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Índice de Trabajos en Extenso
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Del 4 al 7 de abril del 2006 en la ciudad de Morelia Mich. México. ENSILADO DE MAÍZ USANDO BACTERIAS PRODUCTORAS DE ÁCIDO
LÁCTICO AISLADAS DE LA PROPIA PLANTA
Bautista Trujillo Gerardo Uriel, Cobos M. A, Cristina Ventura Canseco, Ayora Talavera
Teresa, Oliva LLaven María Ángela, Gutiérrez Miceli Federico. Instituto Tecnológico de
Tuxtla Gutiérrez, Carr. Panam Km 1080. Tuxtla Gutiérrez, Chiapas CP 29000, México.
[email protected]
Palabras clave: maíz, ensilado, bacterias lácticas
Introducción.
El ensilado es un método que se utiliza para la preservación de forrajes que contienen
25 a 35 % de materia seca (MS), en este proceso se lleva acabo una fermentación de
azúcares solubles por enzimas y bacterias productoras de ácido láctico (BAL) en
condiciones de anaerobiosis. Los inoculantes bacterianos para ensilados (BAL) son
productos biológicos a base de bacterias que tienen la capacidad de producir ácido
láctico y disminuir el pH de los silos. Los principales géneros bacterianos utilizados
como inoculantes en silos son: Lactobacillus, Pediococcus, Lactococcus, Enterococcus,
Leuconostoc y Streptococcus; los cuales crecen en rangos de pH de 3 a 4 (Holfzapfel y
Schillenger, 1992; Hames y col. 1992).
El uso de inoculantes bacterianos para ensilados es una práctica común en Europa y
Norte América, debido a que se han demostrado ventajas importantes sobre cualquier
otro mejorador del proceso de ensilaje. También existen datos sobre beneficios
económicos derivados del uso de inoculantes bacterianos aplicados a ensilajes de
maíz, señalando incrementos de 70 a 110 pesos por tonelada de maíz ensilado como
producto del mejoramiento en la preservación del ensilaje utilizado en la alimentación
de ganado lechero (Bolsen y col. 2001).
Los pocos productores que han usado los inoculantes comerciales disponibles para
ensilar no han quedado totalmente convencidos debido a que el inoculante no ha sido
efectivo.
En diversos trabajos se ha demostrado que las bacterias ácido lácticas
nativas para un cultivo específico, favorecen mejores rendimientos de producción de
ácido láctico y valores menores de pH que los inoculantes comerciales (Weinberg y
Muck, 1996; Merry y col. 1997).
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Mar del Norte No. 5, Col. San Álvaro Azcapotzalco C.P. 02090, México, D. F.
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Del 4 al 7 de abril del 2006 en la ciudad de Morelia Mich. México. El propósito del presente estudio fue aislar y caracterizar bacterias ácido lácticas de
ensilados con plantas de maíz de las variedades V-534, Vs-536, V-526 y el híbrido
Maya 2002, preparar un inoculante con las bacterias aisladas, evaluar la concentración
de ácido láctico y las características nutritivas del ensilado.
Metodología.
Las plantas de maíz (Zea mayz) se colectaron manualmente a los 75 días después de
haberse sembrado, se seleccionaron los genotipos Vs-536, V-534, V-526 e Híbrido
Maya-2002. Las plantas de maíz se picaron y se homogenizaron manualmente en
cantidades referidas a base seca para obtener 1 Kg de mezcla con humedad de 60-70
%.
Para determinar los parámetros sensoriales de Olor, Color y Textura, se destaparon los
microsilos en condiciones de esterilidad. Se determinó en el forraje el parámetro de olor
a dulce o ácido láctico, poco agradable y desagradable. Para la determinación del color,
se observó el forraje ensilado y se tomaron los datos de color verde, pardo verdoso,
verde amarillento, verde rojizo, café verdoso, café oscuro, pardo amarillento. La textura
del forraje ensilado se determinó al tacto y se anotó como: bien definida, firme y con
fácil separación, o en su defecto jabonoso, mal definido, viscoso y pegajoso.
