Download Efecto del EM™ en la supresión del hongo Moniliophthor

UNIVERSIDAD EARTH
EL EFECTO DE LOS MICROORGANISMOS EFICACES EN LA SUPRESIÓN
DEL HONGO Moniliophthora roreri BAJO CONDICIÓN DE LABORATORIO Y
CAMPO CON INOCULACIÓN ARTIFICIAL.
Tracy Nájar y Sheira Thomas
Trabajo de Graduación presentado como requisito parcial para optar al título
de Ingenieras Agrónomas con el grado de Licenciatura
Guácimo, Costa Rica
Diciembre, 2001
Trabajo de Graduación presentado como requisito parcial para optar al título de
Ingenieras Agrónomas con el grado de Licenciatura
Profesor Asesor
Shuichi Okumoto, M.Sc.
Profesor Coasesor
Pánfilo Tabora, Ph. D.
Decano
Daniel Sherrard, Ph.D.
Candidata
Tracy Nájar
Candidata
Sheira Thomas
Diciembre, 2001
ii
DEDICATORIA
En primer lugar, dedico el trabajo de graduación a Dios por su fortaleza.
A mi familia, principalmente a mis padres, los cuales siempre confiaron en mí, y
me dieron el apoyo necesario.
A todas las personas que me apoyaron con sus palabras, conocimientos y
oraciones.
Sheira
Primeramente a Dios por iluminar el camino y guiarme en estos cuatro años.
A mi madre, mi hermano por brindarme su apoyo en los momentos más difíciles
de mi vida.
A la Fundación Ostrom en especial a la Sr. Magalen O.Bryant por brindarme la
oportunidad de graduarme es ésta prestigiosa universidad.
A Francis Reyes por su apoyo constante y a Pablo Ribero por
su amistad
incondicional.
Tracy
iii
AGRADECIMIENTO
Le agradezco infinitamente al Señor, Dios Todopoderoso por haberme
otorgado ésta oportunidad de estudio, y por su mano ayudadora.
A mis padres por darme lo mejor de ellos en todo momento.
A mi becario, Por la gran oportunidad de que me concedió de estudiar.
A mis asesores M.Sc. Shuichi Okumoto y Dr. Pánfilo Tabora por su apoyo
y su tiempo y a mi compañera de trabajo Tracy Najar.
Finalmente a Juanita por brindarme su ayuda en la elaboración del proyecto
Sheira
A nuestros asesores M.Sc. Shuichi Okumoto y Ph.D Pánfilo Tabora, por su
incondicional apoyo al trabajo realizado.
A mi compañera de trabajo “Shira” Thomas. Gracias Shirín, que DIOS te
bendiga hoy y siempre.
A los señores Fernando López , Joaquín Calderón y Ricardo Palacios.
Tracy
iv
RESUMEN
La enfermedad de moniliasis, causado por el hongo Moniliophthora roreri,
ha sido una de los causantes de pérdidas significativas de frutos en el cultivo de
cacao (Theobroma cacao), en Costa Rica y otros países Latinoamericanos. El
control convencional de esta enfermedad, demanda gran cantidad de productos
químicos los cuales han demostrado ser de altos costos de adquisición e
ineficientes.
El presente estudio se realizó con el objetivo de investigar el efecto
supresivo y el mecanismo antagónico de cuatro productos orgánicos como el EM,
EM5, fermentos de mazorca sana y enferma a base de EM, bajo condiciones de
campo y laboratorio. También se trabajó con los filtrados de cada tratamientos los
cuales fueron evaluados exclusivamente bajo condiciones controladas de
laboratorio.
La incidencia de la enfermedad Moniliophthora roreri, fue significativamente
menor en las plantas tratadas con EM y EM5, para condiciones de campo y de
laboratorio. El EM5 seguido del EM tuvieron mejores resultados en el laboratorio
con relación al testigo y demás tratamientos, presentando reducción del
crecimiento micelial y del porcentaje (%) de germinación de las esporas. En el
campo se demostró que el EM seguido por el EM5, fueron los tratamientos que
demostraron mayor capacidad de supresión, debido a la mayor cantidad de frutos
sanos resultantes por tratamiento.
Palabras
claves:
Microorganismos
eficaces
(EM),
supresión,
Moniliophthora rorer y Theobroma cacao.
NAJAR, T; THOMAS, S. El efecto de los microorganismos eficaces en la
supresión del hongo moniliophthora roreri bajo condición de laboratorio y
campo con inoculación artificial. Trabajo de Graduación. Mercedes de
Guácimo, Universidad EARTH, CR. 49 p.
v
ABSTRACT
Monilia is a disease caused by the fungus Moniliophthora roreri, a serious
pest in cocoa (Theobroma cacao) production for Latin American countries.
Chemical controls are neither the cheapest nor the most effective disease
management. Laboratory and field experiments were carried out as part of this
project to research the suppressive and antagonistic mechanism of four organic
products (EM, EM5, fermented healthy pods and fermented sick pods). In
combination with these treatments, filtrates of these were also taken exclusively for
laboratory investigation.
The incidence of disease by Moniliophthora roreri was significantly lower in
plants treated with EM and EM5. A decrease in mycelial growth and percentage
(%) of germinated spores were observed by Moniliophthora roreri treated with
EM5 followed by EM in laboratory conditions. Suppressive capacity was
demonstrated in field research by using EM and EM5, since it results resulted in
more healthy fruits per plants.
We assume that Effective Microorganisms and its byproducts (constituents
and filtrates), produce a decrease in the metabolic activity of Moniliophthora roreri,
because of its suppressive or antagonic capacity.
Key Words: Effective Microorganisms (EM), suppression, Moniliophthora
roreri and Theobroma cacao.
NAJAR, T; THOMAS, S. El efecto de los microorganismos eficaces en la
supresión del hongo Moniliophthora roreri bajo condición de laboratorio y
campo con inoculación artificial. Trabajo de Graduación. Mercedes de
Guácimo, Universidad EARTH, CR. 50 p.
vi
TABLA DE CONTENIDO
Página
DEDICATORIA ................................................................................................ III
AGRADECIMIENTO ........................................................................................IV
RESUMEN ........................................................................................................V
ABSTRACT......................................................................................................VI
TABLA DE CONTENIDO ................................................................................VII
LISTA DE CUADROS ......................................................................................IX
LISTA DE FIGURAS .........................................................................................X
LISTA DE ANEXOS .........................................................................................XI
1.
INTRODUCCIÓN.............................................................................................. 1
2.
REVISIÓN DE LITERATURA........................................................................... 5
2.1.
2.2.
2.3.
2.4.
2.5.
ETIOLOGÍA DEL AGENTE CAUSAL ....................................................... 5
HOSPEDERO........................................................................................... 5
CICLO DE VIDA DEL PATÓGENO ......................................................... 5
SINTOMATOLOGÍA ................................................................................. 7
COMBATE................................................................................................ 8
2.5.1. Combate Cultural........................................................................ 9
2.5.2. Combate Químico ....................................................................... 9
2.5.3. Combate por resistencia ........................................................... 11
2.5.4. Combate Biológico.................................................................... 11
2.6. ANTAGONISMO..................................................................................... 12
2.7. USO DE MICOORGANISMOS EFICACES (EM) ................................... 12
3.
OBJETIVOS ................................................................................................... 17
3.1. OBJETIVO GENERAL............................................................................ 17
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................. 17
vii
4.
METODOLOGÍA ............................................................................................ 18
4.1. LOCALIZACIÓN Y ÁREA EXPERIMENTAL........................................... 18
4.2. MATERIAL EXPERIMENTAL ................................................................. 18
4.3. EXPERIMENTOS ................................................................................... 19
4.3.1. Ensayo 1: efecto antagónico de los microorganismos eficaces
sobre conidios de M. roreri. ...................................................... 19
b) Preparación de Tratamientos ............................................................. 19
d) Variables a evaluar y análisis estadístico. .......................................... 21
4.3.2. Ensayo 2: Efecto de los tratamientos filtrados sobre la inhibición
del micelio bajo condiciones aeróbicas. ................................... 21
a)Tratamiento ......................................................................................... 22
b) Instalación de experimento................................................................. 22
c) Variables a evaluar y análisis estadístico. .......................................... 22
4.3.3. Ensayo 3: Efecto de los tratamientos (no filtrados) bajo
condiciones aeróbicas. ............................................................. 23
a)Tratamientos: ...................................................................................... 23
b) Instalación del experimento................................................................ 23
c) Variables a evaluar. ............................................................................ 23
4.3.4. Ensayo 4: Efecto de inhibición sobre el crecimiento de micelio,
bajo condiciones anaeróbicas. ................................................. 24
a)Tratamiento ......................................................................................... 24
b) Instalación de experimento................................................................. 24
c) Variables a evaluar y análisis estadístico. .......................................... 24
4.3.5. Ensayo 5: Efecto de los microorganismos eficaces sobre la
supresión de M. roreri en el campo con la inoculación artificial
del patógeno............................................................................. 25
a) Tratamientos. ..................................................................................... 25
b) Instalación de experimento................................................................. 25
5.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN....................................................................... 27
5.1. EXPERIMENTO EN EL LABORATORIO ............................................... 27
5.1.1. Ensayo 1................................................................................... 27
5.1.2. Ensayo 2................................................................................... 29
5.1.3. Ensayo 3................................................................................... 31
5.1.4. Ensayo 4................................................................................... 33
5.2. EXPERIMENTO DE CAMPO ................................................................. 36
6.
