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“Establecimiento y multiplicación in vitro de segmentos nodales de Cordia trichotoma (Vell.) Arráb. Ex Steud (Borragináceas).” Autor: Ing. Santiago José Elías Velazco Coautores: M. Sc. Patricia Rocha. M. Sc. Fernando Niella. ¿Por qué Peteribí? • Especie de interés forestal • Explotación selectiva • Inconvenientes con su establecimiento in vitro. ¿Por qué propagación in vitro? • Producción en masa durante todo el año • Intercambio de germoplasma • Útil para programas de mejoremiento genético Objetivo: Lograr un protocolo de desinfección eficiente para el establecimiento in vitro de segmentos nodales de Cordia trichotoma, y analizar distintas variables de condiciones de cultivo, que promuevan una mayor proliferación de brotes. Materiales y métodos • • • • • • Rebrote de plantas madre de 4 años Medios de cultivo Murashige y Skoog WPM 20 gr. L-1 de sacarosa y 8 gr. L-1 de agar pH a 5.8 ± 0.05 Condiciones de cría: 25 ºC fotoperiodo de 16 hs. • 7 días bajo oscuridad. Fase de establecimiento: Variables de estudio. • Número de explantes contaminados por hongos • Número de explantes contaminados por bacterias • Número de explantes fenolizados • Número de explantes sobrevivientes, (verde sin contaminación o fenolización). • Evaluación, luego de 7, 14 y 21 días de establecidos los ensayos. Experimento 1 • Objetivo: Evaluar un protocolo de desinfección en el que se utiliza etanol fungicida, antibióticos, cloruro de mercurio y lavandina. •Dos tratamientos con 20 repeticiones cada una. •primer paso, inmersos en una solución de etanol al 70 % v/v. •fungicida (Captan® 0.5 g/l) 30 min. •solución de antibioticos (50 mg/l de sulfato de estreptomicina, cefotaxima y gentamicina) 3 Hs. •exposición a ClHg (0.3 mg/l) 10 min. •hipoclorito de sodio al 20% v/v por 10 min. Tratamientos y resultados Contaminación % Hongos Bacterias Fenolización % 20 100 0,00 45,00 0 20 95 0,00 70,00 5 Trat. Hipoclorito de sodio n T1 No T2 Si Sobreviviente % •Se logra controlar la aparición de bacterias •Solución de tres antibióticos se utilizó en otras investigaciones con buenos resultados : Papaya, Peteribi. • Fenolización: ClHg , Lavandina Explantes fenolizados Experimento 2: • Objetivo: Evaluar el aislamiento de las plantas madres como método para disminuir la carga microbiana de los brotes formados posterior a la decapitación y/o poda. Además el efecto sobre la contaminación que se obtiene con una última inmersión sin enjuague, en una solución de antibiótico, antioxidante y fungicida. Pretratamiento: • T1a y T1b decapitación de las plantas madres y la posterior aplicación de Captan® (20 gr L-1), se procedió a envolver las plantas madres con polietileno transparente. • T2a y T2b, decapitación de las plantas madres, y aplicación semanal de Captan® (20 gr L-1) una vez que los brotes tuvieron una longitud de 0.5 cm. Tratamiento y diseño experimental • Cuatro tratamientos con 25 repeticiones cada una y con distribución factorial. Protocolo de desinfección: • Etanol (70% v/v) durante 30 seg. • Captan® 5 g/l, durante 1 hora. • Inmersión antibióticos. (50 mg./l sulfato de estreptomicina, cefotaxima y gentamicina), 3 hs • ClHg 0.03% p/v 10 min. • T1b y T2b los explantes inmersos en una solución de Alliette® (250 mg/l), gentamicina (250 mg/l) y ácido ascórbico (50 mg/l), sin posterior enjuague. Tratamientos y resultados Trat. Planta madre Contaminación % Inmersión en solución. n Fenolizados Hogos Bacterias % Sobrevivencia % T1a No Cubierta Sin 25 8.0a 52.0 c 20.0a 40.0 a T1b No Cubierta Con 25 0.0 a 28.0 b 24.0a 64.0 ab T2a Cubiertas Sin 25 12.0 a 12.0 ab 4.0a 72.0 ab T2b Cubiertas Con 25 0.0 a 4.0 a 12.0 a 84.0 b 100 5.0 24,0 15.1 65,0 Total Valores identificados con distinta letra en sentido vertical son estadísticamente diferentes (Duncan, p<0.05) Cubrir las platas madres no es practico a nivel operativo Explantes contaminados por bacterias Experimento 3: • Objetivo: Evaluar si la juvenilidad del brote es un factor de alta implicancia en el grado de contaminación de los explantos. Tratamiento y diseño experimental: • Decapitación plantas madres y aplicación semanal de Captan® (20 gr L-1) • Utilizo protocolo de desinfección experimento 2 (T1a). • T1 consistió en la recolección y establecimiento de los brotes una vez que esto alcanzaron una longitud de 5cm. • T2 la recolección a los 10 días