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INTRODUCCIÓN AL
DIAGNOSTICO VIROLOGICO
Curso de Infectología y Maestría
en Microbiología Clínica, UCA,
2013
Dra Guadalupe Carballal
Laboratorio de Virología Clínica, CEMIC
Para que sirve el Diagnóstico
Virológico ?
Es el diagnóstico de CERTEZA
El cuadro clínico no permite la certeza
El diagnóstico virológico sirve para:
• diagnóstico de infección actual o pasada del
paciente
• pronóstico
• situación epidemiológica
• ejemplos
Procedimientos diagnósticos de acuerdo a
lo que detectan........
• Directos:
*
*
*
*
*
citopatología: lesiones: anatomia patológica
agente infeccioso: Aislamiento in vivo o in vitro
antígeno: inmunoensayos
partícula viral: microscopia electronica
genoma: métodos moleculares
• Indirectos o serológicos : anticuerpos
Cómo puede detectarse infección
pasada o presente ? .......
En suero o plasma ;
con Métodos Indirectos o serológicos
Pasada: Deteccion de estado inmune (status inmune):
Ig G específica en muestra única
Presente:
Ig M específica o
Seroconversión para Ig G en 2 muestras pareadas
Valor de la Serología en el siglo
XXI
Estado inmune:
Rubéola, CMV, Hepatitis A y B
Diagnóstico:
HIV ½ , HTLV ½, Hepatitis A, B, y C
Epstein Barr
Parvovirus
HIV 1/2, HTLV
Fiebre Hemorrágica Argentina, Hantavirus,
muchos arbovirus (Dengue, West Nile, etc
Técnicas Serológicas
Actuales
Inmunofluorescencia indirecta (IFI)
Enzimoinmunoensayos ( ELISA, MEIA)
Aglutinación de partículas de latex, gelatina o glób rojos
En desuso Fijación de Complemento. RIAM
Casos especiales
Neutralización in vivo o in vitro: vacunas
Inhibición de Hemoaglutinación ( IHA): Influenza
Métodos de confirmación
Western blot (HIV, HTLV)
LIA, RIBA (Hepatitis C)
Para que sirve la serología ?
• Estado inmune para Rubeola, CMV,
Hepatitis A y B
• Diagnóstico de Hepatitis virales A, B, y C
• Diagnóstico de Epstein Barr virus
• Diagnóstico de Parvovirus
• Diagnóstico de HIV, HTLV
• Diagnóstico de FHA, arbovirus ( Dengue,
West Nile, etc )
TECNICAS DE INMUNOMARCACION
DETECCION DE
ANTICUERPOS
POR ELISA
INTERFERENCIA POR FACTORES REUMATOIDEOS
DIAGNOSTICOS DIRECTOS
Muestras para diagnóstico directo
• Respiratorias: Aspirado nasofaríngeo (ANF)
Hisopado nasofaringeo( HNF),
otras
• Lesion cutánea o mucosa: hisopados de lesiones
• Sangre,suero
• orina
• LCR
• heces
• Biopsias, autopsias
Obtención de la muestra: esencial !
Aspirado nasofaringeo *
Hisopados nasal/faríngeo
combinado
Hisopado nasofaríngeo
Hisopado nasal
Aspirado traqueal
LBA
Biopsia
Antes de los 3 días del inicio del cuadro
Muestras respiratorias
HISOPADOS NASOFARINGEOS
Métodos Directos Clásicos-1
Histopatología
Con tinciones histológicas: HE, otras
• Inclusiones intranucleares o
citoplasmáticas en tejidos
infectados
• Ej: CMV, Herpes, Adenovirus,
Rabia, Virus BK, Viruela, etc
• Baja sensibilidad de la histopatología
si las lesiones son focales
Inclusión intranuclear por Citomegalovirus: Ojo de Buho
Biopsia renal, H & E. Nefritis intersticial por poliomavirus(Virus BK). Infiltrado intersticial a
predominio de linfocitos. Notar la inclusión intranuclear grande anfófila con anillo de cromatina
denso periférico en el núcleo de la célula tubular. CEMIC, 2007 Gentileza de Dr Iotti
Métodos directos- 2
Microscopía electrónica
•
Detecta partículas virales y su mofología
•
Diferencia las diferentes familias pero no virus de la misma
familia
•
Es rápido, pero no se emplea de rutina por
su alto costo y baja sensibilidad ya que depende
de la concentración viral en la muestra.