Para el aislamiento e identificación de las bacterias ácido lácticas, se tomaron 10 g de
muestra de cada microsilo y fueron colocadas en recipientes que contenían 90 mL de
agua destilada estéril. Posteriormente de cada muestra se obtuvo una alícuota de 0.1
mL y se depositó en medio de cultivo denominado DeMan-Rugosa y Sharpe (MRS,
selectivo para bacilos ácido lácticos) contenido en cajas de petri desechables (DeMan y
col. 1960, citado por Burgos y col. 2000), la misma cantidad de alícuota se utilizó en
agar para estafilococos 110 y en agar sangre. Las cajas de petri fueron incubadas
durante 48 horas a 30°C bajo una atmósfera anaerobia mediante una jarra GASPAK de
36 placas. Después de tres subcultivos en medio MRS, los diferentes monotipos fueron
inoculados en tubos de cepa contenido de medio MRS y se procedió a identificar las
colonias por medio de las pruebas de Gram., catalasa y una galería de pruebas Api 50
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Del 4 al 7 de abril del 2006 en la ciudad de Morelia Mich. México. CHL (BioMérieux), Api Estrep (BioMérieux) y Api Staph (BioMérieux. 2000 en Tobia y
col. 2003). Las reacciones observadas del metabolismo bacteriano en pruebas
bioquímicas fueron interpretadas como positivas o negativas dependiendo de la
identificación numérica del perfil observado en cada una, los datos fueron obtenidos en
base al cálculo de su proximidad relativa a los distintos taxones de la base de datos
(Porcentaje de identidad, % Id) a través de un programa computarizado APILAB PLUS
versión 3.3.3 (BioMérieux, 2000).
Por último, se utilizaron cepas de referencia ATCC de Lactobacillus plantarum y
Pediococcus acidilactici para la comparación morfológica de las bacterias aisladas
(ATCC, 2005).
Las muestras de material vegetal pre-ensilados y post-ensilados se analizaron para:
Materia Seca (MS), Materia Orgánica (MO), Proteína (PT), Cenizas (C) y pH de acuerdo
a las técnicas descritas por la AOAC (1990). La fibra detergente neutro (FDN) se
analizó de acuerdo a la técnica descrita por Goering y Van-Soest (1970). La
concentración de ácido láctico se analizó de acuerdo a la técnica calorimétrica descrita
por Baker y Sumerson (1941). Se midió la concentración de ácido butírico, ácido acético
y ácido propiónico mediante cromatografía de gases en un cromatógrafo de gases
Perkin Elmer, Clarus 500.
Todos los datos se analizaron mediante el modelo estadístico de análisis de varianza :
las medias de las variables con diferencias significativas (P < 0.05) entre los
tratamientos se compararon mediante la prueba de Tukey.
Resultados y Discusión.
En todos los genotipos de maíz se encontró que las BAL presentes en el ensilado
correspondieron
pentosaceus,
a
Lactobacillus
Enterococcus
plantarum,
durans,
Lactobacillus
Lactobacillus
brevis,
paracasei
y
Pediococcus
Leuconostoc
mesenteroides. La concentración de las bacterias fue diferente, en los genotipos V-526
y Vs-536 se encontró mayor concentración de las BAL homofermentivas. La utilización
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Del 4 al 7 de abril del 2006 en la ciudad de Morelia Mich. México. del inoculo nativo en los ensilados favoreció la disminución de pH y el incremento de la
concentración de ácido láctico, (Cuadro 1). También permitió la estabilización de las
propiedades nutricionales del forraje y la disminución de AGV. Se incrementó la
predominancia de bacterias productoras de ácido (D-) láctico en los ensilados tratados
con inoculantes nativos. A comparar las propiedades nutricionales del ensilado con
inoculación (I) y sin inoculación (T) con las bacterias aisladas, hubo diferencia
significativa (p<0.05) en pH, ácido láctico (AL, g Kg-1 de MS), materia seca (MS, %) y
ácidos grasos volátiles (AGV, g Kg-1 de MS) pero no hubo diferencias en proteína (P, %
de MS), fibra detergente neutro (FDN, % MS), cenizas (C, % de MS), materia orgánica
(MO, % MS) y carbohidratos solubles (CS, % MS) (Cuadro 2).
