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Convocatoria de Ayudas a la Investigación en Cáncer de Mama
Fundación Sandra Ibarra de Solidaridad frente al Cáncer
MEMORIA FINAL DEL PROYECTO
Efectos biológicos de las quinasas VRK en cáncer de
mama en función de los fenotipos HER2/erbB2 y Receptor
de estrógeno
Investigador responsable
Pedro Alfonso LAZO-ZBIKOWSKI TARACENA
Pedro A. Lazo
Firmado digitalmente por Pedro A. Lazo
Nombre de reconocimiento (DN): cn=Pedro A. Lazo,
o=CSIC, ou=IBMCC, [email protected], c=ES
Fecha: 2010.01.27 18:08:30 +01'00'
SALAMANCA
Febrero 2010
Resumen del proyecto
El cáncer de mama desde un punto de vista de su pronóstico y estrategias terapéuticas se
decide en base fundamentalmente a dos marcadores, el receptor de estrógeno y/o
progesterona, o el receptor erbB2 (HER2). El primero es un indicador de mejor pronóstico
pues permite la utilización de terapias basadas en inhibidores específicos con los antiestrógenos (tamoxifeno o derivados más recientes). Por otra parte los tumores de mama
erbB2 positivos son de más difícil manejo clínico. Nuestro laboratorio identifico en los
últimos años una nueva familia de proteínas humanas, VRK, que son moduladoras de las
rutas de señalización por MAP-quinasas, las cuales son un elemento en la señalización de
erbB2. Nuestro estudio en cáncer de mama nos han permitido identificar una correlación
inversa entre niveles de erbB2 y VRK lo que sugiere una interacción funcional entre estas
dos rutas. En este proyecto utilizando diversas técnicas moleculares hemos podido
identificar que la proteína VRK2 controla el nivel de activación de transcripción de
elementos de respuesta a suero (SER) en respuesta a factor de crecimiento epidermal
(EGF) o su receptor que está sobreexpresado en cáncer de mama. Altos niveles de VRK2
inhiben la señal, y bajos niveles la permiten. Se ha realizado un análisis sistemático de la
ruta de señalización para identificar el posible mecanismo de acción. VRK2 inhibe la
respuesta transcripcional no solo de ErbB2, sino también de oncogenes activados como
RasG12V (común a muchos carcinomas) o B-RafV600E (característica de melanoma). Hemos
identificado que VRK2 bloquea la señal por medio de una interacción directa con una
proteína de ensamblaje, KSR1, que es común a todos los elemento de la ruta. Este efecto
afecta a la ruta de respuesta a factores de crecimiento o mitogénica, pero no a la ruta de
supervivencia. De este modo en tumores ErbB2 positivos, altos niveles de VRK2
frenarían su expansión y esta es probablemente la razón de su regulación negativa en estos
tumores. En el mismo trabajo hemos identificado una correlación positiva con ER, que
identifica un subgrupo de peor pronóstico y que será objeto de un futuro estudio. VRK2
permite identificar subgrupos de pacientes con cáncer de mama, a partir de los marcadores
ya utilizados, pero su significación clínica necesita de un seguimiento clínico de varios
años.
RESULTADOS
Correlación inversa entre la proteína VRK2 y erbB2 en cáncer de mama humano
Como punto de inicio se determino la posible correlación de los marcadores de cáncer de
mama con utilidad clínica como ErbB2, receptor de estrógeno (ER) y receptor de
progesterona (PR) con las proteínas de la familia VRK, en este trabajo nos centramos en la
proteína VRK2. Se estudió una serie de 136 carcinomas de mama por inmunohistoquímica. El
análisis reveló una correlación inversa entre los niveles de VRK2 y el receptor ErbB2
(Figura1).
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FIGURA 1. Correlación inverasa entre los niveles de erbB2 y VRK2 en 126 casos de cácer de mama.
A-izda. casos ErbB2 positivos. A-Dcha. casos ErbB2 -.nverse correlation between VRK2 and ERBB2
in human breast carcinomas. B. Diferencia en al distribución de casos.
Los niveles altos de VRK2 bloquean la señal de respuesta a oncogenes
Para determinar si VRK2 afecta a señalización por rutas de MAPK, se utilizó como sistema
reportero el promotor de respuesta a suero (SER) unido a luciferasa. Las células fueron
estimuladas con factor de crecimiento (EGF), ErbB2 (oncogén sobreexpresado en cáncer de
mama), RasG12V (la mutación más frecuente en cáncer), RafV600E mutación en melanomas)
y una construcción de MEK activa constitutivamente. Estas proteínas se utilizaron porque
representan los pasos consecutivos en la ruta de señalización que activa al elemento de
respuesta a suero. La sobrexpresión de VRK2 inhibe la activación de transcripción por
cualquiera de estas proteínas de manera que es dosis dependiente (Fig.2). Esto indica que
VRK2 controla esta ruta de señalización celular actuando a través de un paso localizado casi
al final de la misma. Si solo se hubieran afectados los primeros, pero no los últimos indicaría
que actúa a un nivel más próximo al receptor. Esta localización del sitio de actuación es
importante pues indica que puede ser relevante en tumores de diferentes tipos y no sólo en
cáncer de mama.