CONCLUSIONES........................................................................................... 41
7.
RECOMENDACIÓN ....................................................................................... 42
8.
BIBLIOGRÁFICAS......................................................................................... 43
9.
ANEXOS ........................................................................................................ 47
viii
LISTA DE CUADROS
Cuadro
Página
Cuadro 1. Efecto de los microorganismos antagonistas sobre la germinación de
esporas de M. roreri. .............................................................................28
Cuadro 2. Efecto de los tratamientos filtrados sobre la supresión del micelio del
hongo M. roreri bajo condiciones aeróbicas...........................................29
Cuadro 3. Efecto de los tratamientos sobre la inhibición del micelio M. roreri bajo
condiciones aeróbicas............................................................................31
Cuadro 4. Análisis de varianza correspondientes al último de día de lectura, de los
tratamientos y su efecto supresivo sobre el micelio del hongo M. roreri
bajo condiciones anaeróbicas. ...............................................................34
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura
Página
Figura 1. Efecto antagónico del EM5 sobre el hongo M roreri..............................32
Figrura 2. Efecto antagónico (Testigo) sobre el hongo M roreri. ...........................32
Figura 3. Desarrollo del micelio bajo el método de doble capa durante 7 días de
observación, en los diferentes tratamientos. ..........................................33
x
LISTA DE ANEXOS
Anexo
Página
Cuadro 1 . Análisis de varianza para el efecto de los tratamientos con la severidad
de moniliasis. .........................................................................................47
Figura 1. Mazorcas sana, resultante del experimento...........................................47
Figura 2. Mazorca con síntoma de marchites........................................................48
Figura 3. Mazorca con esporulado total ................................................................48
Figura 4. Mazorca son síntomas de estroma productivo.......................................49
xi
1. INTRODUCCIÓN
Son varias las enfermedades que atacan al cultivo de cacao (Theobroma
cacao) pero una de las mas importantes y que ha producido grandes bajas (40 y
50%) en la producción latinoamericana es la enfermedad conocida como
moniliasis causado por el hongo Moniliophthora roreri (Soria 2000:4).
La enfermedad de moniliasis fue estudiada de manera oficial por vez
primera, por el científico J. B Rorer. En el año de 1916 se detectó la enfermedad
en la región de Quevedo, Ecuador el cual se diseminó paulatinamente por todo el
país provocando daños considerables en la producción cacaotera, que en la
actualidad padecen Colombia, Perú, Venezuela, Panamá y recientemente Costa
Rica (Soria 2000:4).
En Costa Rica durante diciembre de 1978, el Centro Agronómico Tropical
de Investigación y Enseñanza (CATIE) de Costa Rica determinó la presencia de la
enfermedad en la zona atlántica. A finales de 1980 la enfermedad fue descubierta
en otras zonas cacaoteras de país (zona norte y zona pacífico sur) donde se ha
tratado de combatirla por varios métodos sin obtener resultados satisfactorios
(Porras 1982:2).
La severidad del ataque de la Moniliasis varia de una zona a otra de año
en año, de acuerdo a las condiciones del clima y/o microclima y la presión del
inóculo. A pesar de que solo afecta a los frutos, su ataque es a menudo tan severo
que se considera que la enfermedad constituye uno de los factores limitantes y de
mayor importancia en la producción de cacao en América tropical (Porras y
Sánchez 1991:10).
Se ha informado que en Ecuador y Colombia la enfermedad a ocasionado
perdidas en la producción de 16 hasta el 80% y aún más, con promedios que
fluctúan del 20 al 22 % anual. En Costa Rica el impacto de la Moniliasis para el
1
año de 1979- 1980, provocó una pérdida del 80 – 90 % en comparación a las
producciones del año anterior (Porras y Sánchez 1991:10).
Por otra parte Sanchez (1982:3), resalta esta situación afirmando que antes
de la aparición de la enfermedad en Costa Rica, existía una producción cerca de
40,000 toneladas métricas, con una reducción del 60% para el año de 1980,
produciendo una pérdida de 48 millones de dólares, ya que el precio por tonelada
métrica, era de dos mil dólares (2000$), esta gran perdida se atribuye al
desconocimiento de la enfermedad y el estado de abandono de las plantaciones
(Enriquez 2001:9).
La sintomatología de la Moniliasis varía principalmente con la edad del fruto
y la intensidad del ataque. Se ha determinado que la incidencia de la Moniliasis
sobre el fruto puede ocurrir en todos los estados de su desarrollo fisiológico
(Porras y Sánchez 1991:10).
En las primeras etapas de desarrollo el fruto de cacao es mas susceptibles
a la infección de la M. roreri. En el interior de la mazorca las almendras se pudren
y se trasforman en una maza parda, Todas las almendras pueden quedar
afectadas sin que síntomas exteriores puedan delatarlo. El fruto a simple vista
aparenta estar sano. Sin embargo pueden aparece manchas pardas parecidas a
los estragos de la Phytophthora palmivora, pero una mazorca atacada con M.
roreri presenta en el interior una maza totalmente putrefacta (Enríquez et al.
1985:8). Muchas veces se ve el fruto muerto, ennegrecido y comprimido, todavía
colgando del árbol, cubierto de una “felpa” de color crema que corresponde a las
esporas del hongo (Soria 2000:6).
Las alternativas de control existentes contra ésta enfermedad, son los
controles químicos, por resistencia, manejo cultural y control biológico. El control
químico ha sido uno de los más estudiados y presenta una gama de alternativas
para el control de ésta enfermedad, pero no se justifica como el método más
2
efectivo y su costo normalmente se encuentra fuera del alcance para el pequeño
agricultor (Enríquez et al. 1985:4).
El presente estudio explora la posibilidad del combate biológico de la M.
roreri mediante el uso de microorganismos eficientes (EM), con el propósito de
ofrecen mayores alternativas al agricultor al momento de definir o redefinir el
manejo de una plantación.
El control biológico es una alternativa viable que se fundamenta en el uso
de un organismo o subproductos del mismo para eliminar y/o suplir el crecimiento
de otro organismo, la aplicación de antagonistas microbianos para el control
biológico de fitopatógenos ha sido catalogada como un componente importante en
el manejo integrado de las enfermedades de las plantas y como una alternativa
viable a los pesticidas químicos. El conocimiento de los tipos de antagonismos es
necesario para desarrollar una buena estrategia en la implantación de una
agricultura sostenible.
Estudios realizados por Krauss (1998:1) han demostrado que el control
biológico mediante el uso de microorganismos antagonistas, acompañado del
control cultural (remoción de frutos) redujo la incidencia de la Moniliasis hasta un
100 % en las parcelas abandonadas, 78% en las parcelas con manejo cultural
mejorado y un 36% en las parcelas tratadas con antagonistas. Los rendimientos
se incrementaron en un 300% y además demuestra que el control biológico no
solo protege a los frutos de la infección sino que también previene el desarrollo y
la diseminación de este patógeno.
El uso de microorganismos eficaces (EM) como agente de control biológico,
ha sido probado en el cultivo de cacao. La aplicación de EM5 (mezcla de melaza,
vinagre y alcohol fermentada con EM) logró reducir el porcentaje de infección de
Moniliasis de forma altamente significativa, en comparación al testigo que no
poseían ningún tratamiento (Ramón 2000:11).
3
En esta oportunidad se utilizó los microorganismos eficaces (EM) y
fermentos preparados a partir de EM para evaluar el efecto de supresión del
hongo Moniliophthora roreri y así evaluar sus posible mecanismos antagónicos.
4
2. REVISIÓN DE LITERATURA
2.1. ETIOLOGÍA DEL AGENTE CAUSAL
El agente causal de la Moniliasis es el hongo Moniliophthora roreri y la
clasificación taxonómica del hongo es la siguiente: Clase Deuteromicete
(imperfecto), orden Moniliales, familia Moniliaceae, género Moniliophthora especie
roreri. (Enríquez y Paredes 1989:7).
En la actualidad se desconoce el estado imperfecto del hongo (sexual), por
lo que se cree que su reproducción se realiza solo asexualmente por conidios. Los
conidios son la única estructura, hasta ahora conocido, capaz de causar infección
(Porras y Sánchez 1991:10).
2.2. HOSPEDERO
El hongo Moniliophthora roreri solo ha sido encontrado atacando los frutos
de los géneros Theobroma y Herrania, ambos de la familia Sterculiacea (Porras y
Sánchez 1991:10).
