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Ponencia
Probióticos y alimentos:
Un estudio basado en la evidencia
Rosa del Campo y Fernando Baquero
Servicio de Microbiología, Hospital Ramón y Cajal, Madrid
El yogur se ha considerado tradicionalmente como un alimento saludable debido a su contenido bacteriano, pero
existen pocos estudios científicos acerca de sus efectos, particularmente en la población sana, que es la principal consumidora de estos productos. Recientemente, el CODEX Alimentarius, organismo dependiente de la FAO, ha aprobado
la recomendación de utilizar la denominación de yogur solamente en aquellos productos que contengan bacterias vivas;
sin embargo, la legislación española permite esta denominación en los productos pasteurizados. Los yogures pasteurizados tienen un periodo de consumo prolongado y no necesitan la cadena del frío para su conservación, lo que abarata
su producción.
Tradicionalmente se ha considerado al yogur como un alimento probiótico con efectos saludables, aunque científicamente no han sido demostrados dichos efectos beneficiosos para la salud, particularmente en la gente sana (1). Al
mismo tiempo, parece obvio que estos presuntos efectos dependen de la capacidad de los organismos probióticos para
sobrevivir y multiplicarse en el tracto grastrointestinal, persistiendo a gran concentración en el intestino (2).
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus se han utilizado clásicamente como organismos iniciadores de la fermentación de la leche para la producción de yogur.
En nuestra institución (3) se analizó la presencia en heces humanas de L. delbrueckii y S. thermophilus tras consumir 375 g de yogur al día durante 15 días, en un estudio prospectivo y doble ciego que incluía 114 voluntarios sanos
(edad media 23,6 años, 49 hombres y 65 mujeres). En los voluntarios se comprobó la situación de individuo sano
mediante el test de salud gastrointestinal GIQLY, análisis hematológicos de amplio espectro, así como análisis inmunológicos (linfocitos, CD3, CD4, CD8 e inmunoglobulinas IgA, IgG e IgM). Por otro lado, no se les impuso ningún
régimen de dieta especial, excepto la imposición de consumir diariamente los yogures. En una primera ronda de quince días, 48 voluntarios consumieron diariamente 375 g de yogur fresco que contenía 1,3 × 107 y 2 × 108 UFC/g de
L. delbrueckii y S. thermophilus, respectivamente (consumo total de bacterias 1011 células). Este mismo esquema, pero
con yogur pasteurizado, fue seguido por otros 48 voluntarios. Tanto el yogur fresco como el pasteurizado procedían del
mismo fabricante y fueron marcados con nombres codificados para garantizar el doble ciego del estudio, por lo que ni
los voluntarios ni los microbiólogos que procesaron las heces sabían el tipo de preparación que manejaban.
Tras un periodo de lavado de 15 días en que los voluntarios no ingirieron ningún tipo de yogur, ambos grupos experimentales de 48 individuos consumieron el producto contrario al ingerido en la primera ronda (yogur fresco o pasteurizado). En el estudio se incluyó un grupo control de 18 individuos que no ingirió ningún tipo de yogur y que siguió el
mismo proceso que el resto de los 96. Se recogieron tres muestras fecales a cada individuo: una primera muestra en el
inicio del estudio tras una semana sin ingerir ningún yogur, la segunda y la tercera muestra fecales se recogieron tras
quince días de ingesta de yogur. Se empleó el método estadístico Fleiss para validar los análisis estadísticos de los resultados (4).
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Se utilizaron métodos microbiológicos clásicos para detectar la presencia de las bacterias del yogur vivas en las
heces, mediante siembra directa y cultivo tradicional. Se identificaron todos los diferentes morfotipos que presentaban
las colonias y en ningún caso correspondieron con L. delbrueckii ni S. thermophilus. El límite de detección con este
método fue de 103 UFC/ml. Tras este resultado negativo se aplicó la técnica de PCR con cebadores específicos para las
bacterias de yogur en DNA extraído de las heces, obteniendo también resultados consistentemente negativos para ambas
bacterias en las tres muestras de cada individuo. Esta detección negativa no sólo ocurrió en el grupo control y en la
muestra base de cada uno de los voluntarios, sino también en las muestras recogidas tras el consumo de yogur fresco o
su equivalente pasteurizado. Sin embargo, se obtuvieron amplificaciones claramente positivas y con un producto del
tamaño esperado para L. delbrueckii o S. thermophilus cuando en los experimentos de PCR se utilizó como molde el
DNA extraído de un yogur fresco, o de uno pasteurizado o de las mezclas de yogur con organismos viables y heces
(1.000.000:1), con un límite estimado de detección de 1-5 bacterias/ml. En definitiva, las bacterias del yogur no son
detectables mediante cultivos convencionales ni mediante técnicas moleculares específicas como la PCR, dentro de
nuestros límites experimentales.
