Download ANÁLISIS DEL GEN HLY PARA LA DETECCIÓN RÁPIDA DE

XX Congreso Nacional de Ingeniería Bioquímica
IX Congreso Internacional de Ingeniería Bioquímica
XIV Jornadas Científicas de Biomedicina y Biotecnología
Molecular
Veracruz, México 16-18, Marzo 2016
Clave:BMS274ROD20160119.
ANÁLISISDELGENHLYPARALADETECCIÓNRÁPIDADELISTERIA
MONOCYTOGENES
ContrerasMarínLuisIván,RuilobadeLeónSandra,GonzálezLugo
Graciela,EspinozaMelladoMa.delRosarioyRodasSuárezOscarR.
DIRECCIÓNDELOSAUTORES
DepartamentodeMicrobiología.EscuelaNacionaldeCienciasBiológicas,IPN.Prolde
CapioyPlandeAyalas/n.Col.CascodeSto.TomásMéxicoD.F.,CP11340
CORREOELECTRÓNICO
[email protected]
INTRODUCCIÓN
ambiental, que normalmente sirve para
Listeriaesunabacteriaqueseencuentra
limitar el crecimiento de bacterias, tales
en el ambiente como microorganismo
como
saprófito, pero es capaz de hacer una
fluctuaciones
transición a patógeno inmediatamente
temperatura(Freitagetal,2009).
después de su ingestión por humanos o
Una serie de factores de virulencia son
animales susceptibles (Freitag et al,
producidos por L. monocytogenes para
2009).
facilitar el proceso invasivo (Portnoy et
Listeriamonocytogeneseslaespecietipo
al, 1992; Freitag et al, 2009). Seis de los
de entre las ocho especies que
factoresdevirulenciaresponsablesdela
conformanelgéneroListeria.Lasotras
invasión celular de L. monocytogenes
especies son L. ivanovii, L. innocua, L.
(prfA, plcA, hly, mpl, acta y plcB) están
seeligeri, L. welshimeri y L. grayi. Las
organizadosenunaisladepatogenicidad
especies del género Listeria están
de9Kbconocidacomogrupodegenesde
ampliamentedistribuidasenelambiente.
virulencia
Han sido aisladas a partir de suelo,
denominada como isla de patogenicidad
materia vegetal en descomposición,
1 de Listeria (LIPI-1)(Fig.1)(Vázquez-
forraje, aguas negras, agua potable,
Bolandetal,2001).
iones
metálicos,
en
PrfA
el
pH
sal,
y
las
baja
dependiente,
isla
ensilados, aves de corral, carne fresca y
procesada,
rastros
y
portadores
asintomáticos animales y humanos
(Fenlon, 1999). Se le ha dado particular
atención
a
la
capacidad
de
L.
Figura 1. Organización transcripcional y física
del grupo de genes de virulencia LIPI-1 de
Listeriamonocytogenes.Encolorrojoseaprecia
monocytogenes para sobrevivir en las
el monocistrón hly; en verde el operón
plantas de procesamiento de alimentos,
Lecitinasa y en azul el operon prfA-plcA.
en las que puede soportar el estrés
ModificadodeVázquez-Bolandetal(2001).
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Tabla1.Coleccióndecepasempleadasenel
presenteestudio
OBJETIVOS
AmplificarelgenhlyencepasdeListeria
monocytogenes
Estandarizarlascondicionesde
amplificacióndelgenhly
Validarlabúsquedaelgenhlycomo
métododeidentificacióndeListeria
monocytogenes
MATERIALESYMÉTODOS
Seestudiaronuntotalde59cepasdeL.
monocytogenes, entre las cuales se
incluyen
aislamientos
clínicos,
Origen
Procedencia
Hortalizas
Aguade
riego
Lácteos
Cárnicos
Jugode
naranja
Verduras
congeladas
Casos
clínicos
Casoclínico
Cepade
referencia
Sonora
Sonora
Númerode
cepas
10
1
DF
DF
DF
8
4
11
DF
7
Aguascalientes
14
DF
ATCC
1
2
de
alimentos y agua de riego (Tabla 1).
ObtencióndeDNAcromosómico.
También se incluyeron en el estudio dos
Extracción de DNA cromosómico por
testigos:L.monocytogenesATCC19114y
medio del Kit PROMEGA. (Schagat et al,
19115asicomocepasdeenerobacterias,
2013):
cocos Gram positivos, L. innocua y L.
Iniciadoresparaelgenehly.
seligeri. Las 57 cepas se sembraron en
Los iniciadores probados para la
agar Oxford (Difco) para comprobar su
amplificación del gen hly de L.
pureza y morfología microscópica. A las
monocytogenes
colonias de dudoso aspecto se les
continuación:
realizaronlaspruebasdeRojodeMetilo
ForwardTGCAAGTCCTAAGACGCCA
– Vogues Proskauer, hidrólisis de la
Reverse
esculinaycatalasa.
CACTGCCATCTCCCGTGGTATACTAA
y
se
enlistan
a
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Reacción en cadena de la polimerasa
las PCR’s se muestran a continuación
(PCR)
(Tabla 6)
Paraelgenhlyseasignaronlassiguientes
condicionesyseenlistanacontinuación
(Tabla5):
Tabla5.CondicionesdelaPCRparalaamplificación
delgenhlydelaisladepatogenicidadLIPI–1.
Etapa
Desnaturalización
inicial
Temperatura/
tiempo
94°C
/5min
Desnaturalización
94°C/1min
Alineamiento
61.5°C/1min
Extensión
72°C/1min
Extensiónfinal
72°C/5min
Ciclos
1
40
Figura 10. Amplificación del gen hly (117 pb).
Carril 1, L. monocytogenes ATCC 19114; carril
2 – 4, cepas: L. monocytogenes aislada de
caso clínicos.; carril 5 L seeligeri (control
negativo)
L.monocytogenes
No.De
cepas
59
Presenciadel
genhly
Positivo
RESULTADOS
Listeriainnocua
1
Negativo
Se observó que el método ensayado
Listeriaseligeri
1
Negativo
Wizard Genomic DNA Purification Kit
Escherichiacoli
1
Negativo
(PROMEGA TM050), ofreció un buen
Salmonellatyphi
1
Negativo
Pseudomonas
aeruginosa
2
Negativo
Sthaphylococcus
aureus
Streptococcus
pneumoniae
Streptococcus
agalactae
BacillussubtilisATCC
6633
1
Negativo
1
Negativo
1
Negativo
1
Negativo
1
rendimiento y pureza.
Se evaluaron un total de 59 cepas de
L.
monocytogenes
aisladas
de
diferentes orígenes y dos cepas de
referencia
(L.
monocytogenes
ATCC19114 y 19115) como control
positivo
y
diversas
cepas
como
Cepa
control negativo. Los resultados de
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DISCUSIÓN
dentrodelacélulaeucariota,talescomo
Enel100porcientodelascepasselogró
la Listeriolisina S (Shen et al. 2013),
amplificar el gen que codifica para una
resistencia a antibióticos, internalinas,
hemolisina
factores antioxidantes (Campbell. 1993;
formadora
de
poros
dependiente de colesterol (Schnupf y
Croizeetal.1993).
Portnoy,2007),cuyafunciónesfavorecer
La detección de L. monocytogenes a
el proceso de la ruptura del fagosoma
opartir de muestras de alimentos o
primario,conlaayudadePlcAyPlcB.
clínicas es difícil debido a que la biota
La Listeriosis en la actualidad puede ser
acompañante puede enmascarar el
el resultado de complejas interacciones
desarrollo del micoorganismo lo cual
entre diversos factores que son refrejo
puededarresultadosfalsosnegativos.En
de los cambios sufridos en el estilo de
el presente estudio se desarrolló una
vida de los países en transición, como
técnica cualitativa de PCR punto final,
México. A raíz de que cada día aumenta
teniendo una reproducibilida del 100%
elconsumodealimentoscongeladosy/o
en
procesadosenMéxicoyqueloscasosde
fenotípicamente
Listeriosis en México han aumentado
togenes,
sustancialmente, aún no existe un
inespecíficas con las otras cepas del
registro de la incidencia, prevalencia y
género Listeria estudiadas del mismo
morbi-mortandadparaestaenfermedad.
modonoseamplificóconotrasbacterias
Debido a esto, las cepas clínicas son un
Gram positivas que filogenéticamente
caso particular, ya que todas fueron
están
aisladaspostmotemenneonatos.Laisla
concuerda con lo publicado por Barbau-
de patogenicidad LIPI-1 es un factor
Piednoir et al 2012. Este médodo de
importanteparaListeriaperonoelúnico
detección puede ser una herramienta
que puede favorecer la multiplicación
alternativa en la detección rápida de L.
las
sin
cepas
como
tener
relacionadas,
identificadas
L.
monocy-
amplificaciones
este
estudio
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monocytogenes de casos clínicos así
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Schagat,T.,Wieczorek,D.,Helt,C.,Smith,
CONCLUSIONES
Seampificóelgenhlyexclusvamenteen
cepasdeL.monocytogenes.
Seobtuvounamplicónde117pb
Larepoducibilidaddelmétdofuedel
100%
D.,White,D.yVincent,E.(2013).Comparing
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