de haberse efectuado el establecimiento T1. • Completamente aleatorizado con 150 repeticiones por tratamiento. Tratamientos y resultados Trat. Tiempo Fenolizados Hogos Bacterias % Sobrevivencia % Contaminación% n T1 Hasta los 5 cm 150 7,3 a 1,3 a 0a 91,3 a T2 Luego de 10Días 150 6,6 a 1,3 a 6,6 b 85,3 a 300 7 1,3 3,3 88,3 Total Valores identificados con distinta letra en sentido vertical son estadísticamente diferentes (Duncan, p<0.05) •Importante: Tiempo del brote en la planta madre. •Diferentes a los anteriores experimentos •Resultados semejantes en Incienso. Brote de Cordia tichotoma (Vell.) Arráb. Ex Steud Fase de multiplicación: Variables de estudio. • • • • Número de explantes con brotes, Número de brotes por explante, Número de hoja por brote Largo de los brotes. Experimento 1: • Objetivo: Determinar que concentración de hormonas BAP y ANA son las que promueven una mayor brotación de los explantes. • Tratamiento y diseño experimental: diseño completamente aleatorizado con 36 repeticiones por tratamientos con una distribución factorial. Tratamientos y resultados Trat. Nivel del factor mg/l Nivel del factor mg/l n Fenolizados % Explantes Brotados % T1 ANA 0 BAP 0 36 44,4 ab 25,0 a T2 ANA 0 BAP 2,5 36 22,2 a 36,1 a T3 ANA 0 BAP 5 36 50,0 b 16,7 a T4 ANA 0,01 BAP 0 36 47,2 b 16,7 a T5 ANA 0,01 BAP 2,5 36 22,2 a 33,3 a T6 ANA 0,01 BAP 5 36 36,1 ab 25,0 a 216 37,0 25,5 Total Valores identificados con distinta letra en sentido vertical son estadísticamente diferentes (Duncan, p<0.05) Tratamientos y resultados Trat. T1 Testigo T2 T3 T4 T5 T6 ANA mg/l BAP mg/l Nº Medio de brotes Nº Medio de hojas Largo medio (cm) 9 1,11 a 2,33 a 1,07 ab 13 1,00 a 2,69 a 0,62 ab n ANA 0 BAP 0 ANA 0 BAP 2,5 ANA 0 BAP 5 6 1,00 a 2,33 a 1,20 b ANA 0,01 BAP 0 6 1,00 a 2,33 a 0,42 a ANA 0,01 BAP 2,5 12 1,00 a 2,42 a 0,50 a ANA 0,01 BAP 5 9 1,11a 2,44 a 0,42 a 55 1,04 2,45 0,68 Total Valores identificados con distinta letra en sentido vertical son estadísticamente diferentes (Duncan, p<0.05) • Diferentes conclusiones en la bibliografía consultada. • Fick (2007) semejantes resultados. • Schendelbeck (2007) y Montavani (2001) mejores resultados con hormonas. Explantes con brotes. Experimento 2: Objetivo: Evaluar el efecto que causa el aumento de la concentración de sacarosa combinado con distintas frecuencias de subcultivos. Tratamiento y diseño experimental: • completamente aleatorizado al azar con 50 repeticiones por tratamiento, • se evaluó dos dosis de sacarosa, combinados con dos frecuencia de subcultivos • testigo consistió en la utilización de 30 gr/l de sacarosa y sin subcultivos. Tratamientos y resultados Trat. Sacarosa gr/l Repique Días T0 Testigo 30 no 28 53,5 a T1 30 7 35 42,8 a T2 30 14 27 40,7 a T3 45 7 36 38,9 a T4 45 14 24 12,5 b 150 38,6 Total n Explantes Brotados % Valores identificados con distinta letra en sentido vertical son estadísticamente diferentes (Duncan, p<0.05) Tratamientos y resultados Trat. Sacarosa Repique gr/l Días n Nº de brotes Nº de hojas Largo Media (cm) T0 30 no 15 1,1 a T1 30 7 15 1a T2 30 14 11 1a T3 45 7 14 1a T4 45 14 3 1a 2b 0,33 a 58 1 3,11 0,50 Total 3,16 ab 3,33 a 3,27 a 2,92 ab 0,44 a 0,59 a 0,48 a 0,52 a Valores identificados con distinta letra en sentido vertical son estadísticamente diferentes (Duncan, p<0.05) • Mejor resultado testigo • En Yerba mate brotación disminuye con el aumento de las concentraciones de sacarosa • Estudios en papaya incremento en el numero de brotes con el aumento de sacarosa Conclusiones: Fase de Establecimiento • Es posible la desinfección de segmentos nodales de Peteribí provenientes de brotes de plantas madres de 4 años de edad, con el uso de brotes jóvenes recolectados apenas hayan alcanzado los 5 cm de longitud, más el empleo de un protocolo de desinfección que utiliza, etanol, tween 20, fungicidas, antibióticos, cloruro de mercurio y cloruro de calcio. • El aislamiento con polietileno de los brotes de las plantas, no contribuye en forma significativa sobres los niveles de contaminación de los explantes. Conclusiones: Fase de Multiplicación • El uso de hormonas BAP y ANA no promovió una mayor brotación de los explantes, respecto al tratamiento sin hormonas. • El aumento de la frecuencia de subcultivos y mayores concentraciones de sacarosa no lograron incrementar la brotación en la fase de multiplicación de peteribi. Gracias por su atención !