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Anticuerpos monoclonales
( Publicado en "La Revolución de la Bioingeniería", Fernando Mönckeberg, 1988,
Editorial Mediterráneo )
Con el descubrimiento de los anticuerpos monoclonales, se ha hecho realidad el sueño
del pibe de los inmunólogos: contar con anticuerpos absolutamente homogéneos y que
se produzcan en forima continua, y siempre con la misma especificidad y afinidad.
Antes de esto el procedimiento de obtención de los anticuerpos, era largo y tedioso. En
primer lugar, había que inyectar los antígenos en animales. Esto tiene el grave
inconveniente de la heterogeneidad y variabilidad de los anticuerpos obtenidos así
como también la presencia de proteínas contaminantes del suero, que son casi
imposibles de separar. Por otra parte, para obtener la cantidad de anticuerpos
suficiente, hay que inyectar varios animales simultáneamente, con el inconveniente que
los anticuerpos obtenidos varían mucho de un animal a otro, tanto en cantidad como en
especificidad y afinidad. Con la técnica de anticuerpos monoclonales, se han subsanado
todos estos inconvenientes, y como consecuencia de ello, se ha abierto un enorme
nuevo capítulo de la investigación en biología y en especial en la medicina.
El descubrimiento fue realizado en Cambridge (Inglaterra), en 1975, por Cesar Milstein
(un refugiado argentino que escapó de la represión política en su país), y por el suizo
George Kohler. Por ello ganaron el Premio Nobel en 1984. En un comienzo no se dio
gran trascendencia a la tecnología descrita y sus autores ni siquiera patentaron el
proceso.
Hoy ha pasado a ser una herramienta de tremenda importancia en la investigación
biológica y de enormes proyecciones en el campo médico. Basta señalar que en el año
1987, la venta de productos fabricados por esta tecnología, superó los 130 millones de
dólares y en el año 1990 superaron los dos millones de dólares.
Las células productoras de los anticuerpos son los linfocitos B. Ellos se pueden extraer
del bazo y cultivar in vitro, pero no sobreviven más allá de algunas divisiones. La
importancia del descubrimiento, consistió en lograr fusionar estos linfocitos B, con
células mielomatosas (célu1as cancerosas), que se sabía se podían reproducir
indefinidamente en un medio de cultivo apropiado (figura 1). En estas células híbridas,
se logró algo fundamental: unir la capacidad de vivir indefinidamente de las células
mielomatosas y la de producir anticuerpos de los linfocitos B. Este procedimiento
permitió obtener células inmortales productoras de anticuerpos. Todo esto unido al
hecho de que cada célula fabrica un anticuerpo específico, de modo que al separar una
célula híbrida de las demás, se puede lograr un anticuerpo que será siempre igual.
Técnica de producción
El procedimiento para producir anticuerpos monoclonales demora, habitualmente,
cuatro meses (figura 2). Para ello, se inyecta en ratones el antígeno, aún cuando no
esté puro. Luego de un período de espera que permite un aumento de los linfocitos B
específicos, se sacrifica el ratón y se extrae el bazo, rico en linfocitos. Como primera
etapa, los linfocitos que se obtengan del bazo, se mezclan con células mielomatosas
(células de un tumor de linfocitos), agregando además polietilenglicol, un agente que
facilita la fusión. Con esto se consigue que algunas células mielomatosas se fusionen
con linfocitos del bazo, produciendo lo que se llama un hibridoma. Se logra así una
célula que combina la capacidad de producir anticuerpos de los linfocitos, con la
capacidad de multiplicarse indefinidamente de la célula mielomatosa. No todas las
células logran fusionarse (hibridizarse), sino que por el contrario, un escaso número de
ellas (sólo una cada 2 x 105 de las células del bazo). De allí que sea necesario eliminar
todas aquellas células que no se fusionen (linfocitos y células mielomatosas).
