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Rol del Laboratorio en el Diagnóstico
y Prevención de la Infección por
CMV en pacientes transplantados
Bioquímica Mariela Merkt
CMV: Características
Familia β Herpesviridae
DNA doble cadena
Virus envuelto
Es el virus herpes más grande (240 kb)
Infección por CMV
Es común, entre el 40-100% de la población mundial adulta
es seropositiva
Muchos individuos son infectados en la infancia, y en la
mayoría de la población no causa enfermedad con significado
clínico
CMR, 13,83-121,200
CMV
INFECCION PRIMARIA
ESTADO LATENTE
REACTIVACION
oreceptores
o
de transplantes
pacientes HIV positivos
oindividuos
oMujer
con sistema inmune inmaduro
embarazada: infección congenita
Enfermedad clínica
Severa
JCM,40,746-752,2002
Small RNA and Large Virus NEJM;357,25. 2007
Infecciones post transplante
El impacto del CMV en los transplantados
es considerado como la más importante
causa de morbi-mortalidad
JCM,40,746-752,2002
Enfermedad por CMV
Primoinfección: transferencia a través del órgano
transplantado
Reactivación: Infección latente
Super infección: cepa distinta a la cepa latente
Efectos del CMV
DIRECTOS
INDIRECTOS
1.Directos:
• Sindrome mononucleosis like
• Leucopenia o trombocitopenia
• Infección del injerto
• Neumonitis
• Infección de TGI
• Encefalitis
NEJM;338,24;1998
Efectos del CMV
2.Indirectos: Acción inmunomoduladora:
• Aumenta el riesgo de infecciones oportunistas
(bacterianas, fúngicas)
• Aumenta el riesgo de injuria del órgano transplantado
(agudo y crónico)
• Relacionado a ateroesclerosis del corazón transplantado
NEJM;338,24;1998
Factores de riesgo para desarrollar enfermedad
por CMV
Estatus del donante y del receptor del transplante
Del grado de inmunosupresión (reactivación)
La presencia de CMV en sangre (viremia) asociado con alto
riesgo de recurrencia o enfermedad futura
La carga viral de CMV
IHMF;2002
Presentación clínica
depende del tipo de transplante
TOS (excepto corazón y pulmón) ocurren severas
infecciones del tracto GI con leucopenia y trombocitopenia; la
neumonía es rara.
TMO y receptores de corazón y pulmón la neumonía es la
secuela más frecuente y la más fatal.
La retinitis es rara en los transplantados
IHMF;2002
Manifestaciones Clínicas
www.pps.co.uk/ihmfwelcome.htm
Tratamiento
Manejo antiviral de
CMV
Prevención
Profilaxis
universal
Dirigida a todos
los
transplantados
Tratamiento
Profilaxis
selectiva
Dirigida a
pacientes de
alto riesgo
Temprano
(preemptive)
Tratamiento
tardío
Se aplica una vez
Según resultado
iniciado los
del test empleado
síntomas
PROFILAXIS
V: No se requieren test de
laboratorio para iniciar la
terapia
D. Riesgo de exposición a
drogas en individuos de bajo
riesgo
Desarrollo de resistencia
PREEMPTIVE
THERAPY
V: Exposición de pocos
individuos a las drogas, al igual
que el tiempo de exposición
D. Requiere test de elevada
sensibilidad
IHMF;2002
Por qué medir la viremia?
