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Protocolos de investigación:
Ejemplo Probióticos de leche
materna.
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Health
from nature
*
1
Juan Carlos de Gregorio
La situación... de la
investigación
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*
2
• La Biotecnología en España llega
en un momento adecuado en el
que existe una base científica con
gran capacidad de generación de
conocimiento y transferencia de
tecnología hacia las empresas y la
sociedad
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*
3
Programa Ingenio 2010
El programa Ingenio 2010 pretende involucrar al Estado, la
Empresa, la Universidad y otros Organismos Públicos de
Investigación en un esfuerzo decidido por alcanzar en I+D
el nivel que nos corresponde por nuestro peso económico
y político en Europa.
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4
Programa CENIT
"Consorcios Estratégicos Nacionales en Investigación Técnica"
• Enmarcado en el programa Ingenio 2010.
• Adscrito al CDTI para su gestión (Centro para el Desarrollo
Tecnológico Industrial).
• Fomenta la colaboración público-privada.
• Contempla la financiación de grandes proyectos globales
integrados de investigación industrial de carácter
estratégico.
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5
datos
• + de 3.000 millones de euros ppto de Ministerio de
Educación y Ciencia
• 35 % a la Dirección General de Investigación
TOTAL: 3.146.361.000,05
Dirección
General de
Investigación
35,3%
56,9% Dirección General
de Política Tecnológica
Dirección General de
Universidades
3,6%
2,7% CSIC
Recursos presupuestarios del Ministerio de Educación y
Ciencia*
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6
“No hay inversión más rentable que la del
conocimiento"
(Benjamín Franklin)
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7
581 empresas biotecnológicas se
repartieron, en 2006, una facturación de
593 millones de Euros
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8
09/06/2009
*
9
Y que opina el consumidor ?
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10
Quien ha oido hablar de
biotecnología??
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
19921994199519961997199920002001200220032004200520062007
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11
Product life cycle
Need to innovate
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12
La evolución…y la empresa.
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• El análisis de viabilidad de
productos biotecnológicos, desde
la identificación de ideas y el
análisis inicial, hasta la traslación
de la idea al mercado, es un
proceso continuo analítico y de
traslación
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Investigación traslacional
La investigación traslacional,
consistente en la aplicación de los
conocimientos básicos del
laboratorio a la práctica clínica.
Definición de todos los
procedimientos y actuaciones para
convertir una posible idea en un
producto saludable
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Investigación traslacional
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16
Conceptos claves
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Conceptos claves
• Dos mundos tan dispares, como la ciencia
y el mercado, necesitan un intérprete que
les acerque y les haga entenderse con el
fin de hacer nacer nuevos negocios.
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Conceptos claves
• Dos mundos tan dispares, como la ciencia
y el mercado, necesitan un intérprete que
les acerque y les haga entenderse con el
fin de hacer nacer nuevos negocios.
• Desarrollar negocios en este sector es una
labor típicamente emprendedora.
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19
Conceptos claves
• Dos mundos tan dispares, como la ciencia
y el mercado, necesitan un intérprete que
les acerque y les haga entenderse con el
fin de hacer nacer nuevos negocios.
• Desarrollar negocios en este sector es una
labor típicamente emprendedora.
• La innovación biotecnológica nos lleva a la
globalización, empresas globales en sectores
globales
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20
09/06/2009
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21
Heréditum: Probióticos obtenidos de leche materna
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1.
2.
3.
4.
5.
6.
Antecedentes
Hipótesis y objetivos
Estudios
Descubrimiento de lactobacillus y bifidobacterias en leche materna
Mecanismo de transferencia propuesto
Selección de las cepas Hereditum®:
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus gasseri
Lactobacillus salivarius
7.
8.
9.
Patentes
Seguridad de las cepas. Estatus QPS de la EFSA
Aplicaciones:
1. Lácteos fermentados
2. Nutrición Infantil
3. IBD
*
22
HEREDITUM ®:
PROBIÓTICOS OBTENIDOS DE
LECHE MATERNA
• Tradicionalmente, la leche materna se ha considerado como un fluído
libre de bacterias, estéril.
•Hace unas décadas se describieron algunas bacterias en la leche
materna que se asociaron con “potenciales contaminaciones” (ElMohandes et al. 1993; Wright & Feeney 1998 “Identification of potential
contaminant bacteria in stored milk”)
•Se conoce que la leche materna protege al neonato de infecciones.
Las propiedades antiinfectivas de LM se pierden después de la
pasteurización
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23
Hereditum: Antecedentes
1.
Se pensaba que el feto es estéril y el inicio de la presencia de
bacterias en el recién nacido provenía del canal vaginal
2.