2.3. CICLO DE VIDA DEL PATÓGENO
Se ha observado que la mazorca es el único órgano afectado de la planta
por el patógeno M. roreri. La susceptibilidad de las mazorcas, depende tanto del
cultivar como del estado de crecimiento del fruto, la susceptibilidad decrece a
medida que el fruto madura.
El estado de conidia de la Moniliasis, es el único estado de propágulo de
infección conocida. Los conidios se mantienen como principal fuente de inoculo al
permanecer viables en mazorcas momificadas que no fueron removidas del árbol.
5
La duración de los conidios en el fruto momificado es de 9 meses. (Jiménez
1986: 3)
La penetración del hongo ocurre directamente a través de la base de los
pelos glandulares. Primeramente el hongo alcanza cierto grado de desarrollo
sobre la superficie de la mazorca antes de iniciar la formación de las hifas
infectivas, que aparentemente penetran sin la formación de estructuras
apresoriales de ninguna especie. Al atravesar la epidermis, el hongo empieza a
diseminarse intercelularmente por medio de las conidias, las cuales al alcanzar un
determinado desarrollo producen más hifas infectivas que penetran y destruyen el
interior de las células, relacionado con la aparición de los primeros síntomas de la
enfermedad (Porras 1982: 4).
Según Jiménez (1986:3), para que ocurra el proceso de infección se
requiere de agua que provoque un ambiente saturado de humedad en la epidermis
del fruto.
Cuando los frutos menores (2 meses) son infectados, continúa su
crecimiento aparentemente normal, pero posteriormente desarrolla protuberancias
o abultamientos de color ligeramente más claro y brillante. Cuando los frutos han
llegado a la mitad de su desarrollo y son atacados por el hongo, no se deforman,
en este caso la enfermedad se manifiesta en forma de pequeños puntos aceitosos
de color verde oscuro. En ambos casos, la enfermedad se caracteriza por la
aparición del mismo sobre el pericarpio de la mazorca de una o varias manchas de
coloración marrón (chocolate) de borde irregulares, que hasta algunas veces pude
llegar a cubrir la totalidad del fruto; generalmente la mancha está rodeada de una
zona de transición de color amarillo (Porras 1982:4).
Sobre la superficie de la mancha crece un estroma, especie de “felpa” firme
y blanca de micelios de M. roreri pudiendo llegar a cubrir la totalidad de la mancha,
y sobre la cual el organismo produce gran cantidad de esporas que al madurar
dan al estroma un color cremoso.
6
Los frutos que son infectados después de los dos o tres meses de edad no
manifiestan síntomas externos de ninguna clase, o solo presentan puntos
pequeños de apariencia aceitosa o pequeñas manchas necróticas, también
pueden aparecer manchas de color amarillo en las mazorcas verdes, o naranja en
las mazorcas moradas, algunas veces ocupando más de la mitad de la mazorca.
Estos síntomas provocan una maduración prematura de la parte infectada, estos
frutos presentan infecciones tardías u ocultas que solo se diferencian de los frutos
normales no infectados por ser más pesados, debido a la destrucción de las
semillas y de tejidos internos, donde se produce una podredumbre con
acumulación de una cantidad de líquido apreciable (Porras 1982: 5).
2.4. SINTOMATOLOGÍA
La Moniliasis, ataca el fruto de cacao en todos los estados de desarrollo,
pero es más severa en frutos jóvenes según Merchán (1978:12), por lo que
cualquier manejo que se pretenda hacer tiene que ser desde las primeras etapas
de desarrollo de la mazorca.
El momento de la aparición de los primeros síntomas es muy variable, tanto
para mazorcas del mismos cultivar o en mazorcas inoculadas artificialmente de
forma simultánea. Depende principalmente de la edad de los frutos, del cultivar del
inóculo y de las condiciones ambientales imperantes (Phillips 1986:5).
Siguiendo la nomenclatura descrita por Whertzel y citada por (Phillips,
1986:16), los síntomas de la Moniliasis del cacao pueden clasificarse en necrosis
e hiperplasias. Los síntomas necróticos se caracterizan por la degradación de los
protoplasmas, seguida por la muerte de las células de los tejidos. Los síntomas
pueden ser plesionecróticos, cuando se expresan antes de la muerte de los
protoplasmas, u holonecróticos, cuando se manifiestan después de ésta. Dentro
de los síntomas plesionecróticos se encuentran los siguientes:
7
a)
Hidrolosis: comprende los “puntos aceitosos”, consiste en la
aparición de manchas traslúcidas, que corresponden a tejidos
infectados, donde los espacios intercelulares contienen líquidos
desprendidos de células con daños en la membrana del
protoplasma. Frecuentemente éste síntoma precede al desarrollo
de los síntomas holonecróticos.
b)
Amarilles: corresponde a la “madurez prematura o irregular”, que
resulta de la desintegración de la clorofila.
Los síntomas holonecróticos que se manifiestan mediante los tejidos, en los
cuales la necrosis forma una mancha parda, es denominado usualmente como
“mancha chocolate”.
La necrosis interna conduce a la descomposición de los tejidos y las
almendras, que ocasiona una podredumbre acuosa dentro de los frutos. Estos al
perder el agua, se secan y se arrugan, produciendo síntomas comúnmente
conocidos como “momificación”.
Las hiperplasias son el resultado del aumento en el número de células de
los tejidos, que se manifiestan por medio de tumefacciones. Este síntoma es
comúnmente llamado “abultamiento o jiba”.
Los signos del patógeno se producen sobre las manchas pardas, y se
caracterizan por presentar un micelio muy denso y compacto de color blanco
denominado estroma. Sobre el estroma aparece posteriormente una gran cantidad
de conidios que le dan a la masa micelial, una tonalidad café claro.
2.5. COMBATE
Por las características que presenta la enfermedad, el método más efectivo
y económico a utilizar como control, es la ejecución oportuna de prácticas
8
culturales. El combate de lmonilia es costoso y no siempre presenta un buen
éxito.
2.5.1. Combate Cultural
El control más eficiente, lo constituye el combate cultural, y la ausencia de
aplicación de la misma, favorecería al aumento de la incidencia de moniliasis.
Dentro de las prácticas utilizadas, se encuentra las siguientes:
a. La poda sanitaria, que consiste en la remoción semanal de frutos
enfermos después de iniciada la etapa de cuajamiento, se realiza con la
finalidad de evitar que el hongo tenga tiempo para formar conidias que
pueden infectar al fruto de otras plantas. Los frutos removidos deben
dejarse sobre el suelo donde, aparentemente, el hongo se inactiva por
un mecanismo biológico (Phillips 1986:5). Con ello se busca producir un
cambio en el microclima de la plantación que desfavorezca al patógeno
y beneficie de la plantación.
b. Drenaje, con el fin de reducir la humedad presente en la plantación,
para crear un medio menos favorable para el desarrollo del hongo.
c. Deshierbas, frecuentes para mantener un ambiente más seco y menos
propenso a crear un microclima húmedo, a causa del rocío que cae
durante la noche.
d. Podas para mantener a la planta libre de ramas no funcionales y
regulación de sombra (Porras y Sánchez 1991:14).
2.5.2. Combate Químico
Se ha observado que el control químico no siempre ha sido el más
adecuado puesto que la enfermedad todavía representa un factor de pérdida al
9
productor. Experimentos anteriores han demostrado que el combate de la
enfermedad por medio de productos químicos es antieconómico y ineficaz. La
aplicación de fungicidas son de alto costo, sobre todo si se considera, el número
excesivo de aplicaciones que hay que hacer para lograr una cobertura adecuada
del producto, respecto a la mazorca en los periodos de rápido crecimiento y de
lluvias frecuentes (Phillips 1986:13).
El combate químico según Sánchez (1982:6), ha logrado reducir la
incidencia en ciclos cortos, pero las prácticas son en su mayoría de alto costo
económico, inconsistentes y variables, y en algunos casos se ha presentado
disminución en la producción y aumento de la marchites fisiológica.
En un experimento realizado en la estación experimental la Lola, Costa
Rica, las aplicaciones químicas han reducido en forma moderada pero significativa
la incidencia de la enfermedad, y aumentó de igual manera los rendimientos, sin
embargo, el testigo no compensó el costo total de la aplicación (Phillips 1986:14).
Para lograr una mayor eficiencia en las aplicaciones de fungicidas en una
plantación de cacao, Porras y Sánchez (1991:12), recomiendan lo siguiente:
a. Que las plantaciones tengan una cantidad de producción e ingreso que
atribuya su aplicación.
b. Presencia de alta cobertura de fungicidas en el producto, por lo que es
preferible que los frutos se encuentren localizados en troncos y en las
ramas bajeras del árbol.
c. Ciclos de aplicación reducidas, por lo que la plantación debe presentar
floraciones y fructificación bien definidos.
10
2.5.3. Combate por resistencia
Las diferentes especies existentes de cacao presentan diferencias en
cuanto a susceptibilidad y resistencia, con esto se demuestra que las fuentes más
resistentes presentes, pueden ser utilizadas y mejoradas.
