Download temperatura, ß-glucanos, probióticos y productos

Criterios técnicos para usar
inmunomoduladores ,
CENAIM - ESPOL
en el cultivo de camarón (temperatura, ßglucanos, probióticos y productos naturales)
CENAIM-ESPOL
Jenny Rodríguez, Gabriela Agurto, Cecilia Tomalá,
Cristobal Domínguez, Rosa Malavé, Ramiro
Solorzano, Bonny Bayot
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CONTENIDO
Sistema inmune
Temperatura,
ß-glucanos,
Probióticos
Productos naturales
Conclusion
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Qué implica ser un camarón
peneido
• Sistema circulatorio abierto
• Osmoreguladores, eurohalinos
• Heterotermos (Temperatura de bienestar
(27 – 30°C)
• Sistema de defensa innnato. Creciente
evidencia de inmunidad adaptativa
• Evolutivamente: exitosos
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sistema circulatorio
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Bacterias, hongos y
levaduras poseen
(patrones) en su pared que
son reconocidos por el
sistema inmune
PMAP
ß-glucanos
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Tomado de Barraco, 2007
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Nódulos: Tejido conectivo y
corazón
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LESIONES POR BACTERIA
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Organo linfoide. Tejido de limpieza de
la hemolinfa
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• Sistema tubular ramificado ciego
• Conectado a la aorta. La hemolinfa es filtrada a fuerte presión
• Los hemocitos circulan desde el lumen, atraviezan la matriz
estromal hacia el hemocele.
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Camarón cultivado
Los sistemas de producción someten a los animales
cultivados a condiciones particulares
El manejo de enfermedades en los sistemas de
producción es muy complejo
VIBRIOS
TSV
WSSV
IHHNV
Productor??
VIAS PARA
DISMINUIR O ELIMINAR
INCIDENCIA?? MANEJO
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¿Alternativas para enfrentar
patógenos?
Inmunoestimulantes
Temperatura
Probióticos
Antioxidantes
Phagos
Inhibidores de Quoeum Sensing
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Se puede influir sobre la
respuesta inmune del camarón?
Cómo?
Cómo medirla?
Significa algo en términos de
supervivencia y crecimiento?
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Elementos para influir sobre el
sistema inmune
• Temperatura: Efecto resistencia (Vidal et al., 2001) y
apoptosis (Granja et al., 2003). No ejerce efecto sobre
prevalencia pero si sobre patogenicidad (Sonnenholzner et
al., 2002, Bayot, 2006)
• Probióticos: Vibrio alginolyticus/Ili (Morales). Efecto sobre
respuesta inmune aplicación en larvicultura (Espinosa,
2003). Vibrio hepatarius, Bacillus sp. Proliferación e
Infiltración de hemocitos. Crecimiento (Gullian et al.,
2003)
• β-1,3/1,6-glucanos: Efecto sobre respuesta inmune (Chang
et al., 2000), prevalencia (Chang et al., 1999).
• Antioxidantes
Cuando intervenir para
prevenir
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Periodo de incubación
Periodo latente
Exposición al
factor
Procesos
patológicos
detectables
Prevención
primaria
Enfermedad
clínica
Prevención
secundaria
Decrecimiento de
la producción
Prevención
terciaria
(terapia)
Raceways
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Precría
Engorde
Maduración
Larvicultura
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Inmunoestimulacíon
Los inmunoestimulantes
Levadura
Bacteria
Gram +
Bacteria
Gram -
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β-glucanos: estructura
molecular (β -1,3/ β -1,6)
PMAP
Fuentes: Hongos (Maitake, shiitake,
lentinan)
Levadura de pan: Producto de pared
celular desproteinizada y libre de
manano
Inmunoestimulación
Nuestra experiencia
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Inmunoestimulante, β-glucanos
• Modificación significativa de algún parámetro
inmunitario (Generación de superóxido, actividad
PO, hemograma, actividad antibacteriana del
plasma, concentración de proteínas plasmáticas).
• Incremento de la supervivencia en ensayos de
desafío realizados en laboratorio (WSSV).
• Incremento de supervivencia en piscina
• Estandarización de un protocolo y una dosis en
ensayos de campo.
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PRODUCCION DE
SUPEROXIDO
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Efecto de los B-glucanos
sobre la dispersión de tallas
RECOMENDACIONES
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● Elegir bien el producto, verificar que no tenga contaminantes
● Menos es más
● Señal continua de inmunoestimulación puede generar
agotamiento, tolerancia o mecanismos de retroalimentación
Cuando aplicar β-glucanos:
Seguir ciclo de muda
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2 días antes de la
luna llena y 6
después
7 días después
del novilunio
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TEMPERATURA
¿Cual es la temperatura de bienestar para
Penaeus vannamei?