Pero también existe presencia de bacterias en los recién nacidos por
cesárea. La flora de bebés nacidos por parto natural vs cesárea es
muy parecida, lo que descarta la colonización exclusiva a partir de la
flora del canal vaginal.
3.
En PB encontramos la presencia de bacterias en el meconio (Jiménez et
al., 2008) y en cordón umbilical (Jiménez et al., 2005) de recién nacidos
Demostramos la transferencia de bacterias
al feto durante el embarazo a través de la placenta/cordón umbilical.
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Hereditum: LA HIPÓTESIS
¿Existen bacterias ácido lácticas
(lactobacillus/bifidobacterias) en la leche materna?
¿existe transferencia de bacterias al
recién nacido a partir de leche
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materna?
25
HEREDITUM: Estudios
Aislamos muestras de leche materna a partir de
8 madres lactantes sanas
Se investigó la flora bacteriana usando
medios de cultivos genéricos y específicos
Se encontraron varias especies,
incluyendo Lactobacillus y Bifidobacterias
¿Una contaminación de la flora de la epidermis?
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Ensayo con madres y bebés
Se seleccionaron 8 madres sanas con sus bebés recién nacidos
se tomaron muestras:
Madres (1-8)
•Leche materna
•Aureola mamaria
•Mucosa vaginal
•Heces
•Epidermis
Bebés (1-8)
•Meconio (primeras heces)
•Heces bebé
•Mucosa bucal
• MRS
Se investigó la flora bacteriana en las muestras
usando medios de cultivos genéricos y específicos
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Se aislaron 300 cepas
de cada par madre-bebé
x8
*
Total: 2,400 cepas
• KAA
• VRBA
• Nutrient Agar
Martin et al., 2003
27
Caracterización de las especies
Las especies de Lactobacillus
Y bifidobacterias de Leche Materna = Heces del bebé (HB)
= Aureola mamaria (AM)
= Mucosa oral del bebé LAB (MO)
identificación
genética
LM
AM
HB MO
LM
AM
HB MO
600 bp
600 bp
Madre 1- Bebé 1
Madre 2- Bebé 2
Conclusión:
Las bacterias ácido lácticas existentes en la leche materna también se
identificaron en las mucosas del bebé
•la flora oral del bebé
•las heces del bebé
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*
28
Martin et al., 2003;
09/06/2009
*
J Pediatr 2003; 143: 754-8 29
Después, otros grupos han descrito la presencia de bacterias
ácido lácticas en leche materna
Heikkilä & Saris (2003)
J. Appl. Microbiol., 95: 471.
105-107 cfu/800 ml
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30
HEREDITUM: Mecanismo de transporte propuesto
Lumen intestinal
Enterocitos
Mucus
Bacteria
M cell
Células
dendriticas
Migration
Células
dendriticas
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Martin et al., 2004
Xaus et al., 2004a;
Xaus et al 2004b; 31
Xaus et al., 2005
Puntos a recordar:
-La leche materna contiene lactobacillus y bifidobacterias (BAL)
-Existe una transferencia desde estas bacterias desde la leche materna
al bebé durante la lactancia
-Hemos aislado un número de éstas bacterias ácido lácticas
¿Cuáles de ésas cepas tienen
potencial probiótico?
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32
Microbiota Intestinal: Modulación
Probióticos: “microorganismos vivos que cuando son ingeridos ejercen un
efecto beneficioso en la salud”
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*
33
Selección de cepas probióticas
Existen diferentes cepas bacterianas en la leche materna
con potencial probiótico
¿cómo seleccionar las mejores?
?
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34
Selección de cepas probióticas
•Sistema de screening de PB con unos 40 ensayos in vitro
Supervivencia tras digestión
COLONIZACIÓN
Y
Adhesión
ASPECTOS FUNCIONALES
Propiedades
antimicrobianas
Propiedades inmunoreguladoras
Identificación de cepas
ASPECTOS
DE
Ausencia
de infectividad
SEGURIDAD
Resistencia
a antibióticos
Origen humano
Propiedades organolépticas
Características de fermentación
ASPECTOS TECNOLÓGICOS
Estabilidad
Vida media
•Sistema de puntuación de capacidades probióticas
vs otras Comerciales
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Martin et al 2005;
Martin et al 2006
35
Ejemplo de parámetros de funcionalidad
- Production of bacteriocins
- Production of H2O2
- Competition studies
- Infectivity (Caco2 monolayers)
- Intestinal Translocation (Ussing)
- Macrophage stimulation
- Dendritic cell stimulation
- Lymphocyte stimulation
- Phagocytic activity
- Antibiotic resistance and metabolism
- D- and L-lactate production
- Bile salt deconjugation
- Exo-polysaccharide production
- Production of SCFA
- Production of beneficial fatty acids
- Production of vitamins
- Production of glutathione
- etc…
30
25
20
15
5717 5711 5712 5713 5714 5715 5716 LGG LA1 Lcasei
Alim. Fermentados
Leche materna
Cepas comerciales
Se seleccionaron 3 cepas con excelentes capacidades probióticas
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HEREDITUM ®
UNA NUEVA GENERACIÓN
De Bacterias probióticas
aisladas de leche materna
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus gasseri
Lactobacillus salivarius
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37
Referencias:
•1. aislamiento cepas leche materna
•Jimenez E, Fernandez L, Marin ML, Martin R, Odriozola JM, Nueno-Palop C, Narbad A, Olivares M, Xaus J, Rodríguez JM.