Diagnóstico de enfermedad
Tratamiento
Monitoreo de la replicación viral
Pre-emptive
therapy
Monitoreo de la terapia antiviral
Duración del
tratamiento
Evaluar
resistencia
IHMF;2002
Frecuencia de monitoreo para guiar
pre-emptive therapy
Semanalmente monitorear viremia usando durante los
primero 3 meses luego del transplante o durante más tiempo
dependiendo de la intensidad de la inmunosupresión.
www.pps.co.uk/ihmfwelcome.htm
Riesgo de infección según serología
D-/R-
D-/R+
D+/R+
D+R-
Mayor riesgo
IHMF;2002
Ensayos para la detección de CMV
1.NO MOLECULARES: Cultivo convencional, shell vial,
antigenemia pp65
2. MOLECULARES:
A. Cualitativos: PCR casera, PCR Amplicor, Nuclisens pp67
(NASBA)
B. Cuantitativos: Cobas Amplicor Monitor, Híbrido de
captura, Quantiplex bDNA, PCR en tiempo real
IHMF;2002
NO MOLECULARES
IHMF;2002
Detección del Ag temprano pp65 por
Inmunofluorescencia
pp65
Resultados: Se informa nº de células positivas/ 200.000
leucocitos
Comparando métodos
Pp65
V: Es más sensible que los métodos de cultivo viral
D: no es útil en periodos de neutropenia (se necesita un
gran número de leucocitos)
Requiere del rápido procesamiento de las muestras, y su
resultado puede ser subjetivo, dependiendo de la
experiencia del observador.
Cultivo viral
insume mucho tiempo, menor reproducibilidad, menor
sensibilidad
IHMF;2002
Recomendaciones para el inicio de pre-emptive
therapy según pp65
TOS:
Más de 10 células positivas/200.000 células
observadas
TMO:
Mayor o igual a 1-2 células positivas/200.000 células
observadas
El cultivo viral y el shell vial no son
adecuados para guiar pre-emptive
therapy
IHMF;2002
MOLECULARES
Ensayos moleculares comerciales
para la detección de la infección por CMV
IHMF;2002
2. METODOS MOLECULARES
Nuclisens pp67 test
Tipo de muestra: plasma
El target de ácido nucleico es RNA y no DNA (indica
infección activa)
Límite de detección: aprox 700 moléculas de RNA
Desventaja: No es cuantitativo
IHMF;2002
2. METODOS MOLECULARES
Híbrido de captura CMV DNA assay
Sensibilidad de 76-100%, comparado con el shell vial 7497% y Amplicor CMV Monitor assay 88-100 %
New Microbiol 1996;19:193-201
2. METODOS MOLECULARES
Branched-DNA (bDNA)
Ventaja
Alta reproducibilidad
Desventaja
Necesita de un alto número de PMN 2.106
IHMF;2002
2. METODOS MOLECULARES
Cobas Amplicor CMV Monitor (ROCHE) Cuantitativa
Puede ser utilizada con plasma o Leucocitos
El test utiliza el Cobas amplicor
Buena especificidad
Estrecho rango dinámico y alta demanda de tiempo para
su realización.
Rango: 400-1.105copias/mL plasma o por 5.106 Leucocitos
IHMF;2002
Cobas Amplicor CMV Monitor (ROCHE) Cuantitativo
Usando plasma: 1000-5000 copias/mL en TOS
TMO cercano al límite de detección
para guiar pre-emptive therapy
IHMF;2002
2. MOLECULARES
“Detección cualitativa de ADN por PCR”
Tipo de muestra: Leucocitos
Ventajas
Permite detectar a muy bajo nivel de viremia (alta
sensibilidad)
Permite monitorear la eficacia del tratamiento antiviral
Sensibilidad cercana al 100 %
Desventajas
No permite diferenciar infección latente de enfermedad
activa.
IHMF;2002
2. METODOS MOLECULARES
PCR en Tiempo Real
Combina la química de la PCR con sondas fluorescentes para
detectar el producto amplificado en la misma reacción,
permitiendo además medir durante la amplificación la
cantidad de ADN sintetizada a cada momento, mostrando y
registrando la cinética de la reacción de la amplificación.
Enferm Infecc Microbio Clin 2004;22 (5): 299-305
Hay diferentes fluoróforos para la detección
SYBER Green:
Fluoróforo no específico
Detecta todos DNA de doble cadena producidos durante
la reacción de amplificación
(producto específico, inespecífico o dímeros de primer)
www.roche.com
Para discriminar si las muestras son positivas o negativas se
realiza una curva de desnaturalización (“melting curve”) al final
de la reacción
La reacción se calienta desde 50 hasta 95 ºC monitoreando
continuamente la fluorescencia
Cada amplicon tiene un Tm característico, lo cual depende
del: tamaño, contenido de CG y la secuencia.