Ej:
• Diagnostico virus productores de diarrea en M Fecal
• Diferenciar en forma rápida viruela de varicela en vesículas
• Estudios de investigación en patogenia
Métodos Directos –3: Aislamiento in
vivo en animales de experimentación
• Huevos embrionados
• Ratones lactantes o adultos
• Cobayos, conejos, primates
• Observación de lesiones, enfermedad y/o muerte
• Utilidad:
Antes para diagnóstico
Ahora: estudios de patogenia viral y producción de
algunas vacunas (ej Influenza en huevos)
Ratones lactantes
ratones
Cobayo muerto por Virus Junín
Huevo embrionado inoculado con virus
Acción citopática en membrana de huevo embrionado
Desventajas del Aislamiento en
animales
•
•
•
•
Alto costo de mantenimiento de bioterios
Complejidad
Bioseguridad
Necesidad de animales libres de patógenos
Métodos directos- 4
Aislamiento in vitro: CULTIVOS
CELULARES
• Gold standard del diagnóstico para los
virus cultivables
Qué es un cultivo celular ?
Tipos de cultivos celulares
• Primarios: prepucio humano (CMV)
• Cultivo de células diploides:MRC-5, WI38
• Líneas celulares contínuas: HEP-2,
VERO, LLC- MK2-, MDCK, BHK, etc
(ver bibliografía )
ACP: Sincicio por virus Sincicial Respiratorio
CULTIVOS CELULARES DE USO FRECUENTE Y VIRUS QUE DETECTAN
Primario
Riñón de mono
Influenza, Parainfluenza, Enterovirus
Riñón de conejo
Herpes simplex
Riñón de embrión humano
Adenovirus, Enterovirus
Fibroblastos de prepucio de recién nacido
Citomegalovirus
Diploide
Pulmón humano fetal: MRC-5
Citomegalovirus; Varicela, Herpes
Rhinovirus; Enterovirus
Adenovirus, Respiratorio Sincicial
Continuos
Carcinoma de laringe: Hep-2
Respiratorio Sincicial; Adenovirus
Herpes, Enterovirus
Riñón de perro: MDCK
Influenza
Carcinoma de pulmón: A-549
Adenovirus, Herpes simplex; Enterovirus
Riñón de primate LLC-MK2
Parainfluenza, Metapneumovirus
Requerimientos para un laboratorio de
Aislamiento en cultivo celular
• Equipamiento
• Bioseguridad
• Eliminación de material infeccioso en
condiciones adecuadas
• Personal altamente entrenado
• Alto costo
Flujo laminar de seguridad biológica
Conservación de virus y células en tanques de Nitrógeno Líquido
Microscopio invertido para observación de cultivos celulares
FLU PARA
RHINO HS V
ENTERO RS V
CMV HS V
VZV
ADV ENTERO
RMK
MRC-5
RUBEOLA
Ais lamiento en Cultivos
c elulares
AGMK
hMPV
HS V ADV
VZV
A549
FLU
RS V HS V
HEP-2
LLC-MK2
MDCK
+ Identific ac ión por IF, HA
Dra. G. Carballal, CEMIC 2003
Ej de diferentes líneas celulares para aislamiento viral
Acción citopática: ACP
ACP
Cultivo de celulas de origen epitelial: sin ACP
Diferentes tipos de cultivo
• En tubos, botellas o policubetas: monocapas
celulares: detección de ACP mas
identificación por IF u otros métodos
• En Shell vial ( cultivo rápido): resultado en
24- 48 hrs: detección de antígenos virales
tempranos antes de la aparición de ACP.