Los linfocitos que no se han fusionado se eliminan solos, porque luego de unas pocas
divisiones, mueren. El problema más complicado es eliminar las células del mieloma,
que si continúan multiplicándose. Las células mielomatosas que se utilizan para la
fusión han sido genéticamente alteradas, de modo que les falta una enzima vital para
la síntesis de DNA: la hipoxantina guanina fosforibosil trarferasa. Cuando estas células
mielomatosas mutadas se hacen crecer en un medie do cultivo especial, ellas también
mueren. Sin embargo, si se logran fusionar con linfocitos normales, sobreviven, porque
los linfocitos le proveen la enzima que a ellas les falta. De este modo, al poco tiempo,
en el cultivo sólo quedan las células fusionadas (hibridomas).
Luego debe seleccionarse y purificarse, entre todos las hibridomas, aquel que produce
el anticuerpo específico que se desea. Muchas técnicas se han utilizado para seleccionar
los hibridomas específicos, siendo la más usada aquella que utiliza un
radioinmunoanálisis. Para ello, se fija el antígeno específico en el fondo de pocillos de
plástico. Luego, a cada uno de los pocillos se agrega el líquido del cultivo donde están
creciendo las colonias de hibridomas. En aquellos casos en que las colonias secretan el
anticuerpo específico éste va a reaccionar con el antígeno que se ha fijado al plástico,
los demás se eliminan por un simple lavado. En este momento se agrega un reactivo
(marcado con un radioisótopo) que reacciona solamente con la molécula de anticuerpo
monoclonal (generalmente un segundo anticuerpo específico contra los anticuerpos
monoclonales). Después de un tiempo de incubación apropiada, nuevamente se lavan
los pocillos. Para ubicar el hibridoma que interesa se busca en qué pocillo está la
radioactividad (figura 2).
La etapa final, es separar los distintos hibridomas resultantes, con el fin de obtener una
población proveniente de una sola célula (clon). Para ello, las células se diluyen hasta
lograr que una célula quede en un micropocillo de cultivo. El anticuerpo producido por
esta célula y sus progenitoras (clon), es un anticuerpo monoclanal. De allí en adelante
estas células se pueden guardar congeladas o cultivar y multiplicar por siempre (figura
2).
Estos hibridomas pueden inyectarse en la cavidad peritoneal de un ratón donde se
multiplican y desarrollan como un cáncer secretando al mismo tiempo el anticuerpo
deseado. Este método es útil para el trabajo de laboratorio, pero no es práctico ni
económico para la producción comercial del anticuerpo monoclonal. Por esto, se ha
buscado otra forma para poder reproducir y multiplicar el hibridoma; el método llamado
Encapel, que consiste en capsular los hibridomas, en pequeñas esferas (figura 3).
Primero se colocan los hibridomas en una solución biocompatible de alginatos
(sustancia derivada del alga Gracilaria), y luego se encapsulan con una membrana de
polímeros de almidón. La porosidad de la membrana de la cápsula permite que los
gases y nutrientes fluyan al interior y que los productos de desechos, salgan de ella.
Cuando se alcanza la densidad apropiada de anticuerpos en su interior, las cápsulas se
rompen y se recolecta la proteína (figura 4).
Aplicaciones de los anticuerpos monoclonales
Los anticuerpos monoclonales constituyen una tecnología que abre enormes
perspectivas tanto en la investigación básica como aplicada. En todos aquellos procesos
en que ya se estaba utilizando la reacción antígeno/anticuerpo, los anticuerpos
monoclonales agregan especificidad y reproducibilidad, con lo que permiten estudiar
mejor el fenómeno. De allí que una de las primeras aplicaciones prácticas, ha sido en
los ensayos de diagnóstico clínico, para luego utilizarlos en nuevas aplicaciones
terapéuticas e incluso en procesos industriales que necesiten de purificación de
productos naturales.
Diagnostico clínico
Si bien es cierto que son muchas las posibilidades de usos de los anticuerpos
monoclonales, hasta ahora sólo han salido al comercio diversas baterías (kits) para
hacer diagnóstico in vitro. Sus posibilidades son muchas, pero lleva tiempo (a veces
muchos años) para que los organismos controladores autoricen un nuevo producto para
la comercialización. Aún las baterías de diagnóstico in vitro requieren de ese control y
evaluación ya que de acuerdo al resultado de estos ensayos el médico tiene que tomar
determinaciones. Para ello se requiere que los ensayos sean confiables.