Jiménez (1986:6), afirman que el combate por resistencia es una técnica utilizada
debido a la gran diversidad genética del cacao. Los clones que se han obtenido ha
sido mediante la inoculación artificial ya que el inóculo natural está limitado en la
edad del fruto y presión del inóculo.
En Costa Rica, se ha realizado inoculaciones artificiales de cultivares que
operan en dependencia de la estación y localidad, tales como UF-296, UF-273,
EET-75, EET-183, EET-67. Los cultivares resistentes a la Moniliasis, forman parte
del combate integrado, incluyento prácticas culturales. Actualmente estos
cultivares están siendo utilizados para la producción de híbridos, de los cuales se
espera que además de mejorar el cultivo, también incremente los ingresos de los
productores.
2.5.4. Combate Biológico
El combate biológico según Jiménez (1986:7), es la disminución de la actividad
del patógeno causante de la enfermedad, a través de la acción de uno o más
organismos diferentes al ser humano que consiste en:
1. Reducción de inóculo, clasificado como un combate biológico del inóculo. Este
combate consiste en controlar la población del patógeno.
2. Reducción de la infección en el fruto, clasificado como protección biológica de
la epidermis del fruto. Este tipo de combate tiene el objetivo de colonizar el
fruto con el microorganismo a utilizar como control, para interferir con las
actividades del patógeno.
11
3. Reducción de la severidad en el fruto por parte del patógeno, caracterizado
como combate por inducción de resistencia. La metodología está relacionada
con la estrategia de control del hospedante.
2.6. ANTAGONISMO
Jiménez (1986:14), afirma que, antagonismo es la interferencia que puede
ejercer un microorganismo en las actividades de otro microorganismo, localizado
ambos en un mismo nicho o microambiente.
Para utilizar cualquier tipo de microorganismo antagónico ya sea en
condiciones ambientales naturales o in vitro, se requiere que el microorganismo
ejerza el control y sobreviva en el nicho del patógeno.
2.7. USO DE MICOORGANISMOS EFICACES (EM)
Los microorganismos eficaces (EM) producen hormonas de plantas,
sustancias bioactivas beneficiosas y antioxidantes durante la solubilización de
nutrientes. Los subproductos metabólicos de los microorganismos eficaces
catalizan la energía presente dentro del ecosistema el cual crea un ambiente más
sano para la planta (Wood, et al. 1993).
El uso de EM (Microorganismos eficaces), está basado en la filosofía donde
un grupo de microorganismos eficaces alcanzan una co-prosperidad por medio de
la cooperación y la co-existencia. Esta mezcla fue desarrollada por Dr. Higa de la
Universidad de Ryukyus de Japón.
El EM viene a ser un cultivo mixto de microorganismos no patogénicos que
se encuentran de manera natural en el medio, esté cóctel de microorganismos se
encuentra compuesto por bacterias procesadoras de ácido láctico, levaduras y
bacterias fotosintéticas. Los microorganismos co-existen en un medio líquido
natural y al momento que se introducen al ambiente, los efectos sinergéticos son
beneficiosos.
12
Su composición en general es por bacterias procesadoras de ácido láctico,
levaduras y bacterias fotosintéticas.
Algunas de las sustancias secundarias que son producidas por los
microorganismos del EM son las inositol, ubiquinone, saponinas, polisacáridos de
bajo peso molecular, polifenoles y quelatos. Estas sustancias pueden inhibir
patógenos, pero permitir el crecimiento de las especies benéficas (Higa s.f.).
Las sustancias antioxidantes son producidas al degradar materia orgánica.
Se menciona que estas sustancias detoxifican, desionizan sustancias peligrosas y
quelatan minerales pesados, además inducen a los microorganismos a liberar
enzimas descomponedoras, como la lignina peroxidaza (Higa s.f.).
El EM no debe considerarse como un fungicida, pues es una medida
biológica para suprimir o controlar patógenos, a través del incremento de la
competencia y antagonismo (APNAN 1995). Dentro de los principales grupos de
microorganismos se hallan:
Bacterias fototrópicas o fotosintéticas: este tipo de bacterias se
automantienen a partir de secreciones de raíces, materia orgánica y gases
sulfhídricos. Los aminoácidos, ácidos nucleicos, sustancias bioactivas y azúcares
producidos por las bacterias fotosintéticas incrementan su desarrollo y a la vez el
desarrollo de otros organismos como las micorrizas, debido a que facilitan
compuestos nitrogenados.
Por otro lado las bacterias fototrópicas producen ondas de resonancia, con
altas frecuencias de rayos equis (X) y gamma. Se ha dicho que tales ondas son
capaces de transformar la energía negativa en positiva (Higa s.f.).
Bacterias Ácido Lácticas: este es el grupo más grande en el coctel del
EM (Higa y Parr 1994, citados por Edens et al. 1997).
13
Las bacterias ácido lácticas producen sustancias inhibitorias tales como la
reuterina, la cual es fungistática e inhibe el crecimiento de otras bacterias y
protozoos (Edens et al. 1997).
Además, el ácido láctico proviene de azúcares y otros carbohidratos
secretados por las bacterias fotosintéticas y levaduras. El ácido láctico es una
sustancia capaz de esterilizar y suprimir microorganismos dañinos. Estas bacterias
aceleran la descomposición de la materia orgánica, ya que promueven el
rompimiento y fermento de la lignina y celulosa (Edens et al. 1997).
Levaduras: este tipo de hongos sintetizan sustancias antimicrobianas,
hormonas y enzimas a partir de aminoácidos y azúcares secretados por bacterias
fotosintéticas, materia orgánica y raíces, las cuales sirven de sustratos para las
bacterias ácido lácticas y actinomycetes.
Actinomycetes: estos hongos producen sustancias inhibidoras de hongos
y bacterias (como los antibióticos), a partir de los aminoácidos secretados por
bacterias fotosintéticas y materia orgánica.
Hongos fermentativos: Este tipo de hongos se encargan de descomponer
la materia orgánica en alcohol, ésteres y sustancias antimicrobianas, eliminando
de ésta manera el desarrollo de moscas y malos olores.
El efecto del EM sobre la supresión de algunos hongos patogénicos fueron
investigados obteniendo buenos resultados (Castro et al. 1993:2). El autor indica
que la aplicación de EM bajo condiciones de laboratorio reduce de manera
considerable el crecimiento del hongo patogénico tales como: Sclerotium rolfsii,
Phythium sp, Rhizoctonia solani, Colletotrichum, Gloeosporioides, Alternaria sp y
Thielaviopsis oxysporium. Estudios realizados en el campo la aplicación de EM
demostró un efecto potencial para el control de Xanthomonas campestris en el
cultivo de chile dulce (Castro et al. 1993). También se obtuvieron buenos
14
resultados en el manejo de sigatoka negra en el cultivo de banano causado por
Micospharella fijiensis ( Elango 1997).
A partir del producto biológico EM, se pueden preparar otros productos del
tipo repelente natural conocido como EM5, que es un fermento proveniente de la
mezcla de vinagre natural, alcohol, melaza y EM activado. Este producto funciona
como repelente natural y no tóxico. Se usa para prevenir enfermedades y evitar
acercamiento de plagas insectiles, la aplicación del mismo fortalece más la barrera
de protección en la superficie de las plantas para evitar la invasión de patógenos
(Okumoto 2001: 1).
Nasiruddin (1995) reportó que la aplicación de EM5 redujo el daño por
insectos tales como: Vaulacophora foveicollissy y Bactrocera cucurbitae en el
cultivo de pepino. Estudios realizados por Wood et al. (1999), la aplicación de
EM5 combinado con extracto de plantas fermentadas redujo significativamente el
daño causado por Dhiaphania nitidalis y aumentó considerablemente
la
producción del pepino.
Ramón (2000) investigó el efecto del EM5 sobre la Moniliasis del cacao en
el campo. Las aplicaciones semanales del producto redujeron significativamente el
porcentaje de mazorcas infestados por la enfermedad y aumentó la producción de
las frutas de cacao.
También es necesario mencionar la función de inmunidad y resistencia que
desempeñan los microorganismos endófitos. Comprenden a hongos y bacterias
que viven sin causar daño en el interior de células o tejidos de plantas durante una
parte considerable de su ciclo de vida (Quispel 1992).
En general, los microorganismos endófitos pueden localizarse en espacios
intracelulares, intercelulares o en el tejido vascular (Reinhold y Hurek 1998).
15
La diversidad y número de bacterias rizoféricas es muy grande, lo cual
ocasiona que en este ambiente exista una fuerte competencia por los nutrientes y
en consecuencia que su disponibilidad sea limitada. Sobre esta base se ha
considerado que las bacterias endófitas podrían tener algunas ventajas
competitivas sobre las bacterias rizosféricas, ya que la disponibilidad de nutrientes
es mayor en el interior de las plantas y el número de microorganismos endófitos es
menor que el de los rizosféricos (James 2000). Por otro lado, las bacterias
endófitas se encuentran mejor protegidas que las rizosféricas de las condiciones
adversas que se presentan en el medio ambiente (Quispel 1992).