La detección de restos de DNA específicos de L. delbrueckii o S. thermophilus mediante hibridación radiactiva con
DNA extraído de las heces resultó ser más sensible que las técnicas anteriores. Estos experimentos confirmaron la negatividad de las muestras iniciales de todos los voluntarios, así como de las tres muestras del grupo control sin consumo de
yogur. Por el contrario, se observaron ocho muestras positivas para los experimentos de hibridización con sondas específicas de L. delbrueckii, correspondiendo siete de ellas a DNA de heces de diferentes voluntarios recogidas tras el consumo de yogur fresco (8,4%), y una muestra correspondió a heces recogidas tras la ingesta de yogur pasteurizado (1,05%).
En los experimentos en que se utilizó la sonda específica de S. thermophilus se observaron cuatro hibridaciones positivas que correspondían, en tres casos, a muestras tras la ronda de yogur fresco (3,15%) y en un caso a muestras tras la
ronda de yogur pasteurizado (1,05%). En dos sujetos distintos se obtuvieron positivas las hibridaciones para las dos bacterias lácticas del yogur (en ambos casos las muestras se recogieron tras la ronda de yogur fresco). Por lo tanto, tras el
consumo reiterado durante 15 días de yogur fresco se detectó, mediante hibridación, DNA compatible con las bacterias
iniciadoras del yogur en 10 sujetos de un total de 96 (10,52%). En el caso del yogur pasteurizado se detectaron restos
de DNA compatible en dos individuos de los 96 (2,10%) (p=0.01).
En nuestro experimento nosotros sólo comprobamos la viabilidad de las bacterias en las heces, pero la pérdida de
viabilidad de estas bacterias en el tracto gastrointestinal superior no puede ser inferida a partir de nuestros resultados.
Sin embargo, los resultados negativos en los cultivos de ambas bacterias, así como en la detección de DNA en heces,
indican que no cabría esperar una gran multiplicación de estas bacterias en el intestino delgado. En los experimentos de
hibridación se obtuvo una proporción significativamente mayor de resultados positivos en los voluntarios que consumieron yogur fresco que en los voluntarios que consumieron yogur pasteurizado, pero aun así, en el 90% de las muestras del primer grupo no se detectó ningún resto de DNA. No podemos descartar que el mayor número de positivos entre
los voluntarios que consumieron yogur fresco se deba a una mayor colonización de las bacterias, pero nosotros creemos
que se debe a una mayor degradación del DNA en los productos pasteurizados por el propio proceso de pasteurización,
que mata a las bacterias y se empieza a degradar el DNA antes del consumo del producto.
Pese al convencimiento generalizado que existe sobre los efectos probióticos de las bacterias lácticas del yogur, L.
delbrueckii y S. thermophilus, los datos sobre la verdadera funcionalidad de estos organismos en el intestino humano
permanecen ocultos, e incluso podrían no existir (5). En los bien controlados experimentos que se han realizado en este
trabajo, nosotros hemos sido incapaces de detectar bacterias lácticas del yogur viables en las heces tras el consumo reiterado de yogur en voluntarios sanos, y sólo tras la ingestión de yogur fresco hemos detectado restos de DNA de L. delbrueckii o S. thermophilus en las heces del 10% de los voluntarios mediante experimentos de hibridación. Otros autores detectan bacterias lácticas del yogur viables en muestras duodenales humanas (6), aunque presentan escasa viabilidad tras el contacto con los jugos gástricos o las sales biliares (7), y son altamente sensibles al tipo y a la cantidad de
comida que ingieren los sujetos (8-10). Consecuentemente, el presunto efecto probiótico del yogur depende de la frecuencia de ingestión (11-13), y todo esto es lo que se espera que ocurra con dos microorganismos, como L. delbrueckii
y S. thermophilus, que no están sustancialmente representados en la microbiota intestinal humana.