Enferm Infecc Microbio Clin 2004;22 (5): 299-305
PCR Cualitativa
Lo realizamos en:
Sangre entera
Biopsias
Control interno
LightCycler: Roche
Se informa: Detectable o no detectable.
Sitio de amplificación
Gen que codifica para la glicoproteina
B del CMV
PCR Cuantitativa
LightCycler Roche
Tipo de muestra: Plasma
Se utlizan standares de cuantificación caseros
Control interno
Rango lineal: 200-200.000.000 copias
Se informa: copias/mL de plasma
Sitio de amplificación
Gen que codifica para la glicoproteina
B del CMV
2000
copias/mL
2. METODOS MOLECULARES
PCR en Tiempo Real
Ventajas
Altamente sensible y específica
Mejor relación costo-beneficio para determinar C.V
Permite predecir enfermedad
monitorear la terapia antiviral
Rápida 1 hora
Menor riesgo de contaminación cruzada
Aplicación de la Cinética de la carga viral en la
identificación del paciente de riesgo
Carga viral en la primera muestra positiva (carga viral inicial)
Velocidad de aumento de la carga viral
FACTOR DE RIESGO
Cinética de cargas virales (CMV)
200000
c o p ia s /m l
1000
500
150000
100000
50000
0
0
0
3
17
24
31
38
0
4
Días
11
Días
60000
copias/m l
co p ias /m l
1500
40000
20000
0
0
7
9
14
Días
21
24
29
17
Tipos de muestra
Cuantificación en distintos compartimentos celulares:
sangre entera, plasma, Leucocitos, MN, PMN
Carga viral en sangre entera 0.67 log más elevada que
en plasma
Carga viral en PMN y MN similar en pacientes con
enfermedad activa
Uso de Leucocitos: carga viral baja, progresión rápida
de la enfermedad (TMO).
Uso de plasma: progresión lenta de la enfermedad
(HIV), neutropenia.
CMR, 1998,11:533-554
Qué muestra es la mas conveniente?
Evaluar cada caso
en particular
•Tipo de paciente
•Metodología disponible
Todas las muestras
1. Proveen información pronóstico
2. Pueden usarse para el inicio preemptive therapy
3. Pueden medir respuesta a la terapia
Tratamiento
Ganciclovir IV:
•Tratamiento de 2-4 semanas en TOS
•Idem en TMO; con pneumonitis se agrega gammaglobulina
endovenosa. No hay estudios randomizados; está basado
en estudios comparativos en un pequeño grupo de
pacientes.
Valaciclovir
Foscarnet (resistencia al ganciclovir)
Cidofovir: en individuos con HIV/SIDA
NEJM;335,721-729, 1996
CONCLUSIONES
Se necesitarían estudios comparativos para evaluar y
poder estandarizar los ensayos moleculares para los
distintos transplantes
Se necesitarían estudios que validen la carga de CMV
para iniciar las estrategias del tratamiento temprano en
función a los resultados de la carga viral
CONCLUSIONES
La baja sensibilidad del cultivo convencional y del shell
vial limitan su uso en el manejo de la infección por CMV en
este tipo de pacientes
Es necesaria la utilización de métodos cuantitativos
para establecer el riesgo de enfermedad y para monitoreo
del tratamiento o detectar resistencia.
A pesar de que hay muchos puntos en el
manejo del paciente transplantado que
aún no han sido dilucidados, y que falta
mucho por aprender, las herramientas
diagnósticas con las cuales contamos en
el Laboratorio son de mucha utilidad
para poder ayudar a este tipo de
pacientes a prolongar su vida
Muchas Gracias…
www.drstamboulian.com.ar