Las bacterias endófitas se ubican en contacto íntimo con las plantas, ellas
podrían brindar beneficios más directos a su hospedero en comparación con las
bacterias rizosféricas. Por ejemplo, podrían excretar fitohormonas en el interior de
las plantas y/o protegerlas contra la acción de los fitopatógenos. Se ha
demostrado que algunas fitohormonas, e.g., ácido indol acético, producidas por los
microorganismos rizosféricos pueden provocar un aumento de la superficie de la
raíz, permitiendo a la planta una mayor absorción de nutrientes (Ocón y González
1994:5).
La protección podría ser a través de efectos antagónicos, debido a la
producción de substancias que inhiben el crecimiento de los patógenos (Quispel
1992), o bien, por el desencadenamiento de una respuesta de defensa de la
planta en contra de patógenos inducida por el endófito, en forma similar a la que
se observa con algunas rizobacterias.
16
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GENERAL
Determinar el efecto supresivo de los microorganismos eficientes (EM y
EM5) y fermentos preparados a base de EM, sobre el patógeno Moniliophthora
roreri, a nivel del campo y en la laboratorio en el cultivo de cacao.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Evaluar la capacidad antagónica de los microorganismos eficaces (EM y EM5)
y fermentos preparados con EM, sobre el crecimiento de conidios de M. roreri
bajo condiciones de laboratorio.
2. Evaluar el efecto de los microorganismos eficaces (EM y EM5) y fermentos
preparados con EM, sobre la inhibición en el crecimiento del micelio de
Moniliophthora roreri bajo condiciones de laboratorio.
3. Evaluar en el campo el efecto de los microorganismos eficaces (EM y EM5) y
fermentos preparados con EM en la supresión de Moniliophthora roreri
mediante inoculación artificial.
17
4. METODOLOGÍA
4.1. LOCALIZACIÓN Y ÁREA EXPERIMENTAL
El presente trabajo se llevo a cabo en la finca académica, propiedad de la
universidad
EARTH
ubicada en la localidad de las Mercedes de Guácimo,
provincia de Limón, en la zona Oeste de la vertiente Atlántica de Costa Rica, a
83° de longitud oeste y 10° de latitud norte, aproximadamente a 59 msnm. La
precipitación promedio anual es de 3470 mm, las temperaturas promedio anual es
de 25.1 C° y la humedad relativa promedio anual de 87% respectivamente.
Holdridge considera la zona comprendida dentro del bosque tropical húmedo,
cuyas características están determinadas por una precipitación anual mayor de
2000 y 4000 mm y una temperatura media anual superior a los 24°C.
El trabajo de laboratorio se llevó a cabo en la universidad EARTH en los
laboratorios de Ciencias Naturales.
4.2. MATERIAL EXPERIMENTAL
Se utilizó árboles de cacao, de la finca académica, de una plantación con 8
años de edad, sembrados a distancia de 3 x 3 m, ubicados en la última sección. El
material es híbrido destinado para producción comercial y provenientes del cruce
de clones híbridos (Variedad matina). El manejo técnico de la plantación se viene
desarrollando de manera tradicional.
18
4.3. EXPERIMENTOS
4.3.1. Ensayo 1: efecto antagónico de los microorganismos eficaces sobre
conidios de M. roreri
Este experimento se realizó con el fin de evaluar el efecto de los
microorganismos eficaces y filtrado de los mismos, sobre la germinación de los
conidios de M. roreri.
a) Tratamientos
Los tratamientos evaluados durante los experimentos, y su respectivo código,
son los siguientes:
Testigo (T1) o control por medio de la aplicación de agua destilada estéril e
inoculación artificial. El EM5 (T2), EM activado (T3), la utilización de fermentos de
mazorca sana (T4) y mazorca enferma (T5), ambas a partir de EM activado. Los
otros tratamientos consisten en la utilización de filtrados de EM5 (T6), EM activado
(T7), fermento de mazorca sana (T8) y de fermento de mazorca enferma (T9).
b) Preparación de Tratamientos
Activación de EM: la preparación de EM activado consiste en la utilización
de EM y melaza, ambas en una proporción del 5% y agua en un 90%.
Después de realizar la mezcla (dilución de melaza en agua), la solución
debe ser fermentada a temperatura de 20 – 30 °C, bajo condiciones anaeróbicas,
quitando el gas que produce el proceso, y confirmando el buen olor, color y pH
inferior a 3.5, durante una semana.
EM5: es un fermento de la mezcla de vinagre natural, alcohol, melaza y EM
que funciona como repelente natural. La preparación consiste en el uso de
materiales como EM activado, melaza, alcohol y vinagre cada uno en una
19
proporción del 10% y finalmente la utilización de agua limpia sin cloro a 60%
(Okumoto 2001).
Fermento de mazorca sana y enferma: fermento de mazorca sana o
enferma (mazorcas enfermas con Monilia) con EM son también otro tipo del
fermento que se realiza a partir del material vegetal de interés, más melaza, agua
y EM. La melaza y EM deben estar en un contenido de 3 % del volumen total del
agua. El proceso de preparación consiste en mezclar el EM y melaza en agua
seguido del material vegetal a utilizar. Después se prosigue a cubrir el producto
asegurándose de que el envase esté totalmente lleno, luego se almacena en un
sitio con temperatura entre 25 – 30°C sin exposiciones directas al sol, esta
prácticas se realizan con el objetivo de crear un medio que permita la activación
de organismos antagonistas (Okumoto 2001).
Con el uso de fermentos de mazorca sana, pretendemos producir
microorganismos antagonistas que habitan en la superficie de la fruta de cacao,
con la mazorca enferma pretendemos aumentar los microorganismos del hongo
patogénico y crear un ambiente antagonista a M. roreri, ya que donde existen
microorganismos
patógenos
pueden
existir
posibles
microorganismos
antagonistas (Okumoto 2001).
Filtrados de los productos: con el proceso de filtrado, se desea obtener
los subproductos (excretas, exudados, agentes bactericidas y micóticos, entre
otros) proveniente de los metabolismos de microorganismos existentes en cada
uno de los tratamientos. Se pretende evaluar que no solo los microorganismos
tienen efecto sobre el hongo, sino, también los subproductos que ellos producen.
El proceso consistió básicamente en filtrar cada unos de los productos por medio
de una membrana (22 micras) la cual no permite el paso de ningún
microorganismo.
20
c) Instalación del experimento
El porta-objeto fue cubierto utilizando como medio de cultivo agar-agua.
Posteriormente en el porta–objeto se colocó en un plato petri con un papel filtro
mojado en la base y un tubo de vidrio en forma de uve (V).
Se introdujo una suspensión conidial con una gota de 0.01 ml.
Anteriormente fue colocado 0.01 ml de cada tratamiento en la superficie de dicho
porta-objeto, expuesto a temperatura ambiente (24-27 °C). Pasado las 24 horas,
se tiñó las conidias con azul de algodón en lactofenol, (Fravel y Spurr, 1977). Las
concentraciones de EM utilizadas para cada tratamiento fueron directamente de la
solución madre.
d) Variables a evaluar y análisis estadístico
La variable evaluada fue el porcentaje de germinación de las esporas. Para
evaluar la germinación se observó en el microscopio cada porta-objeto con 5
campos al azar al menos 20 esporas. El número total y el número de conidios
germinados fueron contados para cada campo microscópico. Con ello se calculó
el porcentaje de germinación de conidios. Como observación cualitativa, se tomo
en cuenta también la producción de lisis y la apariencia del tubo germinativo.
Para la determinación de efectos antagónicos se compararon los
tratamientos contra testigo, mediante la prueba de Dunnett, de acuerdo a cada
categoría de medición.
4.3.2. Ensayo 2: Efecto de los tratamientos filtrados sobre la inhibición del
micelio bajo condiciones aeróbicas
Este experimento se realizó para evaluar el efecto supresivo de los filtrados
de microorganismos eficaces y fermentos sobre el crecimiento de micelio del
hongo Moniliophthora roreri, bajo condiciones de laboratorio.
21
a)Tratamiento
Entre los tratamientos utilizados para evaluar el efecto del crecimiento
sobre el micelio del hongo, en laboratorio, son: el Testigo (T1) o control por medio
de la aplicación de agua destilada estéril e inoculación artificial. Los otros
tratamientos consisten en la utilización de filtrados de EM5 (T2), EM activado (T3),
fermento de mazorca sana (T4) y de fermento de mazorca enferma (T5).
b) Instalación de experimento
Las sustancias de cada tratamiento se mezclaron con agar–agua a una
relación de 1:9 v/v, posteriormente se prosiguió a inyectar en los platos petri,
autoclavados con anterioridad.
