Download Diseño “Protocolo de desinfección de segmentos nodales de Cordia

“Establecimiento y multiplicación in vitro de
segmentos nodales de Cordia trichotoma (Vell.)
Arráb. Ex Steud (Borragináceas).”
Autor:
Ing. Santiago José Elías Velazco
Coautores:
M. Sc. Patricia Rocha.
M. Sc. Fernando Niella.
¿Por qué Peteribí?
• Especie de interés forestal
• Explotación selectiva
• Inconvenientes con su establecimiento in
vitro.
¿Por qué propagación in vitro?
• Producción en masa durante todo el año
• Intercambio de germoplasma
• Útil para programas de mejoremiento
genético
Objetivo:
Lograr un protocolo de desinfección eficiente para
el establecimiento in vitro de segmentos nodales
de Cordia trichotoma, y analizar distintas variables
de condiciones de cultivo,
que promuevan una
mayor proliferación de brotes.
Materiales y métodos
•
•
•
•
•
•
Rebrote de plantas madre de 4 años
Medios de cultivo Murashige y Skoog
WPM
20 gr. L-1 de sacarosa y 8 gr. L-1 de agar
pH a 5.8 ± 0.05
Condiciones de cría: 25 ºC fotoperiodo de
16 hs.
• 7 días bajo oscuridad.
Fase de establecimiento:
Variables de estudio.
• Número de explantes contaminados por hongos
• Número de explantes contaminados por
bacterias
• Número de explantes fenolizados
• Número de explantes sobrevivientes, (verde sin
contaminación o fenolización).
• Evaluación, luego de 7, 14 y 21 días de
establecidos los ensayos.
Experimento 1
• Objetivo: Evaluar un protocolo de
desinfección en el que se utiliza etanol
fungicida, antibióticos, cloruro de mercurio
y lavandina.
•Dos tratamientos con 20 repeticiones cada
una.
•primer paso, inmersos en una solución de
etanol al 70 % v/v.
•fungicida (Captan® 0.5 g/l) 30 min.
•solución de antibioticos (50 mg/l de sulfato
de estreptomicina, cefotaxima y
gentamicina) 3 Hs.
•exposición a ClHg (0.3 mg/l) 10 min.
•hipoclorito de sodio al 20% v/v por 10 min.
Tratamientos y resultados
Contaminación %
Hongos
Bacterias
Fenolización
%
20
100
0,00
45,00
0
20
95
0,00
70,00
5
Trat.
Hipoclorito
de sodio
n
T1
No
T2
Si
Sobreviviente
%
•Se logra controlar la aparición de
bacterias
•Solución de tres antibióticos se
utilizó en otras investigaciones con
buenos resultados :
Papaya, Peteribi.
• Fenolización:
ClHg , Lavandina
Explantes fenolizados
Experimento 2:
• Objetivo: Evaluar el aislamiento de las plantas
madres como método para disminuir la carga
microbiana de los brotes formados posterior a la
decapitación y/o poda. Además el efecto sobre la
contaminación que se obtiene con una última
inmersión sin enjuague, en una solución de
antibiótico, antioxidante y fungicida.
Pretratamiento:
• T1a y T1b decapitación de
las plantas madres y la posterior
aplicación de Captan® (20 gr L-1),
se procedió a envolver las
plantas madres con
polietileno transparente.
• T2a y T2b, decapitación de las plantas madres,
y aplicación semanal de Captan® (20 gr L-1) una
vez que los brotes tuvieron una longitud de 0.5
cm.
Tratamiento y diseño experimental
• Cuatro tratamientos con 25 repeticiones cada
una y con distribución factorial.
Protocolo de desinfección:
• Etanol (70% v/v) durante 30 seg.
• Captan® 5 g/l, durante 1 hora.
• Inmersión antibióticos. (50 mg./l sulfato de
estreptomicina, cefotaxima y gentamicina), 3 hs
• ClHg 0.03% p/v 10 min.
• T1b y T2b los explantes inmersos en una
solución de Alliette® (250 mg/l), gentamicina
(250 mg/l) y ácido ascórbico (50 mg/l), sin
posterior enjuague.
Tratamientos y resultados
Trat.
Planta
madre
Contaminación %
Inmersión
en
solución.
n
Fenolizados
Hogos
Bacterias
%
Sobrevivencia
%
T1a
No
Cubierta
Sin
25
8.0a
52.0 c
20.0a
40.0 a
T1b
No
Cubierta
Con
25
0.0 a
28.0 b
24.0a
64.0 ab
T2a
Cubiertas
Sin
25
12.0 a
12.0 ab
4.0a
72.0 ab
T2b
Cubiertas
Con
25
0.0 a
4.0 a
12.0 a
84.0 b
100
5.0
24,0
15.1
65,0
Total
Valores identificados con distinta letra en sentido vertical son estadísticamente
diferentes (Duncan, p<0.05)
Cubrir las platas madres no es practico a
nivel operativo
Explantes contaminados por bacterias
Experimento 3:
• Objetivo: Evaluar si la juvenilidad del
brote es un factor de alta implicancia en el
grado de contaminación de los explantos.
Tratamiento y diseño experimental:
• Decapitación plantas madres y aplicación
semanal de Captan® (20 gr L-1)
• Utilizo
protocolo
de
desinfección
experimento 2 (T1a).
• T1
consistió
en
la
recolección
y
establecimiento de los brotes una vez que
esto alcanzaron una longitud de 5cm.
• T2 la recolección a los 10 días de haberse
efectuado el establecimiento T1.
• Completamente aleatorizado con 150
repeticiones por tratamiento.
Tratamientos y resultados
Trat.