Cuadro 1. Comparación de los valores de ácido láctico (g Kg-1 de MS).
TIPO DE
TIEMPO DE FERMENTACIÓN (DIAS)
MUESTRA
3
7
15
21
Vs-536
30.4 a
46.4 a
54.0 a
52.6 a
H-Maya
14.0 c
34.3 a
40.6 a
40.7 a
V-526
25.5 b
38.7 a
55.3 a
53.8 a
V-534
22.5 b
38.2 a
45.6 a
49.3 a
Cuadro 2. Comparación de los valores nutritivos del ensilado del genotipo Vs-536 con y sin
inoculante nativo.
pH
Al
P
Fdn
C
MS
MO
CS
Agv
T
3.8 a
49 b
13 a
12.7 a
11 a
32 a
34 a
16 a
13 a
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3.4 b
62 a
14 a
13.5 a
12 a
31 b
35 a
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9b
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Del 4 al 7 de abril del 2006 en la ciudad de Morelia Mich. México. Conclusiones.
Se aislaron y caracterizaron las bacterias ácido lácticas homofermentativas:
Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis y Pediococcus pentosaceus. También se
aislaron las siguientes bacterias ácido lácticas heterofermentativas: Enterococcus
durans, Lactobacillus paracasei y Leuconostoc mesenteroides. Todas las bacterias
anteriormente mencionadas se encontraron en los silos independientemente del
fenotipo utilizado y los géneros Enterococcus durans, Pediococcus pentosaceus y
Lactobacillus brevis se aislaron por arriba de 109 UFC g-1 de silo.
Los microorganismos crecieron favorablemente bajo una atmósfera de CO2 en medios
de cultivo selectivos como agar MRS, Estafilococcus 110 y agar Sangre.
Los resultados de este estudio indicaron que los ensilados presentaron un olor dulce
agradable, un color verde pardo y una textura bien definida de fácil separación. El pH
de los ensilados fue de entre 3.4 a 3.9 y la concentración de ácido láctico se
incrementó. Las características nutricionales se mantuvieron constantes tales como
proteína, fibra detergente neutro, ceniza, materia seca, materia orgánica y
carbohidratos solubles. La concentración de ácido acético fue menor a 13.24 g Kg-1 de
MS y la concentración de ácido butírico y propiónico fue de cero, lo que indicó que se
obtuvo un ensilado de buena calidad.
Las variedades V-526 y Vs-536 favorecieron las mejores concentraciones de bacterias
ácido lácticas homofermentativas además de contener el mayor porcentaje de azúcares
solubles. La variedad Vs-536 presentó el más alto porcentaje de proteína entre los
fenotipos probados.
La utilización del inóculo nativo en los ensilados favoreció la disminución de pH y el
incremento de la concentración de ácido láctico, también favoreció la estabilidad de las
propiedades nutricionales del forraje como por ejemplo proteína, fibra detergente
neutro, ceniza, materia seca, materia orgánica y carbohidratos.
La concentración de ácido acético disminuyó con la utilización del inoculante bacteriano
nativo.
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Del 4 al 7 de abril del 2006 en la ciudad de Morelia Mich. México. Se favoreció la presencia de bacterias homofermentadoras productoras de ácido D (-)
láctico y se disminuyó la población de bacterias ácido lácticas heterofermentativas
productoras de ácido L (+) láctico en los ensilados tratados con inoculantes nativos.
Agradecimiento.
Este proyecto fue financiado por la Fundación Produce Chiapas, AC.
Bibliografía.
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COLEGIO MEXICANO DE INGENIEROS BIOQUÍMICOS, A. C.
Mar del Norte No. 5, Col. San Álvaro Azcapotzalco C.P. 02090, México, D. F.
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Índice de Trabajos en Extenso
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Del 4 al 7 de abril del 2006 en la ciudad de Morelia Mich. México. Holzapfel, W.H., U. Schillinger. 1992. The Genus Leuconostoc. p. 1508-1534. in: Balows et al.,1992.
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