Download Ramírez Ulloa, Carolina Maribel

UNIVERSIDAD TÉCNICA PARTICULAR DE LOJA
La Universidad Católica de Loja
ÁREA BIOLÓGICA Y BIOMÉDICA
TÍTULO DE BIOQUÍMICO FARMACÉUTICO
Caracterización morfo-molecular de hongos anamorfos del cepario UTPL y
evaluación de su potencial antibacteriano.
TRABAJO DE TITULACIÓN
AUTORA: Ramírez Ulloa, Carolina Maribel
DIRECTOR: Cruz Sarmiento, Darío Javier, Ph. D.
LOJA – ECUADOR
2016
Esta versión digital, ha sido acreditada bajo la licencia Creative Commons 4.0, CC BY-NYSA: Reconocimiento-No comercial-Compartir igual; la cual permite copiar, distribuir y
comunicar públicamente la obra, mientras se reconozca la autoría original, no se utilice con
fines comerciales y se permiten obras derivadas, siempre que mantenga la misma licencia al
ser divulgada. http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/deed.es
2016
APROBACIÓN DEL DIRECTOR DEL TRABAJO DE TITULACIÓN
Ph.D. Darío Javier Cruz Sarmiento.
DOCENTE DE LA TITULACIÓN
De mi consideración:
El presente trabajo de titulación, “Caracterización morfo-molecular de hongos anamorfos del
cepario UTPL y evaluación de su potencial antibacteriano” realizado por Ramírez Ulloa Carolina
Maribel, ha sido orientado y revisado durante su ejecución, por cuanto se aprueba la presentación
del mismo.
Loja, septiembre de 2016
f) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
ii
DECLARACIÓN DE AUTORÍA Y CESIÓN DE DERECHOS
Yo, Ramírez Ulloa Carolina Maribel: declaro ser autor del presente trabajo de titulación:
Caracterización morfo-molecular de hongos anamorfos del cepario UTPL y evaluación de su
potencial antibacteriano, de la Titulación de Bioquímica y Farmacia, siendo Darío Javier Cruz
Sarmiento director del presente trabajo; y eximo expresamente a la Universidad Técnica
Particular de Loja y a sus representantes legales de posibles reclamos o acciones legales.
Además certifico que las ideas, conceptos, procedimientos y resultados vertidos en el presente
trabajo investigativo, son de mi exclusiva responsabilidad.
Adicionalmente declaro conocer y aceptar la disposición del Art. 88 del Estatuto Orgánico de la
Universidad Técnica Particular de Loja que en su parte pertinente textualmente dice: “Forman
parte del patrimonio de la Universidad la propiedad intelectual de investigaciones, trabajos
científicos o técnicos y tesis de grado o trabajos de titulación que se realicen con el apoyo
financiero, académico o institucional (operativo) de la Universidad”
f. …………………………………….
Autor: Ramírez Ulloa Carolina Maribel
Cédula: 110431619-3
iii
DEDICATORIA
A Dios, él que nunca me falla.
A mi padre, Wuilman, ejemplo de perseverancia y sacrificio.
A mi madre, Rosa, su coraje y amor, me da la fuerza que necesito.
A mi hermana, Mariuxi, la alegría de mi vida.
A mis sobrinas, Evelyn y Mireya por ser mi inocencia y ternura.
Carolina Maribel
iv
AGRADECIMIENTO
A Dios, por regalarme vida y bendecirme día a día.
A mis padres, Wuilman y Rosa, por su amor y apoyo incondicional, la vida no me
alcanzara para agradecerles lo que han hecho por mí. Este logro también es suyo.
A mi hermana, Mariuxi, por sus consejos y motivación, has sido mi inspiración.
A mis compañeros del Fungario, en especial a Sebastián Eguiguren, por su apoyo y
amistad.
Agradezco de manera especial al Ph. D. Darío Cruz y M.Sc. Luis Cartuche por guiarme
en cada paso de esta investigación y brindarme su apoyo.
A la Universidad Técnica Particular de Loja, a sus docentes quienes me orientaron en
mi formación profesional.
¡GRACIAS!
Carolina Maribel Ramírez Ulloa
v
ÍNDICE DE CONTENIDOS
DEDICATORIA ........................................................................................................................... iv
AGRADECIMIENTO ....................................................................................................................v
ÍNDICE DE CONTENIDOS ......................................................................................................... vi
ÍNDICE DE TABLAS ................................................................................................................. viii
ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................................. ix
RESUMEN .................................................................................................................................. 1
ABSTRACT ................................................................................................................................ 2
INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 3
CAPÍTULO I ................................................................................................................................ 4
MARCO TEÓRICO ..................................................................................................................... 4
1.1.
Reino Fungi .................................................................................................................. 5
1.2.
Características generales de los hongos ...................................................................... 5
1.3.
Diversidad en el mundo y distribución en el Ecuador. ................................................... 5
1.4.
Importancia de los hongos ............................................................................................ 6
1.5.
Clasificación morfológica y molecular de los hongos .................................................... 6
1.6.
Ciclo de vida y reproducción de los hongos .................................................................. 7
1.7.
Metabolismo de los hongos .......................................................................................... 7
1.8.
Actividad antibacteriana ................................................................................................ 8
1.8.1
Concentración mínima inhibitoria..........................................................................................8
CAPÍTULO II ............................................................................................................................... 9
MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................................................... 9
2.1.
Especímenes o cepas ................................................................................................ 10
2.2.
Identificación morfológica ........................................................................................... 10
2.3.
Identificación molecular .............................................................................................. 11
2.4.
Comparación en BLAST ............................................................................................. 11
2.5.
Pruebas antagónicas bacterianas en medio sólido ..................................................... 11
2.6.
Obtención de extractos fúngicos ................................................................................. 14
2.7.
Concentración mínima inhibitoria ................................................................................ 14
CAPÍTULO III ............................................................................................................................ 16
RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................................. 16
vi
3.1.
Morfología .................................................................................................................. 17
3.2.
Comparación de similitud genética ............................................................................. 20
3.3.
Pruebas antagónicas en medio sólido ........................................................................ 24
3.4.
Extractos y rendimiento de extractos positivos ........................................................... 27
3.5.
CMI según los extractos para diferentes bacterias...................................................... 28
CONCLUSIONES ..................................................................................................................... 30
BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................................................... 31
ANEXOS................................................................................................................................... 38
ANEXO 1. Fotografías de las cepas estudiadas .................................................................... 39
ANEXO 2. Secuencias ITS-5.8S, obtenidas para las diferentes cepas estudiadas. ............... 40
ANEXO 3. Fórmulas para preparación del medio líquido YNPD usado en el estudio ............ 45
vii
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Cepas de hongos incluidas en este estudio. ............................................................... 10
Tabla 2. Bacterias patógenas de interés clínico y sus respectivos medios de cultivo específicos
utilizados en el estudio.............................................................................................................. 13
Tabla 3. Comparación y búsqueda de BLAST para las secuencias ITS-5.8S obtenidas desde los
cultivos en el presente estudio. ................................................................................................. 20
Tabla 4. Resultados de pruebas antagónicas mostrando el diámetro de halo de inhibición. ..... 24
Tabla 5. Diferencia de coloración según medio cultivo sólido (PDA) o medio líquido YNPD. Para
los diferentes extractos positivos. ............................................................................................. 28
Tabla 6: Pesos de la biomasa de los extractos y su correspondencia con el rendimiento. ........ 28
Tabla 7. CMI de los diferentes extractos frente a las diferentes bacterias de interés clínico. .... 28
viii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Esquema secuencial de Pruebas Antagónicas ......................................................... 13
Figura 2: Cepa de Clonostachys sp. ......................................................................................... 18
Figura 3: Cepa de Pycnoporus sanguineus ............................................................................. 19
Figura 4: Cepa de Pyrenochaetopsis microspora...................................................................... 20
Figura 5: Antagonismo positivo con halos de inhibición generados por Chonostachys sp. y
Pyrenochaetopsis microspora. .................................................................................................. 26
Figura 6: Antagonismo positivo con halos de inhibición generados por Pycnoporus sanguineus
................................................................................................................................................. 27
ix
RESUMEN
Los metabolitos secundarios aislados desde los hongos presentan una promisoria actividad
antibacteriana que podría solucionar problemas de interés clínico. No obstante, muy pocos
estudios de búsqueda o caracterización de hongos se han llevado a cabo hasta la actualidad.
Este estudio pretende la caracterización morfológica (características microscópicas) y molecular
(ADN ITS-5.8S) de hongos anamorfos, así como la obtención de extractos para valorar su
capacidad de inhibir a siete bacterias patógenas de interés clínico, a través de la medición de la
Concentración Mínima Inhibitoria. Morfológica y molecularmente se obtuvieron 18 hongos que
corresponden a Basidiomycetes, Ascomycetes y Zygomycetes. En las pruebas de antagonismo,
Pycnoporus sanguineus fue activo contra Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Proteus
vulgaris y Salmonella typhimurium, mientras que Clonostachys sp. y Pyrenochaeptosis
microspora fueron activos frente a Staphylococcus aureus. Al evaluar los extractos obtenidos de
los hongos que resultaron positivos en las pruebas de antagonismo, se determinó que la
capacidad inhibitoria fue negativa a la dosis más alta probada (CMI>1000 ug/mL). Estos
resultados indican que algunos hongos presentan actividad antibacteriana a concentraciones
elevadas difíciles de usar como antibióticos de uso terapéutico.
Palabras clave: Basidiomycetes, Ascomycetes, ITS-5.8S, bacterias, antagonismo.CMI.
1
ABSTRACT
Secondary metabolites isolated from fungi, show promising antibacterial activity that could solve
problems of clinical interest. However, very few studies have focused on the search or
characterization of fungi out to date. This study attempts morphological (microscopic features) and
molecular (nrDNA ITS-5.8S) characterization of anamorphic fungi, as well as obtaining extracts to
assess their ability to inhibit seven pathogenic bacteria of clinical interest, by measuring the
Minimum inhibitory concentration. We found that our 18 fungal cultures belong to the phyla
Basidiomycota, Ascomycota, and Zygomycota. In the antagonism tests Pycnoporus sanguineus
was active against Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Proteus vulgaris and Salmonella
typhimurium, while Clonostachys sp. Pyrenochaeptosis microspore and were active against
Staphylococcus aureus. When assessing the extracts obtained from fungi found to be positive in
the antagonism tests, it was determined that the inhibitory capacity was negative to the highest
dose tested (MIC>1000 ug/mL). These results indicate that some fungi have antibacterial activity
at high concentrations which are difficult to use as antibiotics for therapeutic use.
Key words: Basidiomycota, Ascomycota, ITS-5.8S, bacterias, antagonism, MIC.
2
INTRODUCCIÓN
Los hongos fueron considerados como parte del reino vegetal, pero posteriormente fueron
clasificados por Whittaker (1969), en un quinto reino denominado “Reino Fungi” (Cepero,
Restrepo, Franco, Cárdenas, & Vargas, 2012). Actualmente se divide en seis grupos o filos:
Ascomycota,
Basidiomycota,
Chytridiomycota,
Zygomycota,
Blastocladiomycota
y
Glomeromycota, siendo los más conocidos los Ascomycetes y los Basidiomycetes (Piepenbring,
2015). Este Reino es muy diverso y su riqueza se estima en más de cinco millones de especies
a nivel mundial y hay casi 75000 especies de hongos filamentosos conocidos (Blackwell, 2011).
Según el Centro de Conservación del Medio Ambiente (2016), Ecuador se encuentra en el sexto
puesto del grupo de 17 países megadiversos del planeta. No obstante, la diversidad de hongos
en el Ecuador es poco conocida ya que se conocen aproximadamente 3776 taxones lo que
significa que es solo el 4% de los hongos de nuestro territorio (Læssøe & Petersen, 2008).
La importancia de su estudio radica en que estos organismos son muy diversos, no solamente
en morfología y ecología, sino también en los compuestos que sintetizan derivados del
metabolismo secundario, como antibióticos, enzimas y colorantes con gran valor biotecnológico
(Calvo, Wilson, Bok, & Keller, 2002; Villanueva et al., 2013). Estas sustancias activas pueden ser
de mucha utilidad para el ser humano, por lo que se investigan con fines de bioprospección
(Sánchez et al., 2013)
Por esta razón, en esta investigación se buscó la caracterización tanto morfológica y molecular
de una pequeña parte de la diversidad de hongos colectados en las provincias de Loja y Zamora
Chinchipe y que se encuentran depositados en el herbario HUTPL. Así mismo evaluaremos el
potencial antibacteriano de estos hongos. Científicamente existe evidencia que el consumo
regular de hongos o de sus componentes biológicos activos se puede lograr un tratamiento
benéfico para muchas enfermedades que padece la población humana (María, López, Quintero
Díaz, & Garcés, 2011).
3
CAPÍTULO I
MARCO TEÓRICO
4
1.1. Reino Fungi
El Reino Fungi o de los Hongos inicialmente fue considerado como parte del reino vegetal, hasta
su posterior separación realizada por Whittaker (1969). Este grupo representa uno de los más
grandes acervos de biodiversidad con actividades ecológicas cruciales en todos los ecosistemas
(Herrera & Ulloa, 1990). Sistemáticamente los hongos se consideran como un grupo heterogéneo,
polifilético, formado por organismos pertenecientes por lo menos a tres líneas evolutivas
independientes (Ulloa & Hanlin 2012), pero mucho más cercanos evolutivamente al Reino animal
(Baldauf & Palmer, 1993).
Los hongos son muy diversos incluyendo mohos, levaduras y las setas (macrohongos en general)
que pueden cumplir diversos roles y se pueden subclasificar coloquialmente como saprotróficos,
liquenizados, micorrizícos y parásitos (Levetin, Horner, & Scott, 2016).
1.2. Características generales de los hongos
Los hongos son organismos tan diversos en funcionalidad, ecología y morfología, pero calzan
adecuadamente como organismos eucariontes donde pueden ser divididos como uni o
pluricelulares que se desarrollan en sitios húmedos con poca luz (Herrera & Ulloa, 1990). Dentro
del núcleo se encuentran uno o dos nucléolos pequeños y varios cromosomas (Deacon, 2006).
Son organismos no móviles, pues no poseen flagelos a excepción de las zoosporas y los
planogametos de los hongos acuáticos. También son aclorófilos y poseen una membrana nuclear
y otros organelos rodeados de membrana así como las demás características que definen a los
eucariontes (Deacon, 2006).
Dentro de la clasificación de los hongos, se incluyen dos divisiones, los hongos verdaderos
(Fungi) que incluyen los Basiodiomycota, los Ascomycota, los Glomeromycota, los Zygomycota,
los Blastocladiomycota, los Chytridiomycota y otros grupos (Hibbett et al., 2007). Estos
organismos, en su mayoría, son aerobios estrictos porque necesitan oxígeno libre para su
crecimiento (Cepero et al., 2012), son filamentosos con crecimiento apical (hifas y micelio),
heterótrofos por absorción, con reproducción asexual y sexual por medio de esporas y sus
membranas se caracterizan por la presencia de ergosterol y quitina (Piepenbring, 2015; Webster
& Weber, 2007). Por otra parte los hongos no verdaderos (pseudohongos), que son los mohos
mucilaginosos, mohos acuáticos y otros grupos muchos de ellos con pared de la célula rica en
celulosa (Webster & Weber, 2007).
1.3. Diversidad en el mundo y distribución en el Ecuador.
Recientemente se estima que a nivel mundial existen más de cinco millones de especies de
hongos, donde alrededor de 75000 especies han sido descritas hasta el momento (Blackwell,
5
2011). Esta aproximación es mucho mayor a clasificaciones anteriores como por ejemplo la
realizada por Hawksworth (2001) donde estima 1.5 millones de especies de hongos basada en
una relación de 6:1 (seis hongos por cada planta vascular). Ecuador es conocido como
megadiverso; si hacemos esta relación de 6:1 tendríamos una estimación de 96000 especies de
hongos ya que el país aproximadamente contiene unas 16500 plantas vasculares (Læssøe &
Petersen, 2008). Esta diversidad fúngica es poco conocida y según bases de datos y estudios
recientes en nuestro territorio se reportan apenas 3776 taxones conocidos, lo que significa que
es solo 4% de los hongos de nuestro país (Læssøe & Petersen, 2008).
1.4. Importancia de los hongos
Los hongos tienen gran importancia en múltiples campos como por ejemplo en la medicina, la
agricultura e inclusive como alimento (Guerra et al., 2007; Pitt & Hocking, 2009). En la medicina
uno de los mayores descubrimientos fue el antibiótico Penicilina, el cual fue obtenido desde el
hongo anamorfo Ascomycete Penicillium notatum (Curtis, Barnes, Schnek, & Massarini, 2008).
Naturalmente o en la agricultura los hongos cumplen variados roles ecológicos donde varios
estudios demuestran que aproximadamente el 80% de las plantas vasculares por medio de sus
raíces están asociadas a hongos, denominando a la asociación micorrizas, en donde hay una
colaboración mutua que permite la resistencia de las plantas a cambios bruscos del ambiente
como sequia o falta de nutrientes en el suelo, así como la resistencia frente a ataques de bacterias
o insectos (Hawksworth, 1991). Los hongos también son importantes a nivel industrial, por
ejemplo, en la creación de materiales para la construcción, industria cervecera o la denominada
mico-remediación (Ramírez, Fernandez, Rodolfi, & Solveig, 2006).
1.5. Clasificación morfológica y molecular de los hongos
La clasificación de los hongos mantiene categorías, niveles o jerarquías, las cuales agrupan a
los especímenes que comparten características muy generales y aquellos que comparten
características
muy
específicas
(visto
el
01
de
Junio
de
2016
en
http://www.inbio.ac.cr/papers/hongos/taxonomia.htm). La nomenclatura que se utiliza para
clasificar a los hongos taxonómicamente establece una serie de categorías (Haro & Melic, 2002),
de las cuales las más importantes son: reino, división, clase, familia, género y especie, contenidas
en el Código Internacional de Nomenclatura Botánica (Hibbett et al., 2007).
La clasificación de los hongos se ha basado principalmente en criterios morfológicos y en las
características de las estructuras de reproducción (Montes, Restrepo, & MacEwen, 2003). En la
actualidad se han comenzado a aplicar técnicas moleculares para crear una clasificación más
6
natural y lograr establecer, relaciones filogenéticas más precisas entre estos organismos (Iwen,
Hinrichs, & Rupp, 2002).
Para clasificar los hongos morfológicamente, se establece una clasificación básica donde se
diferencian las características de los hongos micro y macroscópicos como el tamaño de sus
fructificaciones y la morfología de sus estructuras como hifas, micelios y esporas (Avilés & Granja,
2012). Dentro del grupo de hongos microscópicos, los más conocidos son las levaduras y mohos,
algunos de ellos conocidos coloquialmente como dermatofitos. Respecto a los hongos
macroscópicos su descripción se basa principalmente en determinar los principales caracteres
externos que presenta el cuerpo fructífero o carpóforo (Pfenning & Abreu, 2000).
De acuerdo a estas características y a la revolución molecular en la taxonomía de hongos con la
amplificación por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) del ADN ribosomal nuclear con
su Espaciador Interno Transcrito (ADNrn ITS-5.8S) y la utilización de bases de datos para definir
las especies, se logró una clasificación filogenética de hongos que soporta varios grupos
morfológicos (Hibbett et al., 2007). Según esta nueva clasificación el Reino Fungi se divide en
seis
grupos
o
filos:
Ascomycota,
Basidiomycota,
Chytridiomycota,
Zygomycota,
Blastocladiomycota y Glomeromycota, siendo los más conocidos los Ascomycetes y los
Basidiomycetes (Piepenbring, 2015).
1.6. Ciclo de vida y reproducción de los hongos
Los hongos en su mayoría son haplontes, lo que significa que los núcleos haploides se multiplican
por mitosis, sin embargo también hay algunos hongos que son diplohaplontes (Webster & Weber,
2007). Los ciclos de vida de Basidiomycota y Ascomycota incluyen una fase dicariótica que no
existen en las demás divisiones de los hongos. Se inicia cuando las dos células con núcleos
haploides se unen por plasmogamia y ambos núcleos haploides compatibles se asocian en un
dicario unidos por microtúbulos, no se fusionan, se multiplican por mitosis y la hifa dicariótica
crece y se tabica (fíbula). En algún momento del ciclo de vida, los dos núcleos se encuentran en
una célula madre de un meiosporangio, en la cual se fusionan. En los basidiomicetes, el
meiosporangio se denomina basidio y en los ascomicetes asco. El núcleo diploide resultante no
se multiplica por mitosis sino que se divide por meiosis y los cuatro núcleos haploides finales se
llaman en meiosporas y al ser liberadas dispersarán los resultados de la recombinación genética
(Piepenbring, 2015).
1.7. Metabolismo de los hongos
Los hongos son muy diversos, no solamente en morfología y ecología sino también en
compuestos químicos que sintetizan, como carbohidratos, aminoácidos, proteínas y compuestos
7
cíclicos, compuestos que tienden a ser específicos de género o especie (Cepero et al., 2012;
Piepenbring, 2015). Su metabolismo se puede dividir en dos grandes categorías: primario y
secundario, según la función que tengan generados por estos metabolismos en el ciclo de vida
del hongo (Jennings, 1995).
Los metabolitos primarios son esenciales para el crecimiento de los hongos, participan en la
regulación del metabolismo, de intermediarios biosintéticos y en el metabolismo energético. Los
metabolitos secundarios, en cambio se originan como derivados del metabolismo primario y
tienen en común que se producen al final de la fase de crecimiento o cuando el crecimiento es
limitado por el sustrato. Estos compuestos químicos son características útiles para distinguir y
clasificar los hongos (Bushell, 1995). Estas sustancias pueden ser compuestos bioactivos que
presentan actividad antibacteriana, antifúngica, insecticida, nematicida y protozoicida cuando
crecen junto con otros organismos (Deacon, 2006).
1.8. Actividad antibacteriana
La actividad antibacteriana se define como un antagonismo de sustancias naturales (metabolitos
secundarios) o sintéticas contra bacterias en concentraciones pequeñas pero de alta sensibilidad
(Bauer, Kirby, Sherris, & Turck, 1966) como se explica seguidamente.
1.8.1
Concentración mínima inhibitoria
La concentración mínima inhibitoria (CMI) se considera un estándar para la determinación de la
sensibilidad de los microorganismos a los antibióticos, por lo tanto, se usa para juzgar el
desempeño de todos los demás métodos de pruebas de sensibilidad. Este método se utiliza en
laboratorios de diagnóstico para confirmar la resistencia inusual y dar una respuesta definitiva a
la que se obtiene mediante otros métodos de prueba, además determina la actividad in vitro de
nuevos antimicrobianos (Gillard, Al-Dahir, & Brakta, 2016). La CMI se define como la
concentración más baja de un fármaco que inhibe el crecimiento visible de un organismo después
de la incubación, este período se extiende según los organismos a estudiar, como los anaerobios
que requieren incubación prolongada para el crecimiento (Andrews, 2001).
La técnica de microdilución en caldo ha sido ampliamente difundida y se la emplea para
determinar la CMI en un gran número de muestras. Su ventaja se establece en el aumento de la
sensibilidad para cantidades pequeñas, lo cual es conveniente cuando se trabaja con productos
naturales, además permite diferenciar entre un efecto bacteriostático de un bactericida (Langfield
et al., 2004).
8
CAPÍTULO II
MATERIALES Y MÉTODOS
9
2.1. Especímenes o cepas
Se trabajó con 20 cepas de hongos puros (Tabla 1), aislados desde hongos que fueron
recolectados por el equipo de la sección fungario del herbario HUTPL. Estos especímenes
pertenecen a la colección cepario dentro del fungario y se encuentran almacenados en medio
agar papa dextrosa (PDA). Estas cepas fueron seleccionadas principalmente por ser
tentativamente Basidiomycetes y otras características destacadas como su morfología,
pigmentación y rápido crecimiento.
Tabla 1. Cepas de hongos incluidas en este estudio.
N.
Código de colecta*
Código herbario
Localidad
Lugar de recolección
1
2
Daniels-3294
Daniels-3296
H1121C
H1123C
Loja
Loja
Vilcabamba
Vilcabamba
3
4
5
Daniels-3300
Daniels-3308
EM-115
H1342C
H1350C
H968C
Loja
Loja
Loja
Vilcabamba
Vilcabamba
Parque Nacional Podocarpus
6
7
8
EM-169
EM-188
EM-191
H1086C
H1105C
H1126C
Zamora Chinchipe
Zamora Chinchipe
Zamora Chinchipe
El Tambo
El Tambo
Bombuscaro
9
10
11
EM-219
EM-251
EM-253
H1152C
H1186C
H1189C
Zamora Chinchipe
Zamora Chinchipe
Zamora Chinchipe
Nangaritza
Nangaritza
Nangaritza
12
13
14
15
16
17
EM-280
EM-281
EM-322
EM-373
EM-397
EM-541
H1217C
H1218C
H1259C
H1310C
H1334C
H1493C
Loja
Loja
Loja
Loja
Loja
Zamora Chinchipe
Zapotillo
Zapotillo
Zapotillo
Puyango
Puyango
El Tambo
18
19
20
OF001
OF004
OF005
N/D
N/D
N/D
Loja
Loja
Loja
Cajanuma
N/D
Cajanuma
* Los códigos de colecta serán referenciados en todo el trabajo.
N/D = No determinado.
Fuente: Autora
2.2. Identificación morfológica
Para la identificación morfológica de los hongos efectuamos una descripción macroscópica de la
cepa cultivada en medio PDA (crecimiento, coloración de micelio). Microscópicamente se
evaluaron las diferentes estructuras de los hongos como hifas, esporas (conidias), fíbulas, entre
otras. Las características microscópicas fueron registradas en ilustraciones principalmente para
las cepas positivas en pruebas antagónicas. Todas las cepas se registraron fotográficamente.
10
Las estructuras y mediciones se anotaron en descripciones que fueron comparadas con guías
específicas o claves taxonómicas para clasificarlos a diversos niveles como género y especie.
2.3. Identificación molecular
Se utilizó el Kit Extract-N-AmpTM PCR Ready Mix de PCR directa usando fragmentos de micelio
del cultivo del hongo según las indicaciones del fabricante. Se amplificó la región ITS-5.8S y LSU
parcial
(D1/D2)
de
ADNrn
a
través
de
primers
universales:
ITS1
(5′-
TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3’; White et al., 1990) y NL4 (5′- GGTCCGTGTTTCAAGACGG 3′; O’Donnell, 1993).
Las condiciones de corrida de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fueron las siguientes:
desnaturalización a 98ºC por 5 minutos, seguido por 40 ciclos: desnaturalización a 98ºC por 10
segundos, 55ºC por 20 segundos para el anillamiento de los primers, extensión a 72ºC durante
30 segundos y una extensión final a 72ºC por 10 minutos. Se empleó la polimerasa PhireTM Hot
Start II ADN polimerasa. El volumen final de reacción de la PCR fue de 20 µl.
Los resultados fueron evaluados por electroforesis en gel de UltraPureTM Agarosa (Invitrogen) al
1% [agar en solución 1X de Gel Red (Biotium), según norma de manufactura]. Se tomó 2 μl de
producto de PCR más 2 μl de azul de bromofenol y fueron comparados contra un marcador de
peso molecular 1Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen) en buffer de corrida SB 1X (Borato de Sodio).
Las condiciones de corrida de electroforesis fueron: 128 V, 300 mA durante 20 minutos y el gel
se reveló bajo luz UV a 260 nm.
Los productos de PCR fueron purificados con el kit QIAquick PCR Purification Kit Protocol
(Qiagen) y posteriormente enviados a secuenciar a la empresa Macrogen (Seoul - Korea).
2.4. Comparación en BLAST
Mediante la utilización de la base de Datos GenBank, NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y su
opción BLAST, (Basic Local Alignment Search Tool) se comparó las secuencias obtenidas de los
hongos. Las tres secuencias más similares desde la base de datos fueron tomadas como
referenciales para determinar los diferentes niveles taxonómicos como orden, familia, género y
especie.
2.5. Pruebas antagónicas bacterianas en medio sólido
Las pruebas antagónicas bacterianas de todas las cepas de hongos se efectuaron en paralelo a
la caracterización morfológica y molecular.
11
Para la evaluación de la capacidad antagónica in vitro de los hongos, se realizó el ensayo con
bacterias patógenas Gram + y Gram -. Estas cepas bacterianas (Tabla 2) fueron proporcionadas
por la sección de Bioensayos perteneciente al departamento de Química Aplicada de la UTPL.
Para la elaboración del ensayo, se partió de reservas mantenidas a -82ºC y se cultivaron en
medios nutritivos adecuados (Tabla 2) a 37°C por 14 horas. A partir de estos cultivos se realizó
un inóculo en NaCl 0,9%, equivalente a 0,5 McFarland, el cual se distribuyó homogéneamente
sobre placas de Agar Muller Hinton (DIFCO). Se realizó este procedimiento por cada bacteria que
se evaluó y por triplicado. Posterior a ello, se realizaron pocillos de 10 mm de diámetro sobre el
agar inoculado de preferencia siguiendo una estructura similar a un triángulo. Sobre los pocillos
realizados se transfirió el material fúngico, el cual fue obtenido como discos de 10 mm de diámetro
a partir de cultivos frescos mantenidos en PDA. Se requiere que la caja Petri este totalmente llena
de micelio y así haya homogeneidad y suficiente material para obtener los discos.
La transferencia de los discos de micelio se lo hizo en medio ambiente y material estéril (pinzas
y cabinas de flujo laminar), seguido de incubación por 24 horas a 37°C.
Al final de este tiempo se verificó el efecto antibiótico del hongo mediante observación y medición
del diámetro del halo de inhibición (Figura 1).
12
Figura 1: Esquema secuencial de la prueba de antagonismo
Fuente: Autora
Tabla 2. Bacterias patógenas de interés clínico y sus respectivos medios de cultivo específicos utilizados
en el estudio.
Bacterias patógenas
Gram positivas
Medio de cultivo
Enterococcus faecalis
Staphylococcus aureus
Infusión cerebro-corazón (BHI)
Soya tripticasa (TSC)
Gram negativas
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
Soya tripticasa (TSC)
Proteus vulgaris
Pseudomona aeruginosa
Muller Hinton
Salmonella typhimurium
Fuente: Autora
Oxoid
13
2.6. Obtención de extractos fúngicos
Los hongos con probable efecto antibiótico se sembraron inicialmente en 50 mL de medio líquido
YNPD. Se incubaron a temperatura ambiente en agitación hasta que el micelio colonice el medio,
luego se transfirió a 150 mL de YNPD y en iguales condiciones anteriores se incubó hasta que el
crecimiento sature el medio. Así sucesivamente se transfirió el cultivo a cantidades más elevadas
de medio líquido por ejemplo 2000 mL de YNPD.
El micelio desarrollado se separó del medio de cultivo por filtración al vacío. El micelio obtenido
se secó a 30ºC por 12 horas. Se determinó todo el peso seco de la biomasa, esta biomasa fue
colocada en un recipiente, y se añadió 200 mL de acetato de etilo y se mantuvo en el shaker a
200 rpm durante 12 horas con el fin de que el solvente capture los metabolitos presentes en el
micelio. Al finalizar el tiempo se filtró el macerado.
Al filtrado se adicionó resina de absorción Amberlite® XAD7HP, y se agitó por 30 min, seguido
de un nuevo filtrado. Nuevamente se añadió acetato de etilo al filtrado en proporción (1:1) para
extraer los metabolitos remanentes. Se separó las fases sólidas de las líquidas y se efectuó
mediante en embudo de decantación.
La resina resultante se colocó en un frasco con 200 mL con acetato de etilo más agitación a 100
rpm por dos horas seguido de filtrado al vacío. Este proceso se repitió hasta que la resina se
tornó clara.
Tanto el acetato de etilo obtenido desde el macerado y del medio de cultivo se concentró mediante
rotaevaporador a 35ºC. El concentrado final se recuperó con metanol y se colocó en un vial de
vidrio y fue secado al vacío. Al final del secado se obtuvo el peso seco del extracto.
Se calculó el rendimiento de los extractos empleando la siguiente fórmula:
𝑅=
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑠𝑒𝑐𝑎
× 100%
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜
Los extractos se almacenaron en refrigeración hasta la realización de los posteriores ensayos.
2.7. Concentración mínima inhibitoria
La determinación de CMI, de los diferentes extractos obtenidos se realiza por la técnica de
Microdilución en Caldo contra las siete bacterias patógenas. Únicamente se evaluaron los
extractos de aquellos hongos que presentaron halos de inhibición en las pruebas antagónicas.
Para ello los extractos de los hongos se evaluaron a concentraciones de 20 mg/mL como
concentración máxima o a concentraciones menores de acuerdo al rendimiento obtenido. Como
control positivo se empleó Tetraciclina a una concentración de 5 mg/mL y como control negativo
el vehículo empleado para disolver el extracto, el cual fue DMSO (Dimetilsulfóxido).
14
La prueba se realizó en placas esterilizadas de 96 pocillos, mediante diluciones dobles seriadas.
Del medio Mueller Hinton se transfirieron 180 µL a cada pocillo de la primera fila de la placa, en
los pocillos restantes se colocaron 100 µL del mismo caldo. A continuación se colocaron 20 µL
del material fúngico diluidos en Dimetilsulfóxido solo a los pocillos de la primera fila de la placa;
excepto a los tres últimos pocillos los cuales van a contener: el primero, 200 µL de caldo Mueller
Hinton como control de esterilidad, el segundo, un control negativo con 180 µL de caldo Muller
Hinton + 20 µL de DMSO y el último un control positivo, que es una mezcla de 180 µL de caldo
Muller Hinton + 20 µL de Tetraciclina de 5 mg/mL para todas las bacterias. Las placas se
incubaron a una temperatura de 37ºC durante 24 horas.
15
CAPÍTULO III
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
16
3.1. Morfología
Se registraron fotográficamente 18 cepas de hongos (Anexo 1). Las dos cepas restantes no se
registraron por presentar contaminación. De las 18 cepas algunas de ellas mostraron
características distintivas de su anamorfo permitiendo su identificación a nivel de género como el
caso de Ganoderma sp., donde se evidencia la presencia de fíbulas (Anexo 1, Figura 1, I).
Otras cepas no presentaron estructuras asexuales definitorias lo que solamente se registró su
estado estéril (Anexo1, Figura1, C). Es bien descrito en diversos estudios que muchos hongos
en cultivo in vitro producen micelio estéril y otros producen solamente el anamorfo (Cepero et al.,
2012) pobremente algunos podrían generar sus estados teleomorficos o sexuales en condiciones
especiales (Deacon, 2006).
Se hicieron ilustraciones detalladas únicamente para los hongos positivos en las pruebas
antagónicas debido al interés que estos nos generan a nivel de biotecnología. No obstante se
efectuarán a futuro las descripciones detalladas para los hongos restantes. Los tres hongos
positivos fueron Clonostachys sp., Pycnoporus sanguineus y Pyrenochaetopsis microspora.
Clonostachys sp. pertenece a los ascomycetes de la familia Bionectriaceae y se caracteriza por
presentar colonias algodonosas con superficie polvorienta y de coloración naranja clara tanto en
su teleomorfo como en su cultivo anamorfo, esta coloración se debe a la producción de
esporodoquios, masas de color amarillo claro (Schroers, Samuels, Seifert, & Gams, 1999),
además genera conidiódoros dimórficos primarios y secundarios. Los conidióforos primarios
pueden ser similares a Verticillium sp. y los secundarios pueden contener conidias hialinas que
se separan una de otra (Figura 2), como se ha descrito en Alvindia & Hirooka (2011). Esta especie
de hongo es saprotrófo el cual ha sido reportado como micoparásito de hongos y nematodos
(Toledo, Virla, Humber, Paradell, & Lastra, 2006).
17
Figura 2: A. Cepa Daniels-3300 = Clonostachys sp. en medio sólido en PDA. Microscopía. B. Conidióforos
sencillos verticilados. C, D. Células hinchadas de conidióforos verticilados. E, F Ilustraciones. Las barras
representan 10 µm
Fuente: Autora
Pycnoporus sanguineus, perteneciente a los basidiomycetes de la familia Polyporaceae se
caracteriza por ser rojizo en su teleomorfo y anamorfo en cultivo. Microscópicamente genera
fíbulas (Figura 3) como lo ha demostrado Sigoillot et al. (1999). P. Sanguineus es un hongo
considerado filamentoso, saprotrófo, que causa pudrición blanca en maderas muertas (Nobles &
Frew, 1976).
18
Figura 3: A. Cepa EM-281 = Pycnoporus sanguineus en medió sólido de PDA. B. Microscopía, presencia
de fíbulas. C. Ilustración con determinación clara de sus fíbulas. Las barras representan 10 µm
Fuente: Autora
Phoma leveillei var. microspora, actualmente reconocido como Pyrenochaetopsis microspora, se
ha descrito como micoparásito de hongos y de plantas como las gramíneas (de Gruyter et al.,
2010). Esté hongo pertenece a los ascomycetes de la familia Cucurbitariaceae (de Gruyter et al.,
2010). En el cultivo anamorfo presentó colonias de margen irregular marrón oscuro,
oscureciéndose hacia el centro generando micelio aéreo de color gris como en su teleomorfo
descrito en Chen, Jiang, Zhang, Cai, & Crous, (2015). Este hongo no mostró estructuras
asexuales definitorias (Figura 4), pero según bibliografía este hongo presenta, conidióforos,
conidias cilíndricas o elipsoidal a alantoides e hifas septadas, además tiene gran similitud con
Pyrenochaetopsis leptospora diferenciándose solamente por la longitud de las conidias (Crous,
Quaedvlieg, & Groenewald, 2014; de Gruyter et al., 2010).
19
Figura 4: A. Cepa Daniels-3294 = Pyrenochaetopsis microspora en medio sólido de PDA. B. Microscopía,
Células monilioides (flecha blanca), células estériles sin fluidos y pigmentadas (flecha negra). La barra
representa 10 µm
Fuente: Autora
3.2. Comparación de similitud genética
Se obtuvo secuencias amplificadas para la región ITS-5.8S desde 18 cultivos, los cuales
presentan altos porcentajes de cobertura y similitud al realizar la búsqueda del BLAST (Tabla 3).
Estas secuencias nos permitieron clasificar a nuestras cepas a diferentes niveles como ordenes,
familias, géneros y especies. Esto sugiere a este marcador muy útil en los estudios de hongos,
ratificando la región ITS como marcador universal de hongos (Schoch et al., 2012). Tres
secuencias no permitieron observar una buena similitud con secuencias de la base de datos, sin
embargo, no podemos descartar que estas secuencias puedan pertenecer a especies no
registradas o pueden ser secuencias erróneas (Nilsson et al., 2006).
Tabla 3. Comparación y búsqueda de BLAST para las secuencias ITS-5.8S obtenidas desde los cultivos
en el presente estudio.
ITS-5.8S
Similitud en
pares de bases
Cobertura en
alineamiento
E value *
Ascomycetes
1 (Daniels-3294)
Pyrenochaetopsis microspora, KM355992.1*
100%
96%
6e-176
Leptosphaeria sp. HE584912.1*
100%
96%
6e-176
Perisporiopsis sp. HM031458.1*
100%
96%
6e-176
20
ITS-5.8S
Similitud
Cobertura
E value
Polyporus submelanopus, JQ964424.1*
89%
100%
1e-98
Trametes mimetes, JN645074.1*
89%
100%
1e-97
Hexagonia tenius, KP715549.1*
89%
100%
3e-94
Similitud
Cobertura
E value
Basidiomycetes
2 (Daniels-3296)
ITS-5.8S
Ascomycetes
3 (Daniels-3300)
Clonostachys sp. KC007312.1*
99%
99%
0.0
Bionectria sp. “Clonostachys sp.” KC007301.1*
99%
99%
0.0
Clonostachys sp. HQ130701.1*
99%
99%
0.0
Similitud
Cobertura
E value
Lepiota sp. JN224828.1*
98%
99%
4e-91
Lepiota sp. JN224825.1*
97%
99%
2e-89
Lepiota pilodes, EF080865.1*
97%
99%
2e-89
Similitud
Cobertura
E value
Bisporella sp. AY89326.1*
94%
98%
3e-98
Calycina citrina, KC412005.1*
93%
98%
1e-96
Bisporella citrina, GQ411507.1*
93%
98%
1e-96
Similitud
Cobertura
E value
Amauroderma intermedium, KR816524.1*
96%
98%
0.0
Amauroderma calcigenum, JX982565.1*
93%
96%
2e-176
Amauroderma aurantiacum, JX310840.1*
92%
98%
4e-174
ITS-5.8S
Basidiomycetes
4 (Daniels-3308)
ITS-5.8S
Ascomycetes
5 (EM-115)
ITS-5.8S
Basidiomycetes
6 (EM-191)
ITS-5.8S
Similitud
Cobertura
E value
99%
99%
0.0
Ascomycetes
7 (EM-219)
Trichoderma longibrachiatum, KM103342.1*
21
Thichoderma gamsii, KX009499.1*
99%
97%
0.0
Thichoderma koningiopsis, KR995115.1*
99%
97%
0.0
Similitud
Cobertura
Gloeophyllum striatum, KC345720.1*
97%
96%
0.0
Gloeophyllum trabeum, JN182912.1*
93%
97%
0.0
Gloeophyllum sepiarium, JQ673112.1*
93%
95%
0.0
Similitud
Cobertura
E value
99%
100%
1e-152
99%
100%
1e-152
99%
100%
1e-152
ITS-5.8S
E value
Basidiomycetes
8 (EM-280)
ITS-5.8S
Basidiomycetes
9 (EM-281)
“Trametes sanguínea”, Pycnoporus sanguineus,
KF850157.1*
“Trametes sanguínea”, Pycnoporus sanguineus,
KF850156.1*
“Trametes sanguínea”, Pycnoporus sanguineus,
KF850155.1*
ITS-5.8S
Similitud
Cobertura
E value
Ganoderma coffeatum, KU315204.1*
96%
97%
1e-153
Ganoderma subresinosum, KJ654467.1*
93%
99%
2e-140
Ganoderma pseudoferrum, FJ392279.1*
93%
99%
2e-140
Cobertura
E value
Basidiomycetes
10 (EM-322)
ITS-5.8S
Similitud
Basidiomycetes
11 (EM-397)
Eutypella scoparia, EU702434.1*
98%
100%
2e-171
Eutypella sp. EU821493.1*
97%
100%
1e-162
Eutypella sp. EU821475.1*
97%
97%
1e-162
Cobertura
E value
ITS-5.8S
Similitud
Zygomycetes
12 (EM-541)
Mortierella alpina, AB516323.2*
96%
95%
0.0
Aspergillus fumigatus, KU350719.1*
95%
95%
0.0
Mortierella sp. JF439487.1*
95%
95%
0.0
Similitud
Cobertura
Basidiomycetes
ITS-5.8S
22
E value
13 (OF001)
Pleurotus djamor KP026246.1*
99%
100%
2e-180
Pleurotus sp. KR155119.1*
99%
100%
2e-180
Pleurotus djamor, KF280325.1*
99%
100%
2e-180
Similitud
Cobertura
E value
ITS-5.8S
Basidiomycetes
14 (OF004)
Stereum qausapatum, KT876601.1*
94%
98%
0.0
Stereum hirsutum, KR909200.1*
94%
98%
0.0
Stereum rugosum, AJ006685.1*
94%
98%
0.0
Similitud
Cobertura
E value
Ganoderma australe, KF605664.1*
88%
99%
3e-125
Ganoderma annulare, JQ520160.1*
88%
99%
3e-125
Ganoderma adspersum, AJ006685.1*
88%
99%
3e-125
ITS-5.8S
Basidiomycetes
15 (OF005)
* Números de accesión para las tres secuencias con porcentaje de similitud más elevado.
* E value (logaritmo estadístico de significancia)
Nota: Los nombres de sinónimos se muestran entre comillas
Fuente: Autora
Para las cepas Daniel-3296, EM-191, EM-280, EM-281, EM-322, OF001, OF005 (Tabla 3) su
identificación molecular coincide con la determinación morfológica clasificándolos dentro de los
Basidiomycetes, principalmente por la presencia de fíbulas características distintivas de este
grupo (Horton, Bakkeren, Klosterman, Garcia, & Gold, 2005). Entre las especies identificadas se
encuentran
Amauroderma
intermedium,
Ganoderma
australe,
Ganoderma
coffeatum,
Gloeophyllum striatum, Polyporus submelanopu, Pleurotus djamor, Pycnoporus sanguineus
(=Trametes sanguínea).
Algunas de estas especies tienen esencial importancia en la naturaleza e industria por producir
sustancias bioactivas. Por ejemplo, Pycnoporus sanguineus produce enzimas capaces de
degradar la lignina (Agrios, 2005), y también genera sustancias antibióticas (Acosta et al., 2010).
Pleurotus sp. es una especie comestible que tiene un alto potencial nutritivo y es producido y
consumido a nivel mundial (Andrade, 2012). Ganoderma sp. ha sido estudiado ampliamente como
fuente de metabolitos bioactivos donde se ha encontrado compuestos activos con actividad
23
antiviral, antitumoral, hematólógica, antioxidante, antinflamatoria y antidiabetes (Arboleda &
Mejia, 2010; Trigos & Suárez, 2011).
La cepa Daniels-3300 después de la determinación morfológica coincidió con las características
de la especie Clonostachys sp. perteneciente al grupo de Ascomycetes. Este hongo no
corresponde a la fructificación de Basidiomycete del cual fue aislada. En muchos trabajos como
el de Pfenning & Abreu (2000), se sugiere que muestras ambientales pueden contener elevada
contaminación por otros microorganismos. No obstante esté hongo es importante ya que muchos
estudios lo muestran como potencial agente de control biológico para hongos patógenos de
plantas (Moraga, Opazo, Zaldúa, González, & Sanfuentes, 2011).
Las siete cepas restantes no presentaron estructuras morfológicas definitorias por lo que no se
pudo confirmar con los datos obtenidos en el análisis molecular. Por el alto porcentaje de
resultados claros y concisos nosotros sugerimos a los datos moleculares como correctos para las
diferentes cepas sin morfología. Es conocido que varios estudios únicamente hacen referencia a
sus secuencias de ADN obtenidas, ya que muchos hongos en cultivo in vitro sólo producen
micelio estéril o estructuras anamorfas que no permiten una correcta identificación morfológica
(Cepero et al., 2012).
3.3. Pruebas antagónicas en medio sólido
Se evaluó el potencial antibacteriano para los 20 cultivos (Tabla 1), frente a siete bacterias
patógenas de interés clínico (Tabla 2). De todas las muestras, tres cepas, Clonostachys sp.,
Pycnoporus sanguineus y Pyrenochaetopsis microspora (Figura 2, 3 y 4) fueron positivos para
actividad biológica Tabla 4.
Tabla 4. Resultados de pruebas antagónicas mostrando el diámetro de halo de inhibición.
Bacterias Patógenas
Gram Positivas
Gram Negativas
Cultivos
Enterococcus
faecalis
Staphylococcus
aureus
Escherichia
coli
Klebsiella
pneumoniae
Proteus
vulgaris
Pseudomona
aeruginosa
Salmonella
typhimurium
Clonostachys sp.
NA
Activo
Ø 30mm
NA
NA
NA
NA
NA
NA
Activo
Ø 18mm
NA
NA
NA
NA
NA
NA
Activo
Ø 30mm
Activo
Ø 15mm
NA
Activo
Ø 26mm
NA
Activo
Ø 16mm
(Daniels-3300)
Pyrenochaeptosis
microspora
(Daniels-3294)
Pycnoporus
sanguineus
(EM-281)
24
NA: No activo
Ø: Diámetro de inhibición
Fuente: Autora
El cultivo Daniels-3300, identificado como Clonostachys sp., es utilizado generalmente como
agente de control biológico para hongos patógenos de plantas (Nordström, 2014). También se ha
demostrado que tiene actividad antibacteriana frente a Bacillus megaterium, Bacillus subtilis,
Clostridium perfringens, Escherichia coli, Micrococcus tetragenus y Staphylococcus aureus. Las
sustancias activas encontradas en este género son principalmente los Bisorbicillinoides (Zhai et
al., 2016). En este ensayo, Clonostachys sp. mostró actividad para Staphylococcus aureus,
(Figura 5), mientras que no presentó actividad para el resto de bacterias analizadas.
Probablemente los resultados negativos para las otras bacterias se puede deber a que no
seguimos las mismas condiciones de crecimiento señaladas en el estudio de referencia, donde
especifica que los metabolitos secundarios de este hongo se producen sólo bajo condiciones
fisiológicas específicas (Anupama, Narayana, & Vijayalakshmi, 2007).
Pyrenochaetopsis microspora es de gran interés ya que estudios relacionados han descrito que
puede tener actividad antibacteriana y compuestos activos como los Phomalevone A, B, y C
(Shim, Baltrusaitis, Gloer, & Wicklow, 2011). Estudios han demostrado que P. microspora
presenta sensibilidad para bacterias como Bacillus subtilis, Escherichia coli, y Staphylococcus
aureus (Shim et al., 2011). Sin embargo, en dicho estudio no se especifica las condiciones de
mantenimiento del cultivo. Esta variable es importante y puede modificar la generación de
metabolitos y por ende la actividad antibacteriana que presenta la especie, así esta razón puede
explicar porque en este ensayo solo mostró sensibilidad a S. aureus (Figura 5) y no para las
otras bacterias que han sido evaluadas.
25
Figura 5: Antagonismo positivo con halos de inhibición generados por Chonostachys sp. (A) y
Pyrenochaetopsis microspora (B) frente a Staphylococcus aureus.
Fuente: Autora
Pycnoporus sanguineus, es un hongo de gran interés biotecnológico debido a sus compuestos
activos, entre ellos el Poliporin aún en estudio y la Cinabarina que es un pigmento naranja. Estos
compuestos son los responsables de la actividad antibacteriana como lo ha descrito Munoz et al.
(2015). Este pigmento se reporta con actividad contra Bacillus cereus, Enterococcus faecalis, E.
faecium, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Listeria mesenteroides, Lactobacillus
plantarum, Pseudomona aeruginosa, Salmonella sp., S. typhi, Staphylococcus aureus y
Streptococcus spp., pero tiene mayor actividad antibiótica contra bacterias Gram + que frente a
Gram - (A. Smânia et al., 1995; E. Smânia, Smânia, Loguercio, & Gil, 1997). En nuestro ensayo
P. sanguineus mostró actividad contra Escherichia coli, Proteus vulgaris, Salmonella typhimurium
y Staphylococcus aureus (Tabla 4 y Figura 6). De igual forma se evidencio una mayor sensibilidad
para bacterias Gram + (S. aureus) ya que generó una mayor zona de inhibición (30 mm). Con
respecto del resto de bacterias patógenas no presento actividad inhibitoria, lo que se puede deber
a diferentes mecanismos de defensa que poseen las bacterias para resistir la acción de los
antibióticos (Fernández, López, Ponce, & Machado, 2003).
26
Figura 6: Antagonismo positivo con halos de inhibición generados por Pycnoporus sanguineus frente a A.
Escherichia coli, B. Proteus vulgaris, C. Salmonella typhimurium, D. Staphylococcus aureus.
Fuente: Autora
3.4. Extractos y rendimiento de extractos positivos
Los extractos fúngicos se obtuvieron de los cultivos con actividad antibacteriana y presentaron
diferentes características tanto para la coloración como para la consistencia (Tabla 5). Estás
características varían entre los cultivos ya que los extractos son mezclas complejas de cientos
de compuestos, entre ellos los antibacterianos que les otorgan características distintivas entre
géneros (Lynd et al., 2010).
En las características presentes, se determinó que hubo un cambio de coloración respecto al
cultivo en caja Petri en comparación al que presentó en el extracto (Tabla 5), esta variación se
dio principalmente en los cultivos de Pycnoporus sanguineus y Pyrenochaetopsis microspora.
Nosotros sugerimos que el cambio de la coloración según el medio (sólido o líquido) de cultivo
influye altamente sobre la actividad biológica, ya que los hongos en cultivos sólidos presentaron
diferente coloración y mayor actividad en pruebas antagónicas que al emplear el extracto en CMI
(Tabla 5). Varios hongos se han reportado con buena actividad antibiótica gracias a los pigmentos
27
que producen desde sus cultivos puros en medio sólido como por ejemplo Fusarium javanicum
(Arnstein & Cook, 1947). Los pigmentos activos pueden ser muy variables y su producción es
altamente relaciona a las condiciones de crecimiento como: temperatura, pH, oxígeno disuelto,
entre otros (Brakhage, 2004).
Tabla 5. Diferencia de coloración según medio cultivo sólido (PDA) o medio líquido YNPD. Para los
diferentes extractos positivos.
Cepas
Coloración de cultivo en placa
Coloración del cultivo en medio líquido
Clonostachys sp.
Amarillo Claro
Amarillo Claro
Gris
Café Oscuro
Anaranjado
Amarillo Oscura
(Daniels-3300)
Pyrenochaeptosis microspora
(Daniels-3294)
Pycnoporus sanguineus
(EM-281)
Fuente: Autora
El rendimiento de los extractos fue muy variable de los tres hongos con actividad positiva según
su peso (Tabla 6).
El cultivo de Clonostachys sp. tuvo el mayor rendimiento pese a su pequeña producción de
biomasa. Esto indica que el rendimiento de los extractos no es directamente proporcional a la
cantidad de biomasa y esta puede variar dependiendo de la naturaleza química de los metabolitos
y la polaridad del disolvente (León et al., 2011).
Tabla 6: Pesos de la biomasa de los extractos y su correspondencia con el rendimiento.
Cultivos
Peso seco (g)
Peso extracto (g)
Rendimiento peso seco/ peso
extracto
2,5154
0,8020
31.89 p/p
14.0501
1.4057
10.00 p/p
16.5678
1.2321
7.47 p/p
Clonostachys sp.
(Daniels-3300)
Pyrenochaeptosis microspora
(Daniels-3294)
Pycnoporus sanguineus
(EM-281)
Fuente: Autora
3.5. CMI según los extractos para diferentes bacterias
Las cepas de Clonostachys sp. y Pyrecnochaeptosis microspora mostraron un CMI para ciertas
bacterias (Tabla 7). No obstante Pycnoporus sanguineus no tuvo actividad de CMI a pesar de ser
activo en las pruebas antagónicas (Tabla 7, Figura 6).
Tabla 7. CMI de los diferentes extractos frente a las diferentes bacterias de interés clínico.
28
CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA
Bacterias Patógenas
Gram Negativas
Gram Positivas
Enterococcus
faecalis
Staphylococcu
s aureus
Escherichia
coli
Klebsiella
pneumoniae
Proteus
vulgaris
Pseudomona
aeruginosa
(Daniels-3300)
1000 µg/ml
1000µg/ml
NA
NA
NA
NA
Pyrenochaeptosis.
microspora
1000 µg/ml
4000µg/ml
NA
4000µg/ml
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
EXTRACTOS
Clonostachys sp.
Salmonella
typhimurium
NA
(Daniels-3294)
Pycnoporus.
sanguineus
(EM-281)
NA: No activo
Fuente: Autora
El cultivo de Pycnoporus sanguineus, no presentó actividad antibiótica frente a ninguna cepa
bacteriana, no obstante en estudios similares muestran esta especie con valores de CMI de 1,75,9 mg/ml, frente a la muchas bacterias inclusive las utilizadas en esta investigación (Acosta et
al., 2010). El resultado negativo para esta cepa puede deberse a la variación de condiciones de
cultivo como mencionado anteriormente, lo cual disminuye la producción de metabolitos por parte
del organismo (E. Smânia et al., 1997).
El extracto de Clonostachys sp. mostró actividad para bacterias Gram +, Enterococcus faecalis,
Staphylococcus aureus, ambos en una concentración de 1000 µg/ml. Por otra parte el extracto
de Pyrenochaetopsis microspora presentó actividad contra las mismas bacterias pero en
concentración de 1000 µg/ml y 4000µg/ml respectivamente, además fue activo para una bacteria
Gram -, Klebsiella pneumoniae, en una concentración de 4000 µg/ml.
Según Holetz et al.(2002) quién clasifica la actividad antibacteriana y establece valores > 1000
µl/mL como inactiva, 500 a 1000 µl/mL como débil, 100 a 500 µl/mL como moderada, y < 100
µl/mL para buena, nos permite sugerir a nuestros compuestos como inactivos debido a su elevado
valor de CMI. Esta inactividad se define como la necesidad de demasiada concentración de
extracto para poder controlar el desarrollo y actividad antibacteriana. Como consecuencia
descartamos estos extractos para el tratamiento de enfermedades producidas por bacterias en el
ser humano. No obstante estos hongos podrían poseer un buen potencial para fines de
bioprospección, ya que existe un amplio campo de aplicaciones de los hongos y sus compuestos
ecológicamente en micorremediación o en la industria por ejemplo para el biocontrol de plagas
como lo es el caso de Clonostachys sp. (Moraga et al., 2011).
29
CONCLUSIONES
Se logró la identificación a nivel de género y especie de ocho especímenes con una elevada
coincidencia entre los resultados morfológicos y moleculares.
Las especies Clonostachys sp., Pycnoporus sanguineus, y Pyrenochaetopsis microspora
resultaron positivos en la prueba de actividad antagónica, frente a Escherichia coli, Proteus
vulgaris, Salmonella typhimurium y Staphylococcus aureus, con halos de inhibición desde 18 a
30 mm.
Las características de cultivo (sólido o líquido) pueden afectar la generación de metabolitos
secundarios en los hongos y por ende afectar la actividad antibacteriana.
30
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37
ANEXOS
38
ANEXO 1. Fotografías de las cepas estudiadas
Microscopía de las cepas sin actividad antibacteriana con tinción floxine al 0.1 % A. Daniels-3296 Fíbulas, B. Daniels3308 Conidiosporas pigmentadas, C. EM-115 Clamidosporas , D. EM-188 Conidiosporas pigmentadas, E. EM-191 Fíbulas,
F. EM-219 Clamidosporas, G. EM-253 Fíbulas, H. EM-280 Fíbulas, I. EM-322 Fíbulas, J. EM-373 Ovillo de hifas, K. EM397 Células con fluidos celulares ( flecha negra), células estériles sin fluidos celulares (flecha blanca), L. EM-541 Células
con fluidos celulares, M. OF001 Fíbulas, N. OF004 Células con fluidos celulares ( flecha negra), células estériles sin fluidos
celulares (flecha blanca) , O.OF005 Fíbulas. Barras representan 10 µm
39
ANEXO 2. Secuencias ITS-5.8S, obtenidas para las diferentes cepas estudiadas.
EM-115
TCCCCAACGTTGCTTTGGCGGGCCGCCCCGGGGCCGCCGGCTGCGGCCGG
CGCGTGCCCGCCAACAGACCCCCTCAAACCCTGAATGTATGTGTCGTCCG
AGTACGATGTAATGATGAAAACTTTCGACAACGGATCTCTTGGTTCTGGC
ATCGATGAATAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGATTTGCATAATT
CAGTGAATCATCCAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCGGG
EM-191
GGGATCTGGAGATTGACTGGGTTGTAGCTGGCCTTCCGAGGCATGTGCAC
GCCCTACTCATCCACTCTACACCTGTGCACTTACTGTGGGCTTCAGATTG
TGAAACGGGCCTGTTCGCATGGCCTCGGGAAACGTCTGCGGCCTACGTTT
ACCACAAACTCTATAAAAGTATCAGAATGTGTATTGCGACGTAACGCATC
TATATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAA
CGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATC
GAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTG
TTTGAGTGTCATGAAATCTTCAACCTACAAGCTTGTTACCGGGCATGTAG
GCTTGGACTTGGAGGTTTGTCGGCCTTGCGGACGGCTCCTCTTACACGCA
EM-219
GTGGCATTGAGATTAACTCCCAACCCAATGTGACCATACCAAACTGTTGC
CTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCC
GCCGGAGGGACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTTATT
TCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACG
GATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTA
ATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGC
GCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCT
CGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGGAACCCCTAAGACGGG
ATCCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCA
GTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGAAAAA
CACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGA
EM-280
TGGCATTAGGGTACACGGAGTTGTAGCTGGCCGCAAGGCATGTGCACGCT
CTCTACTCAATCACAACCTTACACCTGTGCATCTATTGTAGGTCGGGTGG
40
CTTGGCTTCTGTCAAGCTACTCTTCCTATGTTCTACACATACACTGTAGT
CTTAGAATGTCATCTGCGTATAACGCATCTATAAACAACTTTCAACAACG
GATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTA
ATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGC
GCTCATTGGTATTCCGAGGATCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAATATCTC
AACTTACCCAGTTTTTGTGACTGTGGTGAGCTTGGACTTGGAGGTATGCT
GGCTGACTATTCCGCTCCTCTCTAAATGCATTAGCTGGACCCGTTACGGA
TCACTACTCGGTGAGATAATTGTCCACACCATGTCTGTGAAGTGCCTTAA
EM-281
ACACCCTGCTCATCCACTCTACACCTGTGCACTTACTGTAGGTTTGGCGT
GGGCTTCGGGGCCTCCGGGCTCTGAGGCATTCTGCCGGCCTATGTATCAC
TACAAACACATAAAGTAACAGAATGTATTCGCGTCTAACGCATTTAAATA
CAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGC
GAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCT
TTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGGTTGAG
EM-322
GTTCATACCGAGTCTGACTGGGTTGTAGCTGGCCTTACGAGGCATGTGCA
CGCCCTGTTAATCCACTCTACACCTGTGCACTTACTGTGGGTTTCAGATC
GTGAATTGGGCCTACGGGCTCGTGAAGCGCATCTGTGCCTGCGTTTATTA
CAAACACTATAAAGTATCAGAATGTGTGGGTTGCGACGTAACGCATCTAT
ATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGC
AGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAA
TCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCTAGGATCATGCCTGTTT
EM-397
GTGGCCTCGGAGCTTCTACTCCAACCCTTGAGACATACCTTTGTTGCCTC
GGCGGAAGCGTCTTACCCTGGGATGGCCTACCCTGTAGCGCCCTACCCTA
GGCGGCGCCCCCCGCCGGTGGTCTTCTAAACTCTGTTTTATTGTGTCACT
TCTGAGGATTATTATAAAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTG
GTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATT
GCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAG
TATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCCATCAAGCTT
TATTTTTGCTTGGCGTTGGGAGAACGCGGGGCCGTGGACCCCCGCGCCTC
CGCTCATCCCTCCGCGGACGCCCAGCTACCCGGACGTAGTAATGTTTTCT
EM-541
41
TGCCAGGGTCAGCTGTTTTTATGGCACTTTCAAAATCCATATCCACCTTG
TGTGCAATGTCATCTCACTGGGGGCCACCGGCTGTCAAAAGCCGTCTGGT
CACCTTTGGGATTTATATCTACTCAGAACTTTAGTGATTTTGTCTGAAAC
ATATTATGAATACTTAATTCAAAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTG
GCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATT
GCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCATATTGCGCTCTCTGG
TATTCCGGAGAGCATGCTTGTTTGAGTATCAGTAAACACCTCAACTTCCA
TATCTTTTTTGAAATGGGAGTTGGACTTGAGTGAGCCCAACGCTTTTCCT
CACCGAAAAGTGGCGGGTTACTTGAAATGCATGTGCAGCTGGACTTTTCT
CTGAGCTATTAGCATATCAATAAATTCTGCCTACATTTTGAATTATTATC
TTTGCTGCATCTAATCTATGGGAAATTATCTCTTGTGATCACGGACGGAG
Daniels-3294
GAGGCATCGACGCGGACTTCGGTCCTTGCTGCACCCTTGTCTTTTGCGTA
CCGTATGTTTCCTCGGCGGGCTTGCCTGCCGGTTGGACATTATCAAACCT
TTTTGTAGTTGCAATCAGCGTCAGAAAACAAACAATAATTACAACTTTCA
ACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGA
AAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCA
CATTGCGCCCCTTGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTT
GTACCCTCAAGCACTGCTTGGTGTTGGGCGTTTGTCCTGCAAAGGACTCG
Daniels-3296
ACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGA
AATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTT
GAACGCACCTTGCGCTCCTTGGCATTCCGAGGAGCACGCCTGTTTGAGTG
TCGTGTAATTCTCAACCTACAACTCCTGGCGGTCGTTGTTAGGATTGGAC
TTTGGAGGATTCTTTGTGTCGGGCCCACACACATTTCTGTGGGTCGGCTC
CTCTCAAATGCATTAGCTTGGTTCCTTGCGGATCGGGCCCCCGGTGTGAT
Daniels-3300
GTGTCTGCGTTAACTCCAACCCATGTGACATACCTACTGTTGCTTTACGG
CGGGATTGCCCCGGGCGCCTCGTGCGCCCCGGACCAGGCGCCCGCCTAGG
AAACTTAACTCTTGTTTTATTTTGGAATCTTCTGAGTAGTTTTTACAAAT
AAATAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAA
CGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATC
GAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTG
TCTGAGCGTCATTTCAACCCTCATGCCCCTAGGGCGTGGTGTTGGGGATC
42
GGCCAAAGCCCGCGAGGGACGGCCGGCCCCTAAATCTAGTGGCGGACCCG
TCGTGGCCTCCTCTGCGAAGTAGTAATATTCCGCATCGGACAGCGACGAG
CCCCTGCCGTTAAACCCCCAACTTTCTAAGGTTGACCTCAGATCATGTAG
GAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGACGAAAAGAAACCAA
CAGGGATTGCCCTAATAACGGCGAGTGAAGCGGCAACAGCTCAAATTTGA
AATCTGGCGCAAGCCCGAGTTGTAATTTGAAGAGGATGTTTCTGGCGATG
Daniels-3308
TTGACTATGTCTTTCATATACCATGTAGTATGTTGCAGAATGTATCAATG
GGACTTTGTGCCTATAAACTCAATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGG
CTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTG
CAGAATTCAGTGAATCATCTAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGT
OF001
TGCACGCTTCATTAGTTTCCACTTCATACCCCTGTGCACCTTTGATAGAT
TTCGGTTTGGGTTATCCTTTGGTTTTTTTTCTTAATTGAAAGGCCTTTGG
TTTCCTTAAAACGACTTCTATACTATACCACACACCAAATGTATGTTTTA
TAATGAATGGTTTATAATGACAAGGCCATGAGCCTTATAAACTTAATACA
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AATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTT
GAACGCACCTTGCGCCCTTTGGTATTCCGAAGGGCATGCCTGATTGAGTG
OF004
TTTATGTAGCATTATGACTGGGGTTGTAGCTGGCCTATAAAACGGCATGT
GCACGCCCCTTTCACAATCCACACACACCTGTGCACCTTCGCGGGGGTCT
CTTTTCGAATTTACTTTTGATAGAGGCTCGCGTCCCACTACACACCCTTT
TGTATGTCTTAAGAATGTCTACTCGATGTAATAAAACGCATCTAATACAA
CTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAA
ATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTG
AACGCACCTTGCGCCCTTTGGTATTCCGAAGGGCACACCTGTTTGAGTGT
CGTGAAATTCTCAACCCTCTACATTTTTTTGTTGAGGGATTGGACTTGGA
GGCTTTGCCGGTGCTACTCCGCTCGGCTCCTCTCAAATGCATTACTGCGT
CTTGTTGCGACGTGCGCCTCGGTGTGATAATTATCTACGCTGTGGTGCGC
OF005
TTCATGCCGAGTTCGACTGGGTTGTAGCTGGCCTTCCGAGGCACGTGCAC
GCCCTGCTCATCCACTCTACACCTGTGCACTTACTGTGGGTTTACCGGTC
GCGAAACGGGCTCGTTTATTCGGGCTTGTGGAGCGCACTTGTTGCCTGCG
43
TTTATCACAAACTCCATAAAGTATTAAAATGGGGATTGGGAAGGAACGCC
TCTATTTACCACTTTCCGCCACGGATCTCTTGGCTCCCCCCTCCATGAAA
AACGCCGCGAAATGGCATAAGTAATGGGGATTGGCAAATTTCCTGGATCC
TCCAATCTTTGAACGCCCCTTGCGCCCCTTGGTATTCCCAAGAACAAGCC
44
ANEXO 3. Fórmulas para preparación del medio líquido YNPD usado en el estudio
Preparación para 1000mL
Glucosa
Extracto de malta
Peptona
Extracto de levadura
KH2PO4
MgSO4.7H2O
Vitamina
45
10 g
10 g
2g
2g
2g
1g
10 mL