Download The ultrastructural analysis of tissue morphological alterations

ESQUIZOFRENIA Y PLAQUETAS. ESTUDIO TRANSCULTURAL.
Dr. Segundo Mesa Castillo. Hospital Psiquiátrico de la Habana, Ciudad Habana,
Cuba.
[email protected]
Dra. Lucía González, Laboratorio de Microscopía Electrónica, Instituto de
Nefrología, Ciudad Habana, Cuba.
Dr. Carlos Domínguez, Laboratorio de Microscopía Electrónica, Dpto. de Patología,
Hospital “Hermanos Ameijeiras”, Ciudad Habana, Cuba.
Dr. Fabio Rivas, Jefe del Dpto. de Psiquiatría del Hospital Civil, Málaga, Andalucía,
España.
RESUMEN:
Introducción. El análisis ultraestructural de las alteraciones morfológicas tisulares a
través de las técnicas de microscopía electrónica constituyen un instrumento de
indudable valor en la profundización del estudio patogénico de las enfermedades.
Especialmente en el campo de la patología neuropsiquiátrica ha contribuido de modo
importante a desentrañar los mecanismos complejos en la génesis de los diferentes
procesos patológicos, inflamatorios, inmunológicos, neoplásicos y en la definición de
entidades particulares.
A pesar de que la esquizofrenia es una enfermedad orgánica del cerebro en la que
estructuras del sistema límbico están involucradas hay pocos estudios de esta región
del cerebro con técnicas de microscopía electrónica. Esto se ha debido en parte a las
dificultades en obtener material fresco del cerebro con este propósito. Pacientes y
métodos. En 1977 comenzamos un proyecto de microscopía electrónica estudiando dos
estructuras del sistema límbico (núcleo amigdalino e hipocampo) y la corteza auditiva
del hemisferio cerebral izquierdo de pacientes esquizofrénicos jóvenes fallecidos n=16
y controles n=10 observando tres alteraciones fundamentales: cuerpos nucleares,
proliferación de membranas celulares y partículas con morfología viral las cuales
reaccionan con anticuerpos para el virus herpes simples hominis tipo I (REV
NEUROL 2001; 33: 619-23). Estos hallazgos se consideraron la primera evidencia
directa de virus en el sistema nervioso central en la esquizofrenia ( Yolken RH, Torrey
EF. Viruses, Schizophrenia and Bipolar Disorder. Clin Microb Review 1955; 1: 13145).
En los últimos once años hemos realizado estudios de muestras de sangre de pacientes
esquizofrénicos jóvenes observando alteraciones en las plaquetas. Algunas de estas
alteraciones son similares a las observadas en el sistema nervioso central las que son
compatibles con: a) la hipótesis vírica y b) el virus herpes simplex hominis tipo I al
realizar técnicas inmunoelectromicroscópicas. Resultados y conclusión. Los resultados
así obtenidos pueden constituir un marcador biológico de la esquizofrenia y un
elemento a favor de la posible etiología vírica de la enfermedad. Las alteraciones en la
morfología de las plaquetas pudieran ser el origen de alteraciones funcionales que
actuaran sobre el sistema nervioso central. En el presente trabajo destacamos el
posible rol de tales alteraciones morfológicas en la fisiopatología de la enfermedad en
poblaciones de pacientes esquizofrénicos cubanos y españoles y en controles de ambas
nacionalidades.
Palabras claves: esquizofrenia, plaquetas, virus herpes, microscopía electrónica,
líquido céfalo-raquídeo, estudio transcultural.
SCHIZOPHRENIA AND
MICROSCOPE STUDIES.
PLATELETS.
TRANSCULTURAL
ELECTRON
SUMMARY:
Introduction. The ultrastructural analysis of tissue morphological alterations through
electron microscopy techniques constitutes an instrument of undoubted value to
deepen in the pathogenic studies of diseases. Especially in the field of neuropsychiatry
pathology it has been an important element to figure out the complex mechanisms in
the genesis of the different pathological, inflammatory, immunologic and neoplastic
processes, and in the definition of particular entities.