En el centro de este medio de cultivo. Se colocó un disco del hongo M.
roreri (6 mm) efectuado mediante la utilización de un sacabocado, dicho hongo fue
previamente cultivado en un medio de cultivo con agar–avena. Los platos petri se
mantuvieron a temperatura ambiente (24-25°C) en el laboratorio.
c) Variables a evaluar y análisis estadístico
Se midió el diámetro de la colonia del hongo. La toma de lecturas se realizó
24 horas después de la siembra, las lecturas se continuaron diariamente durante
2 semanas a partir de la ejecución del ensayo.
Para la determinación del efecto antagónico en el análisis estadístico, se
compararon
los tratamientos contra el testigo absoluto, mediante la prueba
Dunnett.
22
4.3.3. Ensayo 3: Efecto de los tratamientos (no filtrados) bajo condiciones
aeróbicas
Esta prueba se realizó con el objetivo de evaluar el efecto antagónico de los
tratamientos sobre la inhibición del crecimiento del micelio del hongo M. roreri bajo
condiciones aeróbicas.
a)Tratamientos
Para el efecto del estudio de desarrollo/inhibición de micelio de M. roreri en
condiciones anaeróbicas, los testigos utilizados fueron, el Testigo absoluto (T1) o
control, por medio de la aplicación de agua destilada estéril e inoculación artificial.
El EM5 (T2), EM activado (T3), la utilización de fermentos de mazorca sana (T4) y
mazorca enferma (T5), ambas, a partir de EM activado.
b) Instalación del experimento
Se trabajó con 4 tratamientos incluyendo un testigo absoluto. Para iniciar
con el experimento se preparó un agar especial a partir de avena, con el objetivo
de crear un medio rico en nutrientes y que permita el desarrollo del hongo. Se
chorrearon 10 ml de agar–avena en cada plato petri, posteriormente se colocó dos
discos de cultivo (7 mm) a los costados del plato. En medio de los discos de trazó
una línea con el tratamiento respectivo. Para finalizar cada uno de los tratamientos
fueron sometidos a la oscuridad a una temperatura de 24 °C.
c) Variables a evaluar
Se tomaron las lecturas del crecimiento del diámetro del hongo. La medición
se realizó al sexto día después de la siembra. Para determinar el efecto
antagónico, se compararon los tratamientos contra el testigo, mediante la prueba
de Dunett.
23
4.3.4. Ensayo 4: Efecto de inhibición sobre el crecimiento de micelio, bajo
condiciones anaeróbicas
Este ensayo se realizó para evaluar los tratamientos bajo condiciones
anaeróbicas y su efecto antagónico sobre el crecimiento del micelio de hongo M.
roreri.
a)Tratamiento
Los tratamientos para el ensayo #4 son, el Testigo (T1) o control por medio
de la aplicación de agua destilada estéril e inoculación artificial. El EM5 (T2), EM
activado (T3), la utilización de fermentos de mazorca sana (T4) y mazorca enferma
(T5), ambas a partir de EM activado.
b) Instalación de experimento
EL método empleado en esta práctica fue una modificación de la
metodología realizado por Castro et al (1993) usando dos capas de agar V-8 en
cada tratamiento.
c) Variables a evaluar y análisis estadístico
Las variables evaluadas, son similares al ensayo # 2, ya que se tomaron las
lecturas del crecimiento del diámetro del hongo. Las mediciones se realizaron 24
horas después de la siembra. Las lecturas se tomaron diariamente durante 2
semanas a partir de la ejecución del ensayo.
Para determinar el efecto antagónico, se compararon los tratamientos contra
el testigo, mediante la prueba de Dunett.
24
4.3.5. Ensayo 5: Efecto de los microorganismos eficaces sobre la supresión
de M. roreri en el campo con la inoculación artificial del patógeno
a) Tratamientos
Los tratamientos realizados en el campo, consistieron en la implementación
del tratamiento con inoculación natural (T1), la cual representa las condiciones
naturales de campo, el testigo o control (T2) por medio de la aplicación de agua
destilada estéril e inoculación artificial. El EM5 (T3), EM activado (T4), la utilización
de fermentos de mazorca sana (T5) y mazorca enferma (T6), ambas a partir de EM
activado.
b) Instalación de experimento
Se aplicaron los seis tratamientos incluyendo un testigo absoluto en las
mazorcas de cacao, con la edad de 30 días, aparentemente sano.
Estos frutos que previamente recibieron los tratamientos serán inoculación
artificial mediante la aspersión del patógeno M. roreri con la ayuda de un aspersor
“Devilbiss”. El inoculo se ajustó a una concentración de 100,000 conidias por ml y
finalmente se cubrió por 24 horas en una cámara húmeda (bolsa con papel toalla
húmeda en la base).
Se usó 21 plantas de cacao con su respectivo tratamiento, el cual varió en
dependencia de la disponibilidad de mazorcas sanas en la planta, procurando
tener varios tratamientos en una misma planta. El resultado de las mazorcas
muestreadas fueron 102.
c) Variables a evaluar y análisis estadístico
Las lecturas del experimento se efectuaron 90 días después de las
aplicaciones de campo (tratamientos y hongo). Se utilizó dos indicadores, los de
incidencia y severidad.
25
La incidencia trata del número de individuos enfermos o sanos y la
severidad incluye mazorcas enfermas, tomando grados de infección tales como:
puntos aceitosos, clorosis, mancha chocolate, estroma productiva y esporulado
total (Enríquez et al. 1985).
Para determinar el efecto antagónico, se realizó la prueba de Dunnett para
comparar los tratamientos contra el testigo. Para definir el mejor tratamiento, se
evaluó por medio de la prueba de Duncan. Las dos pruebas fueron efectuadas
por el sistema estadístico SAS.
26
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1. EXPERIMENTO EN EL LABORATORIO
El objetivo de los ensayos de laboratorio, fue observar el comportamiento
del hongo Moniliophthora roreri a la aplicación de los diferentes tratamientos, los
cuales son: EM, EM5, extractos de mazorca sana y enferma, y los filtrados de
cada uno de los tratamientos. Todos los tratamientos fueron aplicados con la
finalidad de exponer al patógeno a un ambiente de competencia y que interfiera
en su ciclo de vida.
5.1.1. Ensayo 1
En el experimento no se pudo establecer la edad del cultivo (medio de
cultivo) ni el periodo de latencia óptima. Se realizaron varias repeticiones tratando
de obtener una mejor germinación, se probaron con esporas jóvenes, maduras,
esporas de campo y esporas de laboratorio (cultivo), sin obtener resultados
satisfactorios o alguna diferencia con los resultados obtenidos.
De manera general el porcentaje de germinación del hongo M. roreri es
bajo ya que en ella inciden muchos factores que influyen de manera determinante
en el crecimiento y esporulación del hongo, que es afectado principalmente por
factores nutricionales y ambientales tales como el pH, temperatura, la luz, la
humedad, concentración de CO2 y O2, periodo de latencia, edad el cultivo entre
otros (Porras y Sánchez 1991: 23).
Experimentos comparativos demuestran que la edad del cultivo como el
periodo de latencia son uno los principales factores limitantes en la germinación
de esporas. Las esporas jóvenes y maduros dieron resultados que permitieron
establecer la gran diferencia entre ellos en relación con su habilidad germinatoria,
así como también establecer diferencias relacionadas con cada unos de los
factores citados anteriormente.
27
Cuadro 1. Efecto
de los microorganismos antagonistas sobre la
germinación de esporas de M. roreri
Tratamientos
Esporas Germinadas *
% Germinación
Lisis
Testigo
7
35
No
EM5 ( no filtrado)
3
15
No
EM ( no filtrado)
3
15
No
M. Sana ( no filtrado)
2
10
No
M. Enferma ( no filtrado)
0
0
No
EM5 (Filtrado)
4
20
No
EM (Filtrado)
-
-
-
M. Sana (Filtrado)
3
15
No
M. Enferma (Filtrado)
2
10
No
-No se presentan datos por contaminación.
* 20 observaciones por tratamiento.
Según el cuadro 1, se pude observar que los tratamientos no filtrados de
EM5, EM y fermentos de mazorca sana y enferma, presentaron menor porcentaje
de
germinación
comparado
con
el
testigo.
Es
decir
la
presencia
de
microorganismos afecta la germinación del hongo M. roreri.
La ausencia de los microorganismos en los tratamientos filtrados de EM5,
EM y de mazorca sana y enferma, también presentan efecto antagónico,
disminuyendo el porcentaje de germinación de las esporas. Por otro lado, los
tratamientos filtrado y no filtrados no mostraron lisis causada por enzimas. El
efecto antagónico puede influir presentando cambios en: pH, competencia
28
nutricional, antibióticos, enzimas y algunas sustancias inhibidoras del crecimiento
(Porras 1982: 13)
Estudios anteriores establecen que el pH óptimo para la germinación de
esporas de Monilia es de 6.0, debemos considerar que al aplicar cada uno de los
tratamientos el pH del medio de cultivo bajó a un pH de 3.8 –5.0, el cual pudo
influir de manera considerable en los resultados. Según los datos obtenidos, se
puede considerar que el mecanismos de efecto antagónico, por lo menos implica
el cambio de pH y algunas sustancias producidas por los microorganismos.