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FIGURA 2. La activación de transcripción por elementos SRE indicudo por los oncogenes ERBB2,
RAS and RAF oncogenes es inhibida por VRK2A de una manera dosis dependiente. overexpression
to oncogenic ErbB2 (A), H-RasG12V (B left), B-RafV600E (C) and constitutively-active MEK1(D) in MCF7
cells. This effect is independent of VRK2A kinase activity as shown in B, where a kinase-dead
VRK2AK169E also inhibits H-RasG12V activation (B, right). * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001
(unpublished). The expresion of different proteins is shown in immunoblots at the bottom.
Efecto de VRK2 sobre las rutas de señalización en respuesta a los oncogenes ErbB2 o
Ras
La ruta de señalización iniciada en ErbB2 puede tras un tramo común divergir hacia las rutas
mitogénicas de MAPK, de supervivencia como AKT o pleiotrópicas como RSK. Alto nivel de
VRK2 en presencia de estos oncogenes no afecta a la ruta de AKT, ya que no se detectan
cambio en su fosforilación (Fig. 3). Sin embargo la sobrexpresión de VRK2 reduce la
fosforilación de P-erk, y de uno de sus dianas RSK (Fig. 3). VRK2 no afecta a la fosforilación
de MEK1. Estos resultados indican que VRK2 está actuando entre las quinasas MEK1 y
ERK1 (Fig. 3), bloqueando la transmisión de la señal entre ambas y así se puede explicar la
inhibición de la activación transcripcional descrita en la sección anterior.
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Figure 3. Efecto de VRK2 sobre diferentes proteínas en repuesta a los oncogenes ERBB2 y RASG12V. Se determino por immunoblot el estado de fosforilación de proteínas consecutivas en la ruta de
señalización, o de otras proteínas (myc y cyclin D1) como controles.
Bajos niveles de VRK2 incrementan la respuesta a EGF
El efecto de VRK2 sobre la respuesta transcripcional mediada por serum-response element
fue determinada en líneas celulares de mama. Primero demostramos que la estimulación por
EGF es inhibida de manera dosis dependiente por cantidades crecientes de VRK2 (Fig.4A).
Para determinar si la eliminación de VRK2 produce el mismo efecto que predice su
sobreexpresión, la proteína VRK2 endógena fue casi totalmente eliminada por medio de
”knockdown” usando siRNA específicos. Como se muestra en la Figura 4B, la eliminación o
bajada de niveles de VRK2, permite una mayor señalización en respuesta a EGF. Esto es lo
que parece estar ocurriendo en los casos de cáncer de mama con bajo nivel de VRK2.
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Figura 4. A. Inhibición de la respuesta transcripcional a EGF por medio de dosis crecientes de VRK2.
B. Incremento de la respuesta transcripcional a EGF por eliminación por RNA de interferencia
específico para VRK2.
VRK2 por su interacción con la proteína scaffold KSR1 interfiere con la señalización
por MAPK.
El mecanismo por el que actua VRK2, se situa entre las quinasas MEK1 y ERK1. Esto indica
que un candidato importante puede ser una de las proteínas de ensamblaje de complejos de
señalización por MAPK. Primero determinamos si la respuesta a EGF era afectada por dos de
estas proteínas, JIP1 y KSR1. La eliminación de JIP1 no afecta a la respuesta, pero la
eliminación de KSR1 hace que la célula no responda al factor de crecimiento (Figure 5A). En
base a esto comprobamos que la activación en caso del control seguía siendo sensible a la
sobreexpresión de VRK2, pero no en el caso de KSR1, pues la respuesta ya se ha eliminado
previamente (Fig. 5B).
El siguiente paso consite en demostrar que VRK2 es capaz de interaccionar con componentes
del complejo de señalización ensamblado en KSR1. Para ello se utilizaron ensayos de pulldown o inmunoprecipitación. Primero demostramos que VRK2 es capaz de interaccionar
directamente con KSR1, tanto transfectado como endógeno(Figura 5C). Asímismo
demostramos que VRK2 interacciona con MEK1 (Figure 5D), pero no con ERK1. Estos
resultados nos sugieren que la triple interacción KSR1-MEK1-VRK2 impide la fosforilación
de ERK, previniendo su activación y el efecto sobre transcripción de este.
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Figure 5. A. La perdida de la scaffold KSR1 (derecha), pero no JIP1 (izda.) bloquea la activación de
transcripción en respuesta a EGF. B. VRK2 bloquea la activación de transcripción (izda.), pero si se
elimina KSR1, ya no puede hacer su efecto (dcha.). C. VRK2 interacciona con KSR1 transfectada
(izda.) o endógena (dcha.). D. VRK2 interaciona con MEK1.
NOTA
Los resultados de este trabajo serán enviados a publicar próximamente y se enviará una copia
de la misma a la Fundación cuando esté disponible públicamente.
En los trabajos resultantes se agradece la contribución realizada por la Fundación.
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