1) Diagnóstico del embarazo. Los ensayos ya conocidos para determinar la existencia
de un embarazo, se basan en la determinación de los niveles de gonadotrofina
coriónica (hCG) en la orina. La mujer embarazada tiene niveles más altos de hCG. Para
ello se han desarrollado técnicas utilizando anticuerpo anti hCG. Sin embargo, con
frecuencia se producen reacciones falso-positivas por otras hormonas. Los anticuerpos
monoclonales, en este caso, gracias a su gran especificidad, eliminan este problema.
2) Hepatitis viral. Enfermedad que causa grave daño hepático y que se asocia al cáncer
hepático. Los anticuerpos monoclonales han permitido desarrollar un ensayo, muy
sensible y específico, especialmente útil en los bancos de sangre, ya que se sabe que la
hepatitis se trasmite en gran parte por las transfusiones
sanguíneas.
3) Identificación del rotavirus que produce diarrea en el lactante. Ya se han producido
anticuerpos monoclonales que ponen en evidencia a este virus en deposiciones u otras
secreciones humorales.
4) Genetic System (Seatle, USA), ha desarrollado un test específico para identificar el
virus del herpes utilizando anticuerpos monoclonales, con los cuales se pueden teñir
células del paciente. Al mirar las células al microscopio, puede hacerse el diagnóstico a
los 30 min, en lugar de dos o tres días con ensayos convencionales. Ensayos
histológicos similares se están desarrollando para otros virus (incluso el SIDA),
parásitos o infecciones bacterianas.
5) Uno de los posibles usos de los anticuerpos monoclonales, es el diagnóstico precoz
del cáncer. Algunos tumores secretan diversos antígenos que pueden ser detectados
por anticuerpos. Es así como Hybritech, ha desarrollado una batería de diagnóstico para
detectar las fosfatasas ácidas prostáticas (PAP), que constituyen un indicador del
cáncer prostático.
6) Centour, ha desarrollado otros anticuerpos monoclonales, para detectar antígenos
del cáncer del páncreas gástrico y colorectal.
Probablemente en el futuro nuevos anticuerpos monoclonales se desarrollarán para
detectar ya sea productos hormonales o de bacterias o virus, mejorando la sensibilidad
y especificidad de los métodos clásicos de detección. Por este método, se pueden
determinar entre otros, insulina, hormona de crecimiento, estrógenos, progesterona,
hormona folículo estimulante, hormona luteinizante, testosterona, glucocorticoides,
hormonas tiroideas, trasferrina y muchas drogas (digital, narcóticos, etc.).
7) EL desarrollo de métodos diagnósticos no invasivos, como la tomografía axial
computarizada, ha reducido la necesidad de exploración quirúrgica. Sin embargo, estas
técnicas a menudo requieren contrastar más las imágenes. Los anticuerpos
monoclonales, conjugados con colorantes o radioisótopos pueden ser muy útiles para el
estudio más detallado del órgano afectado. Por ejemplo, Centaur (Malvern,
Pensilvania), anunció haber desarrollado un anticuerpo monoclonal, para medir el daño
cardiaco. Cuando el corazón sufre un infarto, el tejido dañado libera pequeñas
cantidades de proteínas musculares (miosina). Basados en este hecho, se fabricó un
anticuerpo monoclonal antimiosina y se conjugó con un radioisótopo de vida media
corta (Indium 111). Al administrarse este anticuerpo al paciente, éste se une a la
miosina en el tejido muscular y se puede detectar, por tomografía axial, midiendo la
radioactividad del Indium. Con ello se puede observar la intensidad y extensión de la
lesión cardiaca. Siguiendo una aproximación semejante, se han desarrollado
anticuerpos monoclonales contra antígenos de superficie de células tumorales, con la
cual se puede definir el tamaño y extensión de un tumor, sin necesidad de la cirugía.
Anticuerpos monoclonales en terapéutica
1) Anticuerpos monoclonales se utilizan en la terapia de pacientes con leucemia
linfoblástica resistente a la terapia convencional. Un equipo del Hospital Infantil de
Boston (USA) y del Instituto del Cáncer, Sidney Farber (Boston, USA), han tratado ya
numerosos enfermos.