5.1.2. Ensayo 2
Cuadro 2. Efecto de los tratamientos filtrados sobre la supresión del micelio
del hongo M. roreri bajo condiciones aeróbicas
Tratamiento
Crecimiento del Significancia Diferencia de Significancia
micelio (mm)
Estadística las medias1 Estadística 2
Testigo
31.4
Filtrado EM5
20.0
*
11.4
A
Filtrado EM
22.7
*
8.7
B
Filtrado M. Enferma
24.1
*
7.3
B
Filtrado M. Sana
23.4
*
8.0
B
*diferencia significativa al 5% según Dunnett.
1: La diferencia entre medias
2: Las medias seguidas de la misma letra no difieren significativamente (P<005), según
Duncan.
Para determinar el mejor tratamiento, se prosiguió a calcular la diferencia
del crecimiento del hongo M. roreri, entre un tratamiento y un testigo como
inhibición.
29
Todos los tratamientos son diferentes al testigo, cualquier tratamiento
utilizado va ha influir en el crecimiento del hongo, según la prueba de Dunnett. Se
observa que el valor del tratamiento con filtrado de EM5 fue de 11.4 esto nos
indica que el producto más efectivo entre todos los tratamientos, ya que controló
mejor el crecimiento micelial del hongo.
El filtrado EM5 a diferencia del filtrado de EM es un fermento que proviene
de la mezcla de vinagre, alcohol, melaza y EM. Estos materiales, al ser pasados
por un proceso de fermentación, producen sustancias (ácido láctico, levaduras,
alcoholes, entre otros) que pudieron ayudar a controlar el crecimiento del micelio.
Se observó también que en condiciones aeróbicas el hongo presenta un mejor
crecimiento y vigorosidad.
Es importante mencionar que no solo los microorganismos presentes en el
EM, EM5 y demás fermentos, tiene un efecto en el crecimiento del hongo, sino
también los subproductos producidos durante el proceso de fermentación. Se
puede observar que los subproductos (filtrados) redujeron el crecimiento del
micelio.
Por otro lado, según estudios realizados por el ICA (s.f.), en Colombia,
aseguran que el pH así como también el medio de cultivo (agar) desempeña un
papel fundamental, que hace posible que el hongo pueda crecer en optimas
condiciones. El hongo puede crecer a un rango de pH entre 3.5 y 8.0, el desarrollo
micelial es más abundante a un rango de pH óptimo de 5.0 y 6.5. En cada uno de
los experimentos el
pH del medio de cultivo (incluyendo tratamiento) se
encontraba a un rango de 3.5 – 6.0, a excepción del testigo que prestó un pH de
6.5. Por tal motivo en necesario considerar que el pH es uno de los factores que
pudo influir en el crecimiento del micelio. También es importante mencionar el pH
del medio de cultivo tiende a la alcalinidad a medida que se desarrolla el hongo.
Las condiciones nutricionales y físicas deben ser adecuadas que no afecten
el normal crecimiento del hongo. En el caso de M. roreri aún cuando se han hecho
30
algunos
experimentos
sobre
medios
nutritivos,
no
se
ha
estudiado
sistemáticamente el efecto de estos sobre el crecimiento y esporulación. En la
actualidad solo se han probado medios a base de avena y V8 (Extracto de
vegetales), las cuales ayudan a promover el crecimiento del hongo. Los resultados
obtenidos en este experimento muestran claramente la importancia de definir un
medio de cultivo rico en nutrientes y que promueva el desarrollo del hongo, ya
que influyen de manera determinante en los resultados.
5.1.3. Ensayo 3
Cuadro 3. Efecto de los tratamientos sobre la inhibición del micelio M. roreri
bajo condiciones aeróbicas
Tratamientos
Crecimiento del micelio
mm
Significancia
Estadística *
Testigo
18
EM5
0
*
EM
0
*
M. Sana
0
*
M. Enferma
0
*
* Diferencia significativa al 5% según Dunnett.
De acuerdo al cuadro 3, se puede observar el efecto antagónico de
cada uno de los tratamientos con relación al testigo. El efecto antagónico en
notable ya que el crecimiento del hongo es de 0 mm hacia el tratamiento. Se
puede observar claramente la interacción entre los microorganismos en las
figuras, #1 y #2. El desarrollo del hongo muestra un crecimiento lateral,
demostrando de esta manera el efecto antagónico de cada tratamiento con
respecto al testigo.
31
Figura 1. Efecto antagónico del EM5 sobre el hongo M roreri.
Figrura 2. Efecto antagónico (Testigo) sobre el hongo M roreri.
32
5.1.4. Ensayo 4
Tes tigo
E.M 5
E.M 1
M. Enferm a
M. Sana
35
mm
30
25
20
15
10
5
0
1
2
3
4
5
6
7
Dias
Figura 3. Desarrollo del micelio bajo el método de doble capa durante 7 días
de observación, en los diferentes tratamientos
En la figura 3, se observa el crecimiento micelial del hongo, en un periodo
de una semana, inicialmente el hongo presenta un crecimiento uniforme, se
observa que al tercer día el crecimiento se va diferenciando de acuerdo a cada
uno de los tratamientos. El testigo es el mayor crecimiento posee en comparación
con los demás tratamientos; el EM5 y el EM muestran un crecimiento similar. Los
tratamientos con M. sana y enferma fueron los que mejor controlaron el
crecimiento de hongo, pero es necesario mencionar que en estos tratamientos fue
muy difícil manejar la contaminación producida por microorganismos (bacterias)
provenientes de cada tratamiento.
Usando los datos de los últimos días de lectura, se realizó la prueba de
Duncan para determinar el mejor tratamiento.
33
Cuadro 4. Análisis de varianza correspondientes al último de día de lectura,
de los tratamientos y su efecto supresivo sobre el micelio del
hongo M. roreri bajo condiciones anaeróbicas
Tratamiento
Crecimiento del Significancia Diferencia entre Significancia
micelio mm
Estadística**
medias 1
Estadística 2
Testigo
30.9
EM5
11.2
*
19.7
A
EM
9.9
*
21
B
Fermento M.
Enferma
7.2
*
23.7
B
7
*
23.9
B
Fermento M.
Sana
*diferencia significativa al 5%, según Dunnett
2 :Las medias seguidas de la misma letra no difieren significativamente (P<005)
1 : Diferencia entre medias = crecimiento micelial (testigo) – crecimiento micelial (tratamiento)
La prueba de Dunnett en el cuadro 4, indica que todos los tratamientos son
diferentes al testigo. Es decir, que los tratamientos EM5 y EM bajo condición
anaeróbica presentan efectos antagónicos sobre el crecimiento del hongo
patógeno.
Según Duncan en el cuadro 4, indica que el mejor tratamientos fue el EM,
seguida del EM5, no se consideran los tratamientos con fermentos de mazorca de
cacao por presentar problemas de contaminación.
El ambiente anaeróbico el experimento hizo posible que los tratamientos
con EM5 y EM incentivaran la formación de bacterias ácido lácticas, quienes
pudieron suprimir el desarrollo del micelio (Edens et al. 1997). El efecto de pH no
es considerable, ya que estudios anteriores muestran que el crecimiento del
hongo, no se ve afectado por esta variable.
34
La metodología de la doble capa permite la presencia de bacterias en la
superficie de la segunda capa de agar, como se reporta en otro estudio realizado
(Wood 1997). La población de bacterias en la primera capa, no permite que el
tratamiento actúe sobre el hongo, ya que a las 24 horas ellas se expanden por
toda la caja pretri, imposibilitando la acción antagónica de los tratamientos.
En algunas cajas petri, se pudo observar que el micelio del hongo M. roreri
detenía su crecimiento, en contacto con una colonia de bacterias,
con esta
experiencia es recomendable chorrear la segunda capa de agar unas horas
después de haber colocado la primera capa.
El efecto inhibitorio sobre el crecimiento micelial del hongo se da por
efectos de competencia por espacio físico, nutrientes y por la producción de
subproductos (toxinas o enzimas). Parece indicar que las bacterias que se
encuentran en la superficie del agar no son las que generan los productos
antagónicos si no que son los compuestos presentes en la primera capa
(tratamientos).
Los microorganismos presentes en cada uno de los tratamientos ( EM, EM5
y fermentos de mazorca de cacao sana u enferma), incrementan su población
microbiana y por ende la concentración de sustancias antagónicas (subproductos)
con el pasar del tiempo. Este proceso permite que se de el efecto supresivo hacia
el patógeno.
35
5.2. EXPERIMENTO DE CAMPO
El objetivo de realizar el trabajo de campo, fue para observar la reacción del
hongo Moniliophthera roreri en presencia de los tratamientos de EM activado,
EM5, fermento de mazorca sana y fermento de mazorca enferma, mediante la
aplicación de inoculación artificial.
