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Desarrollo de Herramientas Genómicas
para mejorar el impacto económico de los
Programas de Mejoramiento en Acuicultura
Jean Paul Lhorente1, José Manuel Yáñez1,2, Roberto Neira1,3, Marcelo Araneda 1.
1
Aquainnovo, 2Facultad de Cs. Veterinarias y Pecuarias, Universidad de Chile,
3
Facultad Cs Agronómicas, Universidad de Chile
Antecedentes Generales
En un esfuerzo conjunto de Empresas AquaChile y la Universidad
de Chile, apoyado por InnovaChile a través de la línea de proyectos Consorcio (07CTE-01), en el año 2007 se crea Aquainnovo
como plataforma tecnológica focalizada en el mejoramiento genético aplicado a la acuicultura y abierta a la industria. En un
inicio se invirtieron importantes recursos en formar un equipo
de trabajo de excelencia constituido por profesionales nacionales con experiencia en producción acuícola y formación de postgrado; desarrollar una red de trabajo internacional; implementar
un laboratorio de biología molecular y una estación experimental (actualmente ubicada en el sector del Río Lenca), que hoy
constituyen nuestra base de trabajo para soportar programas de
mejoramiento genético en acuicultura al más alto nivel tecnológico. La industria ha enfrentado problemas sanitarios importantes,
donde Piscirickettsia salmonis y Caligus rogercresseyi son los
patógenos que generan las mayores pérdidas económicas (Leal
& Woywood, 2007; Rozas & Asencio, 2007).
Aquainnovo inició sus operaciones focalizado en el desarrollo de
herramientas genómicas para realizar selección por resistencia a
SRS y Caligidosis. Durante los primeros 3 años nos focalizamos
en el desarrollo de protocolos de desafíos controlados contra estos dos patógenos en salmón del Atlántico, que luego ha sido
ampliado para IPNv e ISAv, y también a trucha Arcoíris y salmón
Coho, los cuales constituyen una de las actividades principales
de nuestra estación experimental. En vinculación con los programas de mejoramiento que opera Empresas AquaChile en las tres
especies de salmónidos, se han estandarizado los procedimientos para la obtención de los fenotipos de resistencia para P. salmonis, C. rogercresseyi e IPNv. Esta información se utilizó para
realizar los análisis genéticos que permiten evaluar la factibilidad de seleccionar genéticamente estos rasgos. Además, a partir
de los desafíos experimentales realizados, se han colectado las
muestras de tejidos que permitirán obtener información de los
peces a partir de su DNA. Todas estas fuentes de información,
constituyen la materia prima necesaria para la implementación
de selección genómica. Gracias a que Chile formó parte del Consorcio Internacional por la secuenciación del genoma del salmón
del Atlántico (International Cooperation to Sequence the Atlantic
Salmon Genome - ICSASG), Aquainnovo ha tenido acceso en
tiempo real a la información de la secuencia del genoma que
este consorcio ha liberado. Sobre la base de esta información, a
la competencia del equipo de trabajo, inversión de fondos de la
empresa y proyectos concursables (Innova-Chile CORFO 12PIE17669 y 11IEI-12843) nuestra compañía ha logrado desarrollar
chip de SNPs (single nucleotide polymorphisms) de alta (AQUASALAR 200K SNP-CHIP®) y mediana densidad (AQUASALAR
50K SNP-CHIP®) para implementar selección genómica y selección asistida por marcadores (MAS) para resistencia a Caligidosis, SRS e IPN en salmón del Atlántico, respectivamente. A
continuación presentamos los principales resultados que en este
camino hemos generado para la industria acuícola.
Contribuciones Científicas y Tecnológicas
1.- Resistencia Genética a enfermedades
La resistencia es la habilidad que un individuo hospedero tiene
para resistir el proceso de infección o controlar el ciclo de vida
del patógeno (Bishop, 2002). El fenotipo individual de resistencia más utilizado en salmónidos para enfermedades que causan
mortalidad es la condición vivo (0) o muerto (1) de distribución
binomial. Otra forma de medir el fenotipo de resistencia, es el
tiempo a la falla o muerte, que se considera desde el inicio de
un periodo de evaluación o desafío hasta el momento de la falla
u ocurrencia de la muerte (Ducrocq et al., 2010), el cual ha
sido incorporado en los análisis genéticos a través de análisis
de sobrevivencia. En caso de parásitos la resistencia se mide
como nivel de parásitos por pez a un estado de desarrollo dado
o parásitos por unidad de tamaño de pez (Gjerde et al., 2011;
Lhorente et al., 2011).
El método usual para evaluar resistencia es el desafío de peces
con genealogía conocida y marcados individualmente, con un
patógeno específico bajo condiciones controladas, que permita
lograr una curva de mortalidad entre el 30 -50%. Los métodos
utilizados han sido por inyección intraperitoneal (IP) principalmente en bacterias o cohabitación en el caso de virus para salmónidos. Métodos de desafío por inyección Intraperitoneal (IP)
y cohabitación han sido desarrollados en bacterias y virus, respectivamente para evaluar resistencia genética en salmónidos.
Caligus: Los desafíos experimentales
Figura 1: Curva de Mortalidad de desafíos de familias a Piscirickettsia salmonis
para salmón del Atlantico, Coho y trucha Arcoiris.
SRS:
Protocolos de desafío para SRS han sido desarrollados
y perfeccionados por Aquainnovo en la Estación Experimental
Lenca, utilizando el método de IP para peces en estados esmolt
para salmón del Atlántico y Coho (Yañez et al., 2014,a) y trucha Arcoíris. Sobre la base de poblaciones genealogizadas y bajo
condiciones controladas de agua de mar (desinfectada y a 15
°C), se logra una mortalidad acumulada entre 35-60% en un
periodo de 35-40 días como se indica en la Figura 1.
Simulando condiciones de infección a SRS mas reales, se implementó un protocolo de desafío a SRS por cohabitación en co-infección con Caligus a diferentes presiones de infestación (Figura
1), en el que se comprobó que la presencia del piojo induce la
presencia de mayor mortalidad por SRS (≈ 100%) en relación
a una infección específica (42%) y cambia el performance de
resistencia de las familias al comparar con una infección solo por
P. salmonis (Lhorente et al., 2014).
con piojo de mar se realizan exponiendo a los peces por baño a una presión
de infestación definida como número de
estados infestivos por pez, en estanques
con flujo detenido con agua de mar y
13-15 °C (Lhorente et al., 2011). En estudios preliminares logramos definir que
el rango más adecuado de infestación
están entre 50 y 100 copépodos por pez
(Araya et al., 2011), con tasas de infestación del orden del 20-40 % para salmón del Atlántico y trucha Arcoiris. Debido a que posee una heredabilidad más
alta, es de más fácil proceso y medición,
y más del 90% del conteo se encuentran
en las aletas, el fenotipo más adecuado
para evaluar la resistencia es el conteo
de cáligus por pez en estado sésil (Chalimus 2-3) en las aletas de peces esmolt
(Figura 2), el cual se logra 6-8 días postinfestación. (Lhorente et al., 2011). No
obstante, la alta proporción de parásitos en estado sésil debe ser
revisada en cada ensayo, para validar el fenotipo.
Parámetros Genéticos:
En relación a los desafíos realizados, en las tres especies se evidenciado la presencia de variación genética a explotar mediante selección (Tabla 1) y que
constituye el requisito básico para poder implementar selección
genómica a través del uso de micro arreglos de alta densidad
(Chip de SNPs).
Tabla 1. Heredabilidad para resistencia a SRS y Cáligus para salmón del Atlántico.
