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Microscopía de Fluorescencia
Cuantitativa
Ana González Wusener
Instituto de Investigaciones Biotecnológicas IIB-INTECH
Universidad Nacional de General San Martín
¿Cómo se crea una imagen digital?
• Una imagen captada con cualquier instrumento óptico muestra una variación continua
de matices y tonos de color.
• Se forma una serie bi-dimensional que contiene bloques con información de intensidad.
• Se asigna un valor de intensidad específico, desde negro hasta blanco, pasando a través
de niveles de grises intermedios.
Profundidad de bits
Se refiere al rango binario de
posibles valores de escala de
grises utilizados para traducir la
información de la imagen en
valores digitales discretos.
Transporte
Escalas temporales
Modificaciones
Interacciones
Función de una proteína
Compartimentos
La localización espacial de una proteína es fundamental para su
integración a la compleja red del funcionamiento celular.
Valor de intensidad de un pixel
Número de fluoróforos
¿Qué información está presente en una imagen digital de microscopía de fluorescencia?
(1) espacial, que puede utilizarse para calcular distancias, áreas y velocidades
(2) intensidad, que puede utilizarse para determinar la concentración local
de fluoróforos en la muestra
Señal, background y ruido
En microscopía de fluorescencia cuantitativa se desea medir la señal que proviene de los
fluoróforos usados para marcar el objeto de interes en la muestra.
El background suma a la señal de interés:
Valores de intensidad en la imagen digital = Señal + Background
Para medir con precisión la señal, el background debe reducirse
tanto como sea posible y sustraerse de las mediciones.
!
El ruido causa variaciones por encima y por debajo del valor de intensidad “real” de la
señal + background
La señal debe ser significativamente mayor que el nivel de ruido de la imagen.
La relación señal/ruido (signal-to-noise ratio SNR) limita la precisión de las mediciones.
SNR afecta las mediciones espaciales y de intensidad
El background reduce el rango dinámico y la SNR
El rango dinámico de la cámara CCD es la capacidad completa de los fotodiodos.
En otras palabras, el número de fotones que se pueden detectar por pixel antes de la
saturación
Los fotones del background llegan al detector, limitando el número de fotones de la
señal que pueden detectarse antes de la saturación y reduciendo el rango dinámico.
Ruido del detector
Ruido térmico es causado por la generación de electrones por calor en el detector. Es
dependiente de la temperatura y se elimina mediante refrigeración.
Ruido de lectura es provocado por el circuito amplificador. En las especificaciones
técnicas de la cámara se expresa como número de electrones.
El ruido no es una constante, por lo tanto no se puede eliminar de la imagen.
!
Maximizar la señal
La intensidad de la señal es afectada por cada paso de la cuantificación, incluyendo:
La muestra:
-Elegir un fluoróforo más brillante y fotoestable
-Utilizar un medio de montaje basado en glicerol que contenga un
inhibidor del photobleaching
El microscopio:
- Usar longitudes de onda que exciten de manera óptima el fluoróforo
- La apertura numérica del objetivo es un determinante importante del
brillo de la imágen
- Utilizar un medio de montaje con un índice de refracción similar al
del medio de inmersión para reducir aberraciones esféricas
El detector:
- Aumentar el tiempo de exposición .
Si se llega a la capacidad máxima para acumular electrones, el pixel
estará “saturado” y cualquier fotón que llegue luego de la saturación
no será contado.
Las imágenes saturadas no pueden utilizarse para cuantificar valores de
intensidad de fluorescencia.
- El binning incrementa la intensidad de los pixeles sin aumentar el
ruido (mayor SNR). Sin embargo, disminuye la resolución.
No camera binning
2x2 camera binning
4x4 camera binning
Resolución
Determinada por: - el microscopio
- el detector
Resolución en una imágen óptica. Distancia a la cual dos objetos deben ser separados
para distinguirlos individualmente.
r = (0.61)λ
NA
Resolución en una imágen digital. Dada por el tamaño físico de los fotodiodos que
conforman el chip.
El tamaño del pixel debe ser al menos dos veces más pequeño que el límite de resolución
de la óptica del microscopio, de tal forma que los objetos más pequeños posibles en la
imagen sean muestreados por 4 pixeles.
Procesamiento de imágenes y almacenamiento
Algunos tipos de procesamiento de imágenes y almacenamiento pueden cambiar los
valores de intensidad relativa en la imagen digital, imposibilitando su uso para mediciones
cuantitativas.
El análisis de los valores de intensidad de los pixeles debe realizarse en imágenes crudas, o
en imágenes que han sido corregidas con métodos que preservan la relación lineal entre
fotones y valores de intensidad de la imagen.
TIFF image
JPEG image
www.macbiophotonics.ca/downloads
LOD signal = Bg average + 3SD Bg
1. File / Open
2. Crear una Selección de Área en una región
vacía con la herramienta Rectangle Area
Selection
3. Agregar la selección a ROI (“t”)
4. Plugins / ROI / BG Substraction from ROI
Gray Value
Gray Value
1. Crear una Selección de Línea
2. Agregar la selección a ROI (“t”)
3. Analyze/ Plot Profile
Distance (pixels)
Distance (pixels)
Plot profile: gráfico de las intensidades de los pixeles a lo largo de una línea en una
imagen. El eje X representa la distancia a lo largo de la línea y el eje Y, la intensidad de
pixel.
Procesamiento de Color
Pseudocolor
Una imagen pseudocoloreada es una
imagen en un canal a la que se asigna un
color via “look up table” o LUT (paleta,
tabla de colores): una tabla de valores de
grises con valores asociados de color.
Image/Lookup Tables/Green
Merging
Plugins/Colour Functions/Colour merge
Merging imagenes de fluorescencia y
contraste de fases
Las imagenes de fluorescencia y
contraste de fases pueden combinarse
utilizando la siguiente herramienta:
Plugins/Colour Functions/RGB-Grey Merge
Contraste de fases a 100X AN 1.4
8 bits
16 bits
Contraste de fases a 100X AN 1.4
Binning 1x1
Binning 4x4
Fluorescencia a 100X
AN 1.3
Tiempo de exposición: XX ms
AN 1.4
Tiempo de Exposición: XX ms
Fluorescencia a 100X
1.
2.
3.
4.
Crear una Selección
Agregar la selección a ROI (“t”)
Analyze/ Set Measurements
Measure (en el dialogo de ROI)
Tiempo de exposición: XX ms
Photobleaching
Tiempo de Exposición: XX ms
GFP-α actinina
Vinculina (AlexaFluor 568)
GFP-α actinina
Vinculina (AlexaFluor 568)