El tratamiento preconizado por ellos comienza con la extracción de una muestra de
médula ósea del paciente, la cual es tratada in vitro con un anticuerpo monoclonal
dirigido contra un antígeno presente en estas cé1ulas leucémicas. Se adiciona también
un complemento, componente del suero que destruye las células a las cuales se ha
unido el anticuerpo monoclanal. Con esto se consigue que desaparezca, de la médula
las células leucémicas, quedando sólo células normales. Estas últimas se congelan y
almacenan, al mismo tiempo que se somete al paciente a una fuerte irradiación para
eliminar todas sus células leucémicas. Luego se infunde al paciente con su propia
médula previamente limpiada. Las células normales vuelven a repoblar la médula. Por
esta técnica se han tratado varios pacientes que se encontraban desahuciados
habiendo conseguido en algunos casos una remisión completa.
2) Uso de anticuerpos monoclonales en el tratamiento del cáncer. La idea es fabricar
anticuerpos contra receptores celulares de células cancerosas y conjugarlos con
sustancias químicas tóxicas, con radioisótopos o sustancias tóxicas naturales. Se
trataría de una especie de bala mágica, destinada a destruir exclusivamente las células
cancerosas. Es aquí donde los anticuerpos monoclonales tienen una enorme
potencialidad y son muchos los centros quo están trabajando en esta dirección.
Los avances logrados ya han sido analizados en "Cáncer y Manipulación Genética".
3) Anticuerpos monoclonales para prevenir el rechazo del trasplante renal.
Recientemente, el Food and Drug Administration (USA), ha aprobado el primer
anticuerpo monoclonal para su comercialización y uso clínico. Se trata de un anticuerpo
contra las células T, células responsables del rechazo de órganos trasplantados. Por su
acción contra estas células, este anticuerpo monoclonal (fabricado por Ortho
Pharmaceutical Corporation de USA), ha sido de gran utilidad para impedir el rechazo
en el trasplante de riñón.
Este anticuerpo monoclonal se ha mostrado en ensayos clínicos más útil que las drogas
utilizadas hasta hoy, porque tiene la ventaja que sólo ataca a las células T y no altera
el resto del sistema inmunológico.
4) Uso de anticuerpos monoclonales en la terapia de enfermedades por autoinmunidad.
Las enfermedades por autoinmunidad se producen porque el sistema inmunológico
reconoce a sus propios tejidos como si fueran extraños y comienza a generar una
respuesta inmune contra ellos. En la miastenia gravis, por ejemplo, el sistema
inmunológico fabrica anticuerpos contra los receptores de acetil colina (que participan
en la comunicación nervio-músculo). Estos autoanticuerpos alteran la contracción
muscular normal.
Para el tratamiento de esta enfermedad, se utiliza un procedimiento semejante a la
diálisis renal, en el cual la sangre del paciente se hace pasar a través de una columna
cargada con anticuerpos monoclonales que captan y remueven los anticuerpos
autoinmunes. Este procedimiento de lavado sanguíneo, puede aplicarse a muchas otras
sustancias sanguíneas que se desee extraer. Por un mecanismo semejante, también se
podrían controlar las alergias. La mayor parte de las alergias se deben a que el
organismo produce gran cantidad de anticuerpos del tipo inmunoglobulina E, que
reacciona con el alergeno. El tratamiento sería similar a lo descrito para las
enfermedades autoinmunes, con la diferencia de que el anticuerpo monoclonal se usa
para remover las células que producen las inmunoglobulinas E, eliminando de esta
manera la alergia.
Sin embargo, todas estas aplicaciones terapéuticas de los anticuerpos monoclonales,
tienen sus problemas ya que pueden producir efectos secundarios no deseados. No
debemos olvidar que los anticuerpos monoclonales son moléculas producidas por
células de ratón y que ellas mismas pueden servir como antígenos y provocar una
respuesta inmune en el paciente. La verdadera solución sería producir anticuerpos
monoclonales humanos, lo que disminuiría el riesgo de reacción inmunológica. Sin
embargo, hay dos grandes obstáculos. Primero, que no existen células de mieloma
humanas adecuadas para ser fusionadas con linfocitos humanos. En segundo término,
obtener linfocitos humanos inmunes en suficiente cantidad es muy difícil, ya que no es
posible (ético) inmunizar a los humanos o sacarles el bazo como para proveer de
linfocitos.