In spite of schizophrenia is an organic brain disease where limbic structures are
involved there are few studies of these brain regions in dead schizophrenic patients
using electron microscope techniques. This has been due partly to the difficulties in
obtaining fresh brain material with this purpose. Patients and methods. In 1977 we
started an electron microscope project studying two limbic structures (amygdaline
nucleus and hippocampus) and auditory cortex of the left cerebral hemisphere of
young dead schizophrenic patients n=16 and controls n=10 observing three main
alterations: nuclear bodies, membrane cell proliferation and particles with viral
morphology which react to herpes simplex hominis type I antibody(REV NEUROL 2001; 33:
619-23). These findings were considered the first direct evidence of virus in the central
nervous system in schizophrenia (Yolken RH, Torrey EF. Viruses, Schizophrenia and
Bipolar Disorder. Clin Microb Review 1995; 1: 13145). In the last eleven years we have
carried out studies of samples of blood of young patients observing platelets
alterations. Some of these alterations are similar to those observed in the central
nervous system those that are compatible with: a) the viral hypothesis and b) the virus
herpes simplex hominis type I when immunoelectron microscopy techniques were
done. Results and conclusion. The results obtained can constitute a biological marker
for schizophrenia and an element favouring the possible viral etiology of the illness.
The alterations in the morphology of platelets could be the origin of functional
alterations that act on the central nervous system. The present work highlights the
possible role of the morphological alterations found in the fisiopathology of this
disease in a Cuban and Spanish populations of schizophrenic patients and in controls
of both nationalities.
Key words: schizophrenia, platelets, herpes virus, electron microscopy, cerebrospinal
fluid, transcultural study
INTRODUCCIÓN
La esquizofrenia constituye uno de los principales problemas de la salud mental en el
mundo por su impacto humano, económico y social. El pronóstico de la enfermedad
sólo se modifica en sentido favorable por un tratamiento temprano en la fase
prodrómica antes de que aparezcan los síntomas psicóticos por lo que la falta de una
prueba biológica que permita discriminar un paciente de otra patología psiquiátrica
no permite la implantación de un tratamiento temprano. Una prueba biológica sería
no sólo útil para el diagnóstico sino que pudiera aplicarse para la investigación de la
enfermedad en cualquier campo que incluye entre otros, los ensayos terapéuticos,
estudios epidemiológicos y en cualquier investigación donde sea necesario diferenciar
un paciente de un control.
En nuestros estudios en Cuba sobre líquido céfalo-raquídeo (LCR) y sangre de
pacientes esquizofrénicos usando técnicas de microscopía electrónica observamos una
reacción de precipitación cuando se ponían en contacto el plasma y el LCR del propio
paciente (1) Fig. 1. Esta reacción apareció en un 45% de los pacientes estudiados
(n=100) y consistió en la aparición de un coágulo de color ámbar, que permanecía
estable durante varias semanas a 4º C. Al examen del coagulo con el microscopio
óptico en extensiones de lámina, se observó, que éste estaba formado por agregados
plaquetarios. Con técnicas de microscopia electrónica de tinción negativa, se confirmó
esta observación más la presencia de filamentos con la apariencia de filamentos de
fibrina que se entrelazaban entre las plaquetas. Este hecho nos hizo considerar el
estudio del agregado plaquetario usando técnicas de microscopía electrónica de
transmisión. En el presente trabajo se exponen los resultados obtenidos usando estas
técnicas en un estudio transcultural entre poblaciones de esquizofrénicos y controles
de Cuba y España.
MATERIAL Y METODO:
Muestras de sangre venosa (3ml) de un total de 70 pacientes esquizofrénicos (50
cubanos y 20 españoles) con diferentes formas clínicas, criterio diagnóstico del DSMIV y 100 controles (50 cubanos y 50 españoles), se obtuvieron mediante
consentimiento informado, conforme a los criterios bioéticos para la investigación y
con la aprobación del Comité de Ética de cada institución. Las muestras de pacientes
y controles cubanos procedían de la ciudad de la Habana. La de pacientes y controles
españoles de la ciudad de Málaga, Andalucía. Todas las muestras se trataron con
anticoagulