Download Decoloración y destoxificación del colorante Reactivo

PURIFICACION Y CARACTERIZACION DE LACASAS EXTRACELULARES DE
PYCNOPORUS SANGUINEUS PLICADAS AL TRATAMIENTO DE COLORANTES Y
EVALUACION TOXICOLOGICA DEL PROCESO
Juana M. SALGADO1, Ana M. SANDOVAL2, Erika ESPINOSA1, Edgar DANTAN1, Susana
SILVA1, Monica MENDEZ1, Jorge L. FOLCH1, Elba VILLEGAS1,
Centro de Investigación en Ingeniería y Ciencias, IMTA2,CEIB-UAEM1, Av. Universidad 1001 Col.
Chamilpa Cuernavaca, Morelos Aplicadas. Fax777-329 –7057; [email protected]
Palabras claves Pycnoporus sanguineus, lacasas, decoloración, pruebas de toxicidad
Introduccion Las enzimas lignilolíticas tipo
lacasas, han sido purificadas y estudiadas en
numerosas especies de hongos de la
podredumbre blanca como: Agaricus, Botrytis,
Coriolus,
Daedalea,
Fomes,
Lentinula,
Neurospora,
Phanerochaete,
Pleurotus,
Polyporus,
Schozophyllum,
Trametes,
Trichoderma, Valvoriella y Pycnoporus entre
otras (1). En el caso de la especie Pycnoporus
cinnabarinus la producción de lacasa fue
inducida empleando un medio basal con 2,5
xilidina y se obtuvo una enzima cuyo peso
molecular resulto ser de 81 kDa. Usando un
medio modificado de Dodson suplementado con
2,2-dimetil ácido succinico y como fuente de
carbono cellobiosa o celulosa (5g/l), se
determinó otra isoforma de101 kDa de P.M. Se
ha reportado, además, que empleando el medio
de Tiens y Kirk se obtuvo una tercera isoforma
de 63 kDa (1). Se han descrito otras dos
isoformas de lacasas en P. coccineus una de 70
kDa en un medio de cultivo no descrito (1) y otra
inducida con acido ferulico se de 86 kDa (4). A la
fecha no existe ningun reporte de lacasas
producidas por P. sanguineus que hayan sido
carcterizadas en medios de salvado de trigo. Del
estado de Veracruz, recientemente se aislo una
cepa de P. sanguineus que tolera altas
concentraciones de petróleo de hasta 50,000
ppm y temperaturas de 50 °C. Objetivo.
Caracterizar y purificar lacasas de
P.
sanguineous usando un medio de cultivo que
contiene
Bran
flakes
como
inductor.
Aplicandolas
a
colorantes
tratados
electroquímicamente, evaluando el proceso
toxicologicamente Metodología. P. sanguineus
se inoculo en un medio al 3 % de Bran Flakes
en buffer de fosfatos 60 mM a pH 6 y 30 °C. Se
tomaron muestras durante 15 días, cada 24h. La
actividad enzimática se determinó con ABTS a
420 nm. La enzima se precipito con Etanol,
Acetona y Sulfato de Amonio, en el último caso
se realizó una dialisis para remover exceso de
sales. Se determinó proteina por Bradford y se
realizaron experimentos con SDS-PAGE gel
electroforesis para visualizar las bandas en
geles desnaturalizados usando nitrato de plata y
azul de coommasie. Para revelar la actividad se
corrieron geles nativos y se usaron como
sustrato ABTS y DMP. Los colorantes Naranja
acido y azul indigo fueron tratados empleando
electrogeneración de H2O2 antes de aplicar la
enzima. Se realizaron una bateria de ensayos
de toxicidad Microtox, nemátodos, AMES para
evaluar el proceso. Resultados y discusión. P.
sanguineous pruduce lacasas a los 3 dias de
cultivo. Los geles nativos revelados con ABTS
muestran una sola banda con actividad
enzimática,
en
cambio
los
geles
desnaturalizados
teñidos
con
azul
de
Commassie y Nitrato de Plata revelan al menos
3 isoformas de la lacasa de P.M. que estan
entre 81 y 25 kDa. Conclusiones. P.
sanguineus produce lacasas en el medio que
contiene Bran flakes. Al menos 3 isoformas de
la enzima fueron determinadas en geles
desnaturalizados y una banda con actividad de
tipo lacasa fue obtenida en geles nativos. La
enzima decolora hasta un 80 % ambos
colorantes Naranja acido, Azul Indigo y Azul
Azure. Se presenta una correlación entre las
pruebas
de
toxicidad
Agradecimientos
PROMEP103.5/04/1359 Foliono.101
Bibliografía.
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Tesis de Técnico laboratorista. Escuela de técnicos
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