• Ej: CMV
CITOMEGALOVIRUS:
AISLAMIENTO
Cultivo de fibroblastos de prepucio humano
CULTIVO CONVENCIONAL: semanas
“SHELL VIAL” O CULTIVO RÁPIDO: 1-2 dias
Ventajas del cultivo celular
• Es el gold standard del diagnóstico para virus
cultivables
• Permite obtener la cepa viral para tipificación,
estudios genómicos o de resistencia a antivirales
• Permite el diagnóstico de certeza de infección
actual :
• Ej: aislar CMV de sangre o tejidos (no de orina
o fauces); aislar virus respiratorios, etc.
DESVENTAJAS DEL CULTIVO
•Rápida Inactivación térmica de algunos virus:
CMV, RSV: se requiere en envío inmediato de
la muestra REFRIGERADA
•Alto costo, lento (CMV puede tardar hasta 1
mes en crecer....)
•Complejo
•Requiere:
-Infraestructura para cultivos celulares
-Bioseguridad (diferentes niveles dependiendo
de la patogenicidad del virus)
-Personal altamente entrenado
METODOS DIRECTOS – 5
Métodos Rápidos: DETECCIÓN DE
ANTIGENOS
• Muestras : hisopados, aspirados, BAL,
biopsias, orina, etc
• Inmunofluorescencia directa o indirecta: debe
contener células infectadas
• Enzimoinmunoensayos ( ELISAs) de diferente
configuración: directos, sandwich, manuales,
automatizados.
• Inmunomarcación en células o tejidos
• En suero: Hbs Ag, HIV (ELISA, MEIA)
Ventajas de los métodos de
detección de antígenos
Rapido: horas
La IF permite observar la calidad de la
muestra
Transporte menos estricto
Escaso costo
Equipos automatizados para ELISA
Ejemplos de Inmunofluorescencia
directa (IF) o indirecta (IFI)
Virus Sincicial Respiratorio en Aspirado nasofaríngeo de niño
con bronquiolitis
La IF permite apreciar la celularidad de la muestra
Una ventaja de la IF
Inmunofluorescencia indirecta mostrando núcleos pp65
positivos
Dra Carballal, CEMIC
Antigenemia pp65 para diagnóstico de CMV
Antigenemia pp 65: IF mostrando núcleos pp65
positivos en PMN de sangre periferica
Celulas BHK persistentemente infectadas con virus JUNIN:
IFI para Detección de anticuerpos, CEMIC, 1990
Lesiones de Herpes Zoster
• Dolor leve (prurito o pinchazo)
hasta severo.
• En 5 días, edema y enrojecimiento
y grupos de vesículas claras que
evolucionan a ampollas.
• La erupción de zoster es unilateral
y nunca cruza la línea media.
• Lesiones similares a varicela, pero
a diferencia de estas evolucionan
menos rápidamente y aparecen en
grupos en vez de vesículas aisladas.
Pueden estar distruibuidas en
parches o ser tan numerosas de
formar bandas continuas.
Obtención de la muestra correcta
•
•
•
•
Elegir vesículas nuevas
No costrosas o supuradas
Romper la vesícula con hisopo
Raspar la base de la vesícula con el hisopo
para arrastrar células
Interpretación de la IF
• El antígeno debe ser intracelular y estar en la
célula correcta
• Debe presentar la ubicación correcta de
acuerdo al virus: intracitoplasmático o
intranuclear
• Debe ser color verde manzana
• La morfología del antígeno debe ser la correcta
para cada virus en particular
• Debe existir al menos 2 células positivas en la
muestra
El uso de controles positivos con células infectadas
METODOS DIRECTOS – 6
Métodos Rápidos: DETECCIÓN DE
ANTIGENOS por Inmunocromatografía
Rápidos
Menor Sensibilidad
No evaluan
calidad de
muestra
Para períodos
Epidemicos
solamente
Métodos rápidos: inmunocromatografía
Met rápidos: Inmunocromatografía
•
•
•
•
•
•
•
Ej: Influenza, RSV
Ventajas: rápido, minutos
Puede usarse en consultorios
Desventajas:
No evalúa la calidad de la muestra
Baja sensibilidad, en períodos interepidemicos
Caro
Métodos Directos- 7
Moleculares
Detección de genes conservados del
genoma Viral:
ADN, ARN o ARN mensajero
Muestras para métodos moleculares
• Cuales : Todas
• Sangre, suero, LCR, BAL, hisopados,
biopsias, orina, semen, etc, etc.
