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Development of a continuous bovine corneal cell culture and its utilization in the
diagnosis of IBR.
Desarrollo de un cultivo continuo de células de cornea bovina y su utilización en el
diagnóstico de IBR
G.C1. Ramírez, J.J Chaparro2, V.J. Vera*.1
1
Posgrado en Salud y Producción Animal. Facultad de Medicina Veterinaria y de
Zootecnia. Universidad Nacional de Colombia. Ciudad Universitaria. Bogotá.
Colombia. 2 Universidad de Antioquia. Medellín, Colombia
Abstract
A continuous bovine corneal cell culture was established and tested for the isolation
and seroneutralization test for the IBR virus. Explants of corneal tissue were grown in
MEM with 15% FBS. A confluent monolayer was developed 20 days after seeding.
The primary culture was subcultured every three days and it supported more than 100
culture passages and criopreservation at –196oC. Isolation and titration of HVB-1
field strain and the Iowa reference strain were conducted using cornea and the
reference MDBK cell line for the same purpose. Results showed that corneal cell
culture developed here is an excellent substract for growing IBR virus with evidence
of citophatic effect 1 hour before that in MDBK. The titration results were comparable
for the two types of culture.
Introducción
La capa epitelial que recubre el ojo constituye una barrera protectiva especializada. En
particular el epitelio corneal protege las estructuras internas a la vez que provee un medio
transparente. En muchas especies, incluyendo la bovina, esta barrera es susceptible al
ataque de microorganismos patogénicos, por lo cual para estudiar los fenómenos
asociados con éstas infecciones es muy conveniente contar con cultivos de cornea y
células de epitelio conjuntival bovino. Teniendo en cuenta que los virus son parásitos
intracelulares obligados, y por tanto requieren células para su multiplicación tanto in
vivo como in vitro, ha hecho que el desarrollo de la virología marche paralelo al avance
en la ciencia de los cultivos celulares. Por su estructura y características, el tejido corneal
ofrece un excelente substrato para la replicación de agentes virales.
Objetivo
Establecer un cultivo celular de cornea bovina y evaluar su comportamiento y
utilización para el aislamiento, cuantificación
y empleo en prueba de
seroneutralización para el virus de la Rinotraqueitis Infecciosa Bovina.
Materiales y métodos
Para obtener el cultivo de córnea bovina se extrajo, bajo condiciones de asepsia, el
globo ocular de un feto macho de 8 meses de gestación, se realizó un corte transversal
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Available at www.sciquest.org.nz
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y se obtuvo el explante de cornea. Dicho explante fue sembrado en una caja de cultivo
celular (Falcon), en medio MEM (SIGMAm-0268), suplementado con 15% de
SFB (HYCLONESH30070.03), glutamina (SIGMAG-5763) al 2% y solución de
antibiótico-antimicótico (SIGMA A-4668). Una vez obtenida una monocapa
confluente de células, al cabo de 20 días, se realizaron subcultivos cada tercer día.,
evaluando el comportamiento del cultivo a diferentes concentraciones de SFB, frente
a tres formulaciones de medio de cultivo (MEM, SIGMAM-0268; RPMI-1640,
GIBCO y DMEM, SIGMA D-6780). Se realizó la infección del cultivo de células
de córnea fetal bovina y de la línea celular MDBK, con dos cepas de campo del virus
de IBR y con la cepa de referencia IOWA; igualmente se llevó a cabo titulación viral
para los mismos agentes en los dos substratos celulares y se evaluó así mismo el
comportamiento en la prueba de seroneutralización para el virus de IBR.
Resultados y Discusión
Un resultado muy importante de éste trabajo de investigación fue el establecimiento de
un cultivo continuo de células de córnea fetal bovina, libre del virus de la DVB, el cual
mostró un excelente comportamiento para su crecimiento bajo condiciones in vitro y su
conservación a temperatura de nitrógeno líquido. Se observó que para el cultivo de
córnea fetal bovina, la suplementación con 5% de SFB permite obtener una confluencia
del 90% a las 24 horas y una suplementación con el 3% de SFB es apropiada para
procedimientos de titulación y seroneutralización. Mientras que las células de córnea
fetal bovina no se adaptaron al medio de cultivo DMEM, su comportamiento fue muy
satisfactorio cuando se empleó medio MEM. Con respecto al virus de IBR, el cultivo de
células de córnea fetal bovina permitió una buena replicación del mismo, mostrando
incluso evidencia del efecto citopático característico del virus de IBR una hora antes que
lo observado en la línea MDBK; los resultados en cuanto a titulación y
seroneutralización viral fueron comparables para los dos substratos celulares empleados.
Es de resaltar el hecho de que éste cultivo brinda una alternativa excelente para el estudio
y diagnóstico de IBR, con la ventaja de ser una línea celular joven, proveniente de un
tejido con características particulares dada su ubicación anatómica, condiciones de
irrigación y capacidad de reparación, reduciendo el riesgo de contaminación por agentes
adventicios, el cual representa un problema grande en la utilización de los cultivos
celulares en general.
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