622.
-Rochette-Egly C, Plassat JL, Taneja R, Chambon P. (2000). The AF-1 and AF-2 activating
domains of retinoic acid receptor-alpha (RARalpha) and their phosphorylation are
differentially involved in parietal endodermal differentiation of F9 cells and retinoid-induced
expression of target genes. Mol. Endocrinol. 14, 1398-1410.
-Rodriguez-Nieto S, Sanchez-Cespedes M. (2009). LKB1 and BRG1, tales of two tumor
suppressors on chromosome 19p. Carcinogenesis .
-Romero OA et al. Gene inactivation of the tumor suppressor BRG1 in cancer prevents cell
differentiation by disrupting MYC activity and nuclear receptor signalling. Manuscript in
preparation. NOTA: EN ESTE MANUSCRITO SE AGRADECE LA FINANCIACION
PROPORCIONADA POR LA FUNDACION SANDRA IBARRA.
Barcelona 21 de Diciembre, 2010
Montse Sanchez-Cespedes, PhD
Genes and Cancer Group Leader
Programa Epigenetica i Biologia del Cancer-PEBC
Hospital Duran i Reynals
Av. Gran Via del'Hospitalet, 199-203
08907-Hospitalet de Llobregat-Barcelona, Spain
email: [email protected]
Phone number: +34.93.260.71.32.
Fax number: +34.93.260.72.19
Estudio de BRG1 y LKB1 en cáncer de mama
7