Rasgo
Fenotipo
h2 (EE)
Referencia
Mortalidad (0-1)
0.22 (0.07)
Lhorente, 2012
0.15 (0.03)
Yañez et al., 2013
0.24 (0.04)
Yañez et al., 2014
Tiempo (días) a la muerte
(PHFM1)
0.25-0.40
Yañez et al., 2014a
Conteo parásitos
adultos/pez
0.06 (0.06)
Lhorente et al. 2011
Conteo parásitos
chalimus/pez
0.34 (0.07)
Lhorente et al., 2011
Conteo parásitos
chalimus/pez
0.10 (0.03)
Yañez et al., 2014a
Resistencia
a SRS
Resistencia
a Cáligus
1
Figura 2. Variación familiar de N° Chalimus III /pez de salmón del Atlántico.
Proportional Hazard Frailty Model.
Los estudios realizados por Yáñez et al. (2014a) también evidencian que no hay correlación genética entre resistencia a SRS
y Cáligus; y que existen correlaciones favorables entre peso de
cosecha y estos dos rasgos, en el sentido de que peces de mayor
crecimiento tienden a ser más resistentes a estos dos patógenos.
Ello ha permitido incluir la selección simultánea por estos tres
rasgos en el programa genético de salmones Chaicas, mediante
el uso de índices de selección.
2. Desarrollo de un chip de SNPs
para implementar selección genómica
Aquainnovo, en un esfuerzo conjunto con diversas instituciones
académicas y del sector privado, tanto nacionales como internacionales (Universidad de Chile; Genus plc, USA; Marine Scotland Science, Escocia; Université Laval, Canadá; Marine Harvest, Irlanda; Camanchaca, Chile; GeneSeek, USA; Data2Bio
LLC, USA; Iowa State University, USA), ha desarrollado una
plataforma de genotipado de alto rendimiento para salmón del
Atlántico (Yañez et al., 2014,b).
El objetivo principal de este esfuerzo multidisciplinario internacional ha sido realizar un descubrimiento de SNPs de novo,
teniendo en cuenta la duplicación ancestral del genoma del salmón del Atlántico y la variación genética presente en distintas
poblaciones de cultivo y silvestres, para desarrollar un chip de
SNPs de alta y mediana densidad, los cuales se pueden utilizar
en la disección genética de rasgos complejos (resistencia a enfermedades y calidad de canal) y en el mejoramiento genético del
salmón del Atlántico.
La información proveniente de esta herramienta biotecnológica
de última generación permitirá asistir los programas de mejoramiento genético en esta especie, mediante esquemas de selección genómica, permitiendo acelerar el progreso genético para
rasgos que no pueden ser medidos directamente en los reproductores candidatos a la selección (como es el caso de la resistencia a genética a enfermedades y calidad de canal).
Cerca de 10 millones de variantes del tipo SNP fueron identificados mediante la secuenciación de genoma completo y el posterior análisis in silico de las secuencias de 20 peces provenientes
de distintos orígenes. Tras la aplicación de seis distintas etapas
de filtrado utilizando un pipeline bio-informático diseñado para
genomas duplicados, se seleccionaron 200,000 SNPs los cuales
fueron impresos utilizando la tecnología Affymetrix Axiom® my
Design Custom Array (AQUASALAR 200K SNP-CHIP®).
Luego de genotipar 480 peces, los cuales representaban individuos silvestres y cultivados, cerca del 80% de los SNPs impresos
en el chip fueron validados. En una segunda etapa se seleccionaron los mejores 50,000 SNPs para imprimir una nueva
versión del chip (AQUASALAR 200K SNP-CHIP®) (Figura 3) el
cual ha sido utilizado para genotipar cerca de 2,500 peces con
fenotipos para resistencia a Caligidosis y otros 2,500 peces con
fenotipos para resistencia a SRS.
Estos peces pertenecen al núcleo de reproductores del programa de mejoramiento genético de Salmones Chaicas, el cual es
manejado por Aquainnovo. De esta forma, Aquainnovo se transforma en la primera compañía en incorporar información genómica de alta resolución en los programas genéticos de salmón
del Atlántico en Chile con el objetivo de mejorar la resistencia
a las principales enfermedades que afectan la salmonicultura a
nivel nacional.
Figura 3. Chip de SNP de 200k tecnología Affymetrix desarrollado por AquaInnovo.
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