2005. Isolation of Commensal Bacteria from Umbilical Cord Blood of Healthy Neonates Born by Cesarean Section Curr.
Microbiol. 51: 270-274
•Jiménez E et al., 2008 Is meconium from healthy newborns actually sterile? Research in Microbiology 159; 187-193
• Martin R, Langa S, Reviriego C, Jimenez E, Marin ML, Xaus J, Fernandez L, Rodriguez JM. 2003. Human milk is a source of
lactic acid bacteria for the infant gut. J. Pedriatr. 143: 754-758.
• Martin R, Heiling HGHJ, Zoetendal EG, Jimenez E, Fernandez L, Smidt H, Rodriguez JM. 2007a. Cultivation-independent
assessment of the bacterial diversity of breast milk among healthy women. Res Microbiol. 2007 Jan-Feb;158(1):31-7.
• Martin R, Heiling HGHJ, Zoetendal EG, Smidt H, Rodriguez JM. 2007b. Diversity of the Lactobacillus group in breast milk
and vagina of healthy women and potential role in the colonization of the infant gut. Journal of Applied Microbiology, 103:
2638-2644
•2. transferencia.
• Martin R, Langa S, Reviriego C, Jimenez E, Marin ML, Olivares M, Boza J, Jimenez J, Fernandez L, Xaus J, Rodriguez JM.
2004. Trends Food Sci Tech. 15: 121-127
• Xaus J, Olivares M, Rodriguez JM. 2004 a. Probiotics: Infant nutrition as target. Nutrafoods 3: 13-21.
• Xaus J, Martin R, Olivares M, Díaz-Ropero MP, Langa S, Rodriguez JM. 2004b. AgroFood Sep-Oct: 27-29
• Xaus J., Olivares M, Rodriguez JM, 2005. Neonatal microbiota: New posibilities after one century, new oportunities for
the 21st century. Ing. Health Nutr. Nov: 12-15
3. Selección de cepas de leche materna con potencial probiótico
Martin R, Olivares M, Marin ML, Fernandez L, Xaus J, Rodriguez JM. 2005. Probiotic potential of 3 lactobacilli strains
isolated from breast milk. J. Hum. Lact. 21: 8-17
Martin R, Jimenez E, Olivares M, Marín ML, Fernandez L, Xaus J, Rodriguez JM. Lactobacillus salivarius CECT5713, a
potential probiotic strain isolated from infant feces and brest milk of a mother-child pair. International Journal of Food
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38
Microbiology 112 (2006) 35–43
CEPAS HEREDITUM PATENTADAS: nº WO 2004/003235
Comercialization
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Seguridad de las cepas
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus gasseri
poseen estatus QPS de la
EFSA
Lactobacillus salivarius
QPS: Qualified Presumption of Safety
- El estatus QPS de la EFSA se otorga a especies de microorganismos
para las que existe una amplia historia de uso seguro en alimentación y
cuyo consumo no representa ningúun riesgo para la salud, basado en la
identidad de la especie, el conocimiento científico de la misma, los datos
de patogenicidad y los usos finales.
- Según la EFSA, las cepas de microorganismos con estatus QPS no
necesitan estudios adicionales de evaluación de seguridad.
Lactobacillus fermentum posee estatus QPS de la EFSA y por lo tanto
puede considerarse como una cepa con todas las garantías de seguridad.
Ref: Documento opinión de la EFSA: The EFSA Journal (2007) 587, 1-16 con tabla completa de especies con
estatus
QPS
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Lactobacillus fermentum
Lactobacillus gasseri
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Lactobacillus salivarius
Son cepas QPS
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HEREDITUM®
Aplicaciones
Suplementos
Nutición Infantil
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Lácteos
fermentados
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Afecciones
Intestinales
(E.I.I.)
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HEREDITUM®
Probióticos de leche materna
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Conservation Optimization
Pellet frozen
80-100% survival after 6 months at -20ºC
(2-6x1010cfu/g)
Lyophilized
Industrial Plant:
15.000-20.000 Kg frozen
product/year
09/06/2009
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80-100% survival after 12 months at -50ºC
(0.5-4x1011cfu/g)
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