• Algunas muestras pueden contener
inhibidores de la PCR !
• CUANDO: Cuando el virus está presente
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
Si el virus no está presente en la
muestra……
• El resultado será falsamente
negativo !
MÉTODOS MOLECULARES: PCR para ADENOVIRUS
Plasma
Suero
G.R. S.E. MO
Controles
Pos Neg
En plasma, suero, glóbulos rojos, sangre entera y médula osea se observa una banda de 139 pb.
correspondiente a una porción del gen del hexón. Izq: controles de peso molecular.
M Echavarria et al J. Clin. Microbiol. 1998
Ej: PCR directa para virus a ADN
Ventajas y desventajas de métodos
moleculares
• Alta sensibilidad y especificidad
• Estan reemplazando al cultivo para los virus
cultivables !
• Rapidez ?
• Desventajas:
• Necesidad de controles de calidad estrictos
• Riesgo de contaminación
• Personal entrenado
• Equipamiento y costo
Métodos moleculares
Cualitativos
• Para ADN
• PCR directas
• PCR anidadas (nested)
• PCR multiples (Multiplex PCR)
• Detección de ARN mensajero
• Para ARN: RT-PCR
Cuantitativas
• Carga Viral; PCR en Tiempo Real
• Otros métodos
• Secuenciación; Estudios de filogenia: árboles
PCR en tiempo real
•
•
•
•
Ventajas:
Amplifica y detecta al mismo tiempo
Mas rápido que la PCR común
Es cuantitativa !
• Desventajas:
• Las mismas que la PCR común
• Necesidad de controles de calidad
PCR EN TIEMPO REAL
Figura 8 METODOS MOLECULARES PARA DIAGNOSTICO DE VIRUS
RESPIRATORIOS
B: PCR EN TIEMPO REAL PARA DETECTIÓN DE DIFERENTES GENOTIPOS
DE ADENOVIRUS
Detección de diferentes serotipos de Adenovirus por PCR en Tiempo Real. El gráfico con
distintas curvas muestra el aumento de fluorescencia -en distintos colores- en función del Ct
(ciclo que atraviesa el o valor de corte – threshold- ). A menor Ct, mayor concentración del
genoma viral en la muestra. En el control negativo (agua) no se observa curva. Las diferentes
curvas representan la amplificación de los distintos serotipos de adenovirus . Tomado de
Marcela Echavarria, Laboratorio de Virología Clínica, CEMIC:
A generic multiplex Real Time PCR for detection of human adenoviruses: Validation with
various adenovirus serotypes, Clinical Virology Symposium, 2005
105
104
F
103
102
10
5
10
15
20
Nº de ciclos
PCR en Tiempo Real
25
30
35
Los métodos moleculares se veran
en detalle en el Seminario de la
semana próxima
Muestras: obtención y envío
•
•
•
•
Muestra adecuada en el momento adecuado!
Muchas muestras son irrepetibles !
Cual y cuando es “ adecuado “ ??
Envio en condiciones de Bioseguridad y bien
rotulada
• Orden con datos del paciente
• Comunicación con el laboratorio !
• Interpretación del resultado
MAYOR COMUNICACIÓN
ENTRE MÉDICO Y
LABORATORIO DE VIROLOGÍA
!!!!!
Cuando ?
Como obtener?
Cómo enviar la muestra ?
Descansemos……..