• Algunos datos
– Es un animal ectothérmico
– Vive en aguas tropicales (22-28˚C)
– Según Arriaga en el estuario del Golfo de Guayaquil la temperatura
del agua puede llegar a 31˚C en los meses más cálidos.
– Según la literatura prefiere un rango de 26 a 31,5˚C
– Las supervivencias más altas en piscina se dan entre octubre y
diciembre (piscinas sembradas desde julio).
– Larvicultura a altas temperaturas favorece desarrollo larvario (>32˚C)
– Exhibe resistencia a patógenos virales a altas temperaturas mayores a
32 ˚C en desafíos.
– Temperatura igual o superior a 32°C, es temperatura de estrés
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Ser un animal ectotérmico,
implica:
• Enzimas celulares tienen la habilidad de trabajar
en un rango de temperatura.
• Tasa metabólica baja
• Temperatura de bienestar-rango- (funcionamiento
celular óptimo)
• Temperatura de tolerancia (es necesario
adaptarse, síntesis de proteínas chaperonasHSP)
• Temperatura no tolerable, letal (para camarón
>35˚C)
ESTACIONALIDAD EN PRODUCCION
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Supervivencias mensuales (17 000 ciclos de cultivo)
Tomado deSistema de alerta epidemiológico (SAEMA), Bayot 2009
Los estudios de CENAIM sobre resistencia
CENAIM - ESPOL al WSSV en función de la temperatura
• Epidemiológico: En estudios sobre transmisión, patogenicidad y
virulencia, Gainza (2006) encontró que la hipertermia aumenta
significativamente la prevalencia de WSSV, siendo 31˚C la
temperatura de menor prevalencia.
• Terapéutico: Utilizar la temperatura como un factor para paliar
los efectos del WSSV; estos estudios han incluido el uso
invernaderos para mantener altas temperatura en precría y
engorde y la combinación de temperatura con inmunoestimulantes
a fin de mantener bajas prevalencias en PLs (precría): β-1,3/1,6glucanos aplicados a 31˚C tienen un efecto negativo sobre la
prevalencia de WSD.
• Fundamental. Determinar el rol del estrés térmico y la proteína de
choque térmico HSP 70 en la resistencia del camarón al WSD.
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31˚C tempertura de baja
prevalencia
Bayot y Gainza, 2006
Temperatura vs. Prevalencia a WSSV
(Rodríguez Rene, 2003)
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tarde
mañana
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¿Qué temperatura prefiere el
camarón?
Combinar estrategias para potenciar efectos
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Temperatura de bienestar y estrés térmico
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En temperaturas de
bienestar, el virus se replica
27˚C
En piscina
Brotes de WSD
Alta
supervivencia
El peor escenario
28-31˚
32˚C
Baja prevalencia
Alta virulencia
Excelente
replicación viral
En laboratorio
Baja virulencia
Alta prevalencia
Estrés térmico
perturba la
biosíntesis de
proteína y afecta al
virus
Desafío con WSSV a diferentes temperaturas.
SUPERVIVENCIA
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Tomado de Sonnenholzner et al., 2001
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Comportamiento de hemocitos
circulantes. Desafío con WSSV en
condiciones de hipertermia
Tomado de Sonnenholzner et al., 2001
CENAIM - ESPOL
Immunology. Mar 2000; 99(3): 334–337.
doi: 10.1046/j.1365-2567.2000.00002.x
PMCID: PMC2327171
Heat shock proteins refine the danger theory
S M Todryk,* A A Melcher,† A G Dalgleish,* and R G Vile†
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This article has been cited by other articles in PMC.
Evidence is mounting to support the theory that ‘danger’ associated with
tissue damage and stress is a level of control of antigen-specific immune
responses. Heat shock proteins are emerging as key danger signals, but
their influence on immune responses is not a simple one, particularly in
affecting antigen processing and presentation. Such influences may
extend to numerous immunological situations. Potential exists for heat
shock proteins to be utilized in immune modulation, especially in cancer
immunotherapy.
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En cultivo de camarón. Síndrome de la zoea, síndrome de
la gaviota, síndrome del verano, AHPNS
Inhibición del Quorum sensing
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Quorum
Sensing
Control por quorum
sensing de la
bioluminiscencia en V. fischeri. Cuando
la densidad celular es baja, la
concentración de la molécula
autoinductora, producto de la actividad
sintetasa de LuxI, es baja y los genes
estructurales del operón lux no son
transcritos. La existencia de una mayor
densidad celular supone una mayor
producción del autoinductor. Cuando la
concentración alcanza un umbral, la
molécula autoinductora se une a su
receptor intracelular (LuxR),
activándolo. El receptor activado se une
al promotor (caja lux) y se activa la
transcripción de los genes del operón
lux, propiciándose la producción de luz.