Otro problema para usar anticuerpos monoclonales en la terapia humana es la
posibilidad de que se generen complejos antígeno anticuerpo. Se sabe desde hace
mucho tiempo que estos complejos pueden dañar el riñón, al mismo tiempo que
pueden actuar como antígenos.
Aplicaciones industriales de los anticuerpos monoclonales
Las anticuerpos monoclonales han pasado a constituir un complemento indispensable
para la ingeniería genética y la biotecnología. Mediante la ingeniería genética se logra
que bacterias u otros microorganismos produzcan sustancias de uso médico (interferon,
insulina, hormona de crecimiento, etc.), pero para poder usarlas en humanos, éstas
necesitan purificarse, porque junto con ellas hay muchos otros contaminantes
(proteínas bacterianas, restos de bacteria u otros contaminantes). Los anticuerpos
monoclonales pueden utilizarse para esta purificación. El procedimiento consiste en
pasar el material impuro a través de una columna que contiene anticuerpos
monoclonales fijos en una matriz y que son específicos para la sustancia que se quiera
purificar. Los anticuerpos atrapan esta sustancia mientras todas las impurezas siguen
su camino. Posteriormente se trata la columna de modo de romper el complejo
antígeno/anticuerpo, quedando así el producto puro.
Esta técnica también se utiliza para purificar vacunas preparadas por ingeniería
genética, a cualquier antígeno viral, bacteriano a parasitario. La técnica tiene el
inconveniente que para separar el antígeno del anticuerpo se utilizan métodos drásticos
que pueden alterar la calidad de la proteína, pudiendo obtenerse productos inactivos.
Aplicaciones de anticuerpos monoclonales en investigación básica
En investigación básica, el uso de anticuerpos monoclonales es imposible de resumir y
la literatura científica de los últimos años está plagada de publicaciones en que se
utilizan anticuerpos monoclonales con los más diversos objetivos. Ellos se están
utilizando, por ejemplo, para caracterizar y purificar nuevas sustancias biológicas, como
las interleuquinas, la caquectina, encefalinas, endorfinas, morficeptinas, y muchas otras
que constantemente se están describiendo. Otras publicaciones los utilizan como
marcadores celulares, ya sea en embriología y en diferenciación celular. Así, por
ejemplo, los linfocitos, al microscopio, se ven todos iguales, pero ahora se han
clasificado en diferentes tipos, de acuerdo a sus propiedades funcionales. Esta
clasificación se realiza con la ayuda de anticuerpos monoclonales.
Del mismo modo, los anticuerpos monoclonales se están utilizando para identificar
antígenos en algunas células del sistema nervioso con el objeto de conocer cómo las
células nerviosas se interconectan. Se calcula que en el cerebro hay 1010 células
nerviosas, con hasta 1000 conexiones cada una. Por tanto existen millones de redes
posibles de células, que recién ahora se está comenzando a conocer como se
interconectan entre sí. Con su facilidad para captar lo que ocurre en la superficie de la
célula, los anticuerpos monoclonales están sirviendo para explorar la intrincada red del
interior del cerebro, del mismo modo como podrían identificarse los hilos de colores de
un cable eléctrico.
Otras investigaciones los utilizan para estudiar los mecanismos por los cuales las
células se reconocen entre sí, formando estructuras tisulares. Parece ser que el
reconocimiento de célula a célula, se realizaría a través de moléculas que están en la
superficie. Los anticuerpos monoclonales han sido utilizados para bloquear e identificar
estas moléculas y así contribuir a aclarar este desconocido fenómeno.
En resumen, la breve historia de los anticuerpos monoclonales, que se remonta a
veintidós años, ha provocado una enorme excitación en el campo médico, científico e
industrial. Con todo, esta fantástica herramienta está induciendo un cambio que hace
muy poco se inició. Milstein y Kohler, en su publicación original tímidamente
mencionaban, que los anticuerpos monoclonales podrían ser de valor en el campo
médico e industrial. Probablemente ni ellos se imaginaron el enorme cambio que
estaban produciendo. Una vez más, un conocimiento básico influye directamente en
nuestras vidas.
Artículo extraído de CRECES EDUCACIÓN - www.creces.cl