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Se han desarrollado diversas técnicas moleculares para detectar e identificar microorganismos sin necesidad de ser
cultivados. El gen que codifica el RNAr 16S contiene varias regiones de secuencias totalmente conservadas, pero al
mismo tiempo presenta unas diferencias en las secuencias en otras regiones del gen que pueden servir como excelentes
cronómetros filogenéticos, lo que permite el estudio de poblaciones bacterianas muy complejas, como la microbiota
intestinal humana. La técnica PCR combinada con electroforesis en geles verticales con gradiente desnaturalizante
(DGGE) (14-16) permite visualizar cambios dinámicos en comunidades bacterianas que representan un 1% o más de la
totalidad de la comunidad (17, 18).
En el colon del humano adulto existen entre 400 y 500 especies bacterianas diferentes, la mayoría de ellas de tipo
anaerobio, pero el 99% de la microbiota de las heces lo constituyen unas 30 a 40 especies de bacterias. Los estudios
individuales de la microbiota intestinal identifican perfiles propios para cada individuo, que se mantienen mayoritariamente constantes a lo largo del tiempo; sin embargo, cambios en la dieta pueden modificarlos y afectar no sólo al recuento total de bacterias (19) sino también a los géneros y especies predominantes (20).
Utilizando la técnica DGGE se han analizado los cambios de la microbiota general (utilizando cebadores universales) y de las bacterias lácticas en particular (utilizando cebadores específicos de bacterias lácticas) que han ocurrido en
cada una de las tres muestras fecales de los voluntarios sanos. El análisis con cebadores universales nos ha permitido
observar que cada individuo presenta un perfil electroforético propio constante, compartiendo varias bandas casi todos
los individuos. Estas bandas comunes se han secuenciado y correspondían a diferentes bacterias, siendo varias de ellas
incultivables. No se han encontrado diferencias cualitativas significativas entre la muestra correspondiente al inicio y
las otras dos obtenidas tras la ingestión de yogur. Del mismo modo, aunque en algunos individuos existen variaciones,
tampoco hay una diferencia clara de perfil electroforético cuando se compara la muestra tras ingerir yogur fresco con la
de yogur pasteurizado.
De forma similar, en el análisis cualitativo del perfil electroforético de bacterias lácticas se apreciaron variaciones
que podrían atribuirse al consumo de los preparados lácteos en algunos de los individuos, sin observar diferencias significativas entre los yogures tradicionales y sus equivalentes pasteurizados. Se han secuenciado diferentes bandas que
aparecieron en varios individuos tras la ingestión de yogur, identificándose como Lactobacillus algidus, Weissella confusa, Weissella viridescens, Lactobacillus sakeii, Lactobacillus alimentarus y Lactobacillus curvatus.
Se ha detectado una especificidad individual en la microbiota intestinal de cada individuo que no varía cualitativamente con la ingesta de yogur, existiendo pocas diferencias entre los yogures frescos y los pasteurizados. En cambio, sí
se han observado cambios cualitativos en el contenido de bacterias lácticas tras el consumo de yogur, observándose una
tendencia general al incremento del número de bandas detectadas, aunque no parecen existir grandes diferencias entre
la ingesta de yogur tradicional o su equivalente pasteurizado.
La definición recomendada de la FAO y la OMS para los probióticos es “organismos vivos que administrados en
cantidad adecuada confieren un beneficio saludable al huésped” (21). Los resultados publicados por otros autores señalan que las bacterias vivas son esenciales para lograr el supuesto efecto beneficioso (22, 23). Nuestros resultados, por el
contrario, muestran que éste no es el caso con las bacterias lácticas utilizadas para la fabricación de yogur. Obviamente,
nosotros no podemos descartar en nuestros experimentos que el efecto beneficioso del yogur demostrado empíricamente esté más relacionado con los prebióticos que con los probióticos.
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