Serrano et al, 2010
Detector del Quorum
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●
Hola
Hola
Hola
●
Hola
Hola
Hola
Hola
●
Somos muchasPodemos coordinar un
ataque que rompa las
defensas del hospedero
Somos malas - Vamos a
expresar genes de
virulencia o toxinas
Aquí estamos muy bien formaremos biopelículas
y nos quedaremos
¿Antibióticos son una alternativa?
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Pocos antibióticos de uso permitido. Bajos
niveles residuales permitidos
Presión de selección
No solo se seleccionan cepas
resistentes. También se
eliminan posibles
competidoras
Resistentes
Susceptibles
Niveles de susceptibilidad
PROBIOTICOS
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Recomendaciones para el uso
de probióticos comerciales
• Los probióticos deben competir contra vibrios, bien
adaptados al medio y al hospedero. Selección y evaluación
son requisitos indispensables
• Evaluar mediante análisis en laboratorios certificados, al
menos una vez, que el el producto seleccionado se adapta
al medio
• Utilizar melaza no estéril para hacer crecer probióticos
comerciales, deriva en crecimiento de bacterias de la
melaza
• No repicar los productos. Solo un laboratorio con cámaras
de flujo de laminar, congeladores de -80C y personal
calificado puede asegurar que no habrá contaminación
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Probióticos
qué usar
Cómo seleccionarlos??
• Recolección de información.
• Adquisición de potenciales cepas probióticas (lo más
adecuado, cepas del organismo, de su ambiente,
SIMBIONTES).
• Preselección de Cepas:
– Evaluación de las cepas contra patógenos (ensayos
in vitro e in vivo).
– Evaluación de la patogenicidad de las cepas.
– Evaluación del efecto de las cepas sobre el huésped
(crecimiento supervivencia, respuesta inmune).
• Herramientas para poder hacer el seguimiento en
sistemas de producción
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LARVICULTURA
– Cepa seleccionada de
cultivo de larvas exitoso
(Morales, no publicado).
ILI-Vibrio alginolyticus
– P62-P64, aisladas de
camarones silvestres.
– C1 aislada de piscina
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CENAIM
ESPOL
Juveniles tratados con
probióticos (P62, P64, Ili).
(Gullian et al., 2003)
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Adaptadas al hospedero
Bacterias probióticas vs
bactarias patógenas
Gullian, Thompson y Rodríguez, 2004. Selección de
bacterias probióticas con propiedades inmunoestimulantes
Adaptadas al hospedero
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Efecto antagonista de bacterias
probióticas contra aislados
luminiscentes
Indíce inmunitario de juveniles
tratados con probióticos
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Los probióticos pueden controlar la carga
bacteriana de las artemias
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En mysis los camarones son alimentados con artemias. Esta práctica
introduce una fuerte carga bacteriana al sistema
Biodescubrir otras bacterias
CENAIM - ESPOL
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CENAIM-ESPOL tiene 4 bacterias validadas como probióticos en ensayos de
laboratorio y campo.
Seguimos en la búsqueda de nuevas bacterias marinas capaces de tener un
efecto antagónico sobre vibrios
Bact. 18
Bact. 11
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Supervivencia
Lbs/ha
Peso
Ps. 17
Ps. 18
Control
79,2 ± 5,2
66,3±6,8
63,0±6,7
1979±131
1658±170
1575±168
9,9±2,0
10,8±3,4
9,4±2,4
Productos naturales
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•
•
•
•
•
•
la necesidad de nuevas drogas terapéuticas para uso humano, veterinario, e incluso
cosmético ha provocado un creciente interés en la búsqueda de biomoléculas. Las
plantas superiores representan una fuente potencial de nuevos agentes microbicidas,
antioxidantes, inmunomoduladores, antitumorales.
Compuestos vegetales, tales como aceites volátiles, taninos, compuestos fenólicos,
saponinas, y polipéptidos alcaloides han mostrado ser alternativas eficaces a los
antibióticos.
Isoflavonoides, indoles, fitoesteroles, sesquiterpenos, alcaloides, taninos, una
variedad de vitaminas y minerales traza, funcionan como coenzimas antioxidantes
que pueden proteger los componentes de las células del estrés oxidativo.
las lectinas vegetales se muestran eficaces para bloquear virus envueltos.
Oligosacáridos y polisacaridos (pectinas, fructanos, glucanos) tienen propiedades
inmunoestimulantes
Múltiples aceites esenciales o extractos naturales tienen propiedades microbicidas o
inhiben la comunicación bacteriana a dosis subletales
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ANTIBACTERIALES
✓Algas marinas y de agua dulce
CENAIM
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INMUNOESTIMULANTES
ANTIOXIDANTES
✓Astragalus (Astragalus radix),
✓Orégano
✓Ajo (Allium sativum)
✓Noni
✓Tomillo real (Satureja hortensis
✓Oregano (Origanum vulgare)
✓Ajo
✓ Noni (Morinda citrifolia),
✓Arándano (Vaccinium myrtilus)
✓ Hisopillo (Satureja montana L).,
✓Tomillo (Thymus vulgaris),
✓Etc
✓Tomillo aguja (Thymbra spicata)
✓Romero (Rossmarinus officinalis),
✓Salvia (Salvia officinalis),
✓Albahaca (Ocinimum basilicum),
✓Granada (Punica granatum),
✓Guayaba (Psidum guajaba),
✓Extracto crudo del pimiento rojo
(Capsicum frutescens),
✓Limón (Citrus limon),
✓Pera (Opuntia vulgaris)
✓Toronja (Citrus paradisi)
✓Canela (Cinnamomum verum)
✓Hierba Luisa (Cymbopogon citratus)
L.),
✓Arándano
ANTIVIRALES
Menta (Mentha piperita)
Toronjil (Melissa officinallis )
Ortiga (Urtica dioica)
Chancapiedra (Phillatus urinaria)
Noni
✓Te (Camellia sinensis)
✓Ajo
Estudios que hemos realizado utilizando
extractos vegetales acuosos
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• Estudios in vitro sobre propiedades
antibacterianas
• Estudios in vitro sobre efecto
inmunomodulador
• Ensayo en piscinas de camarón
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●
CENAIM - ESPOL
●
●
●
●
Ensayos
Concentración Mínima
Inhibitoria (CMI)
Concentración Mínima
Bactericida (CMB)
Inhibición de Biopelículas
Inhibición de luminiscencia
●
●
●
Bacterias
De importancia en
Acuicultura: Vibrio
harveyi, Vibrio campbellii,
Aeromonas sp
Enteríticas (transmisible
de crustáceos a humanos):
Vibrio parahaemolyticus
ATCC 27969, Vibrio
vulnificus
Clínica: Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27853
El efecto antiinfeccioso de las biomoléculas
vegetales puede obedecer a múltiples mecanismos
de acción; bactericida, bacteriostático, inhibición del
quórum sensing o interferencia con la formación de
biopeliculas
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ANTIBIOGRAMAS
Concentraciones letales
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Efecto de los extractos vegetales
sobre la formación de biopelículas
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CUANTIFICACIÓN DEL ANIÓN SUPERÓXIDO
(O2-) POR REDUCCIÓN DEL NBT
Actividad basal y estimulada
Ensayo en piscina
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➢Tres tratamientos, cuatro réplicas por tratamiento
➢ Control: Probióticos y β-glucanos en aguajes
➢Tratamientos en aguajes: β-glucanos + extractos vegetales. En
quiebras probióticos.
➢Allium sativum: bactericida y antioxidante
➢Morinda citrifolia: Antioxidante, antiviral
Tratamiento Peso
Lbs/ha
Cam./m2
SPV
FCA
Control
10,2±0,8a
1106±72a
5±0,5a
82±9a
1,6±0,1a
Allium
12,7±1,4b
1206±94a
4,3±0,3a
72±6a
1,5±0,1a
Morinda
10,4±1,0a
1094±191a
4,8±0,5a
79±8a
1,6±0,3a
Costo de Allium sativum $ 9/ha (4 Kg)/ciclo de producción
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Calidad del producto final
Efecto antioxidante sobre la melanización
Morinda
Control
Allium
Aceites esenciales sobre
luminiscencia de Vibrio harveyi
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Conclusiones
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Ser críticos con las alternativas y usarlas de
forma criteriosa
Larvicultura
Probióticos, temperatura
R-W
Inmunoestimulantes,
temperatura
Probióticos,
temperatura, inhibidores
del QS
Piscina
Probióticos Productos naturales
Inmunoestimulantes Productos
naturales
● Hacer una profunda revisión de procedimientos
● Realizar estudios fundamentales a fin de
favorecer el establecimiento de poblaciones
bacterianas benéficas
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GRACIAS POR SU ATENCIÓN