Tiempo
Fenolizados
Hogos
Bacterias
%
Sobrevivencia
%
Contaminación%
n
T1
Hasta
los 5 cm
150
7,3 a
1,3 a
0a
91,3 a
T2
Luego de
10Días
150
6,6 a
1,3 a
6,6 b
85,3 a
300
7
1,3
3,3
88,3
Total
Valores identificados con distinta letra en sentido vertical son estadísticamente
diferentes (Duncan, p<0.05)
•Importante: Tiempo
del brote en la
planta madre.
•Diferentes a los
anteriores
experimentos
•Resultados
semejantes en
Incienso.
Brote de Cordia tichotoma (Vell.) Arráb. Ex
Steud
Fase de multiplicación:
Variables de estudio.
•
•
•
•
Número de explantes con brotes,
Número de brotes por explante,
Número de hoja por brote
Largo de los brotes.
Experimento 1:
• Objetivo: Determinar que concentración
de hormonas BAP y ANA son las que
promueven una mayor brotación de los
explantes.
• Tratamiento y diseño experimental: diseño
completamente aleatorizado con 36
repeticiones por tratamientos con una
distribución factorial.
Tratamientos y resultados
Trat.
Nivel
del factor
mg/l
Nivel
del factor
mg/l
n
Fenolizados
%
Explantes
Brotados %
T1
ANA 0
BAP 0
36
44,4 ab
25,0 a
T2
ANA 0
BAP 2,5
36
22,2 a
36,1 a
T3
ANA 0
BAP 5
36
50,0 b
16,7 a
T4
ANA 0,01
BAP 0
36
47,2 b
16,7 a
T5
ANA 0,01
BAP 2,5
36
22,2 a
33,3 a
T6
ANA 0,01
BAP 5
36
36,1 ab
25,0 a
216
37,0
25,5
Total
Valores identificados con distinta letra en sentido vertical son estadísticamente
diferentes (Duncan, p<0.05)
Tratamientos y resultados
Trat.
T1 Testigo
T2
T3
T4
T5
T6
ANA
mg/l
BAP
mg/l
Nº Medio
de brotes
Nº Medio
de hojas
Largo
medio
(cm)
9
1,11 a
2,33 a
1,07 ab
13
1,00 a
2,69 a
0,62 ab
n
ANA 0
BAP 0
ANA 0
BAP 2,5
ANA 0
BAP 5
6
1,00 a
2,33 a
1,20 b
ANA 0,01
BAP 0
6
1,00 a
2,33 a
0,42 a
ANA 0,01
BAP 2,5
12
1,00 a
2,42 a
0,50 a
ANA 0,01
BAP 5
9
1,11a
2,44 a
0,42 a
55
1,04
2,45
0,68
Total
Valores identificados con distinta letra en sentido vertical son estadísticamente
diferentes (Duncan, p<0.05)
• Diferentes conclusiones
en la bibliografía
consultada.
• Fick (2007) semejantes
resultados.
• Schendelbeck (2007) y
Montavani (2001) mejores
resultados con hormonas.
Explantes con brotes.
Experimento 2:
Objetivo: Evaluar el efecto que causa el aumento
de la concentración de sacarosa combinado con
distintas frecuencias de subcultivos.
Tratamiento y diseño experimental:
• completamente aleatorizado al azar con 50
repeticiones por tratamiento,
• se evaluó dos dosis de sacarosa, combinados
con dos frecuencia de subcultivos
• testigo consistió en la utilización de 30 gr/l de
sacarosa y sin subcultivos.
Tratamientos y resultados
Trat.
Sacarosa
gr/l
Repique
Días
T0 Testigo
30
no
28
53,5 a
T1
30
7
35
42,8 a
T2
30
14
27
40,7 a
T3
45
7
36
38,9 a
T4
45
14
24
12,5 b
150
38,6
Total
n
Explantes
Brotados %
Valores identificados con distinta letra en sentido vertical son estadísticamente
diferentes (Duncan, p<0.05)
Tratamientos y resultados
Trat.
Sacarosa Repique
gr/l
Días
n
Nº de
brotes
Nº de
hojas
Largo
Media
(cm)
T0
30
no
15
1,1 a
T1
30
7
15
1a
T2
30
14
11
1a
T3
45
7
14
1a
T4
45
14
3
1a
2b
0,33 a
58
1
3,11
0,50
Total
3,16 ab
3,33 a
3,27 a
2,92 ab
0,44 a
0,59 a
0,48 a
0,52 a
Valores identificados con distinta letra en sentido vertical son estadísticamente
diferentes (Duncan, p<0.05)
• Mejor resultado testigo
• En Yerba mate brotación disminuye con el
aumento de las concentraciones de
sacarosa
• Estudios en papaya incremento en el
numero de brotes con el aumento de
sacarosa
Conclusiones:
Fase de Establecimiento
• Es posible la desinfección de segmentos
nodales de Peteribí provenientes de brotes de
plantas madres de 4 años de edad, con el uso
de brotes jóvenes recolectados apenas hayan
alcanzado los 5 cm de longitud, más el empleo
de un protocolo de desinfección que utiliza,
etanol, tween 20, fungicidas, antibióticos, cloruro
de mercurio y cloruro de calcio.
• El aislamiento con polietileno de los brotes de
las plantas, no contribuye en forma significativa
sobres los niveles de contaminación de los
explantes.
Conclusiones:
Fase de Multiplicación
• El uso de hormonas BAP y ANA no promovió
una mayor brotación de los explantes, respecto
al tratamiento sin hormonas.
• El aumento de la frecuencia de subcultivos y
mayores concentraciones de sacarosa no
lograron incrementar la brotación en la fase de
multiplicación de peteribi.
Gracias por su
atención !