De acuerdo con los datos obtenidos en el cuadro 5, se observa que, el
mayor problema fitosanitario presente en las mazorcas, en orden descendente
pertenece a un 52% de mazorcas con Cherelle wilt, 41% con monilia, y 7% de
mazorcas sanas. El mayor porcentaje de mazorcas presentó el síntoma de
cherelle wilt, que es una Marchites fisiológica causada por la competencia que
ocurre entre las mazorcas grandes y los nuevos brotes, principalmente por
alimentación que proporciona el árbol (Porras y Sánchez 1991: 24).
Además, se observa que el tratamiento 1, representa las condiciones
naturales de la parcela en donde se realizó la investigación de campo, la cual da
referencia a la existencia de una alta presión de inoculo, demostrado en la no
presencia de mazorcas sanas. Los datos del T1, se asemejan al T2 (testigo), el
cual presentó un 100% de incidencia. Las características o indicadores de
incidencia resultados de la recopilación de datos de campo, representados en
valores de porcentaje, pueden observarse en el anexo como figuras uno (1), dos
(2), tres (3) y cuatro (4).
36
Cuadro 5. Observación de mazorcas que presentan el síntoma de marchites
fisiológica “Cherelle wilt” en el campo a 90 días después de iniciada el
experimento
Código
Tratamiento
Cherelle wilt (%)
Sano (%)
Monilia (%)
T1
Inoculación natural
59
0
41
T2
Testigo (inoculación
47
0
53
artificial)
T3
EM
35
24
41
T4
EM5
53
12
35
T5
Fermento M. Sana
47
6
47
T6
Fermento M. Enferma
71
0
29
52
7
41
Promedio
El efecto de los tratamientos fue evaluado mediante un análisis de varianza
y la prueba de Duncan para la comparación de los promedios, utilizando los datos
de mazorcas sanas y enfermas con monilia.
Los datos del cuadro 1 del anexo contiene información de un análisis de
varianza, el cual demuestra diferencia significativa entre plantas. Es decir, existe
diferencia entre plantas en cuanto a la respuesta en la inoculación artificial del
patógeno. Esto se debe a que los tratamientos fueron aplicados a diferentes
híbridos y por consiguiente presentaron diferente resistencia a la enfermedad.
37
Aunque no se presentó diferencia significativa entre los tratamientos en el
análisis de varianza, si se encontró diferencias entre algunos de ellos según la
prueba de Duncan.
Cuadro 6. Efecto de los tratamientos en el grado de infección de monilia,
según la prueba de Duncan
Código
Tratamientos
Severidad
Significancia estadística
**
T2
Testigo (inoculación artificial)
6.0
A
T6
Fermento M. Enferma
6.0
A
T5
Fermento M. Sana
5.11
AB
T4
EM5
4.50
BC
T3
EM
3.81
C
** Severidades que presentan la misma letra no son significativamente diferentes.
Los tratamientos con EM y EM5 tuvieron un mejor comportamiento
supresivo a la infección con monilia según la prueba Duncan. Los tratamientos T5
y T6 no demostró diferencia con el testigo. Estos resultados coinciden con los
resultados obtenidos en laboratorio, en cuanto a la diferenciación o significancia
estadística que presentan los tratamientos con EM y EM5 en relación con los otros
tratamientos, además, de acuerdo a un análisis cualitativo personalizado, se pudo
saber por medio de estudios anteriormente realizados revelan que se logró
obtener esta diferenciación de tratamiento (EM y EM5), principalmente del efecto
positivo que causa el EM5.
Se conoce que una de los principales microorganismos presentes en el EM
son las levaduras, actinomicetes, bacterias fotosintéticas y las bacterias ácido
lácticas entre otras. Esta última son las que producen ácido láctico a partir de
azúcares y carbohidratos producido por bacterias fotosintéticas y levaduras. Se
cree que uno de los microorganismos que han dado respuestas positivas a los
38
tratamientos con EM y EM5, es la presencia de ácido láctico, ya que produce
sustancias antibacteriales (antibióticas), consideradas como inhibidores de
patógenos, demostrado en la habilidad que ha tenido en suprimir la propagación y
actividad de Fusarium (microorganismos que causa altos daños en diferentes
cultivos (APNAN 1995).
Las sustancias antibióticas u orgánicas producidas por microbios,
deterioran el crecimiento y actividad metabólica de otros microorganismos
(hongos, levaduras, bacterias etc.) provocando así cambios morfológicos en las
células de los hongos y a veces previenen la germinación de esporas, acción que
posiblemene resultó de las pruebas de laboratorio y campo.
A parte de los ácidos lácticos, también existe una serie de componentes
dentro de los cuales se incluyen carbohidratos, aminoácidos, antibióticos y
sustancias fenólicas, que toman un rol importante en la inhibición/estimulación del
crecimiento de patógenos. Los microorganismos eficaces (EM y EM5), también
secretan o proveen de aminoácidos, carbohidratos, variedad de vitaminas y
hormonas a las plantas. Los contenidos de aminoácidos y carbohidratos están
correlacionados con la susceptibilidad y resistencia a enfermedades (Andel 1965 ).
La producción de aminoácidos, que secreta el EM pudo tener un efecto en la
inhibición de la producción de enzimas de patógenos (hongos) que funcionan
degradando las paredes celulares de frutos. El efecto es fungistático, pero no
mata, tan sólo reduce el desarrollo patogénico.
Al aplicar los microorganismos eficaces, es posible crear una barreara
física, el cual es importante como mecanismo de defensa, ya que puede prevenir
la penetración de patógenos o prevenir mediante la producción de sustancias
inhibidoras. Estas sustancias inhibidoras pueden ser producidas por la cutícula de
la fruta o por el EM aplicado o una relación de ambos. La cutícula o sus
propiedades están relacionadas con la resistencia o susceptibilidad a patógenos,
que depende en gran mayoría del tipo de planta o su capacidad inhibidora.
39
La presencia de resistencia de las plantas, está relacionada con la cantidad
de fenoles que poseen, ya que las plantas resistentes tienen más fenoles o
polifenoles que las susceptibles. Los fenoles o componentes fenólicos,
particularmente la oxidación de esto poseen efectos inhibidores en la producción
de enzimas de patógenos que destruyen la pared celular (Mehta y Mehta 1979).
.
40
6. CONCLUSIONES
De acuerdo con los resultados obtenidos en la evaluación de los diferentes
tratamientos
en
laboratorio,
se
demostró
el
efecto
supresivo
de
los
microorganismos eficientes EM, EM5 y fermentos preparados a partir de EM,
sobre el patógeno Moniliophthora roreri en el cultivo de cacao.
Los tratamientos con EM5, EM y sus fermentos presentaron alta capacidad
antagónica sobre la germinación de esporas del patógeno y el crecimiento del
micelio bajo condición aeróbica y anaeróbica in vitro.
No solo los microorganismos tienen efecto sobre el desarrollo del hongo, sino
que, también los subproductos (filtrados) que intervienen y reducen de manera
considerable el desarrollo del patógeno. Esto indica que en los EM, EM5 y los
fermentos existen sustancias inhibidoras del crecimiento del patógeno.
De igual manera, los resultados en las prácticas de laboratorio, los
tratamientos con EM y EM5, fueron los tratamientos que presentaron una alta
capacidad antagónica en el campo, aunque se encontró diferencia estadística
entre las plantas en cuanto a la resistencia de la enfermedad.
41
7. RECOMENDACIÓN
Se recomienda que durante la elaboración del experimento de campo, que
se tome en consideración los siguientes:
La selección de la planta o híbrido a utilizar, es un factor que incide en gran
medida en la eficiencia del tratamiento.
Para efectos de las frecuentes pérdidas de fruto por marchites fisiológica o
Cherell wilt, se recomienda realizar mayor número de repeticiones al momento de
realizar cualquier estudio con el cultivo de cacao.
La toma de datos en función del tiempo, es una buena opción para poder
observar incremento de desarrollo de la enfermedad de monilia en las mazorcas
infectadas.
Es muy importante evaluar el efecto de EM y EM5 sobre la monilia con la
presión
de inoculo natural y determinar la concentración y frecuencia de la
aplicación.
42
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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215p.
46
9. ANEXOS
Cuadro 1 . Análisis de varianza para el efecto de los tratamientos con la
severidad de moniliasis.
Fuente
GL
Suma de Cuadrado Valor de Probabilidad
Cuadrados
medio
F
Planta
16
179.7048
11.2315
9.01**
< 0.0001
Tratamiento
4
2.2674
0.5668
0.46 NS
0.7649
Error
21
25.9326
1.2348
Total
41
16.0233
**: Valor significativo
NS: Valor no significativo
Figura 1. Mazorcas sana, resultante del experimento.
47
0
Figura 2. Mazorca con síntoma de marchites
Figura 3. Mazorca con esporulado total
48
Figura 4. Mazorca son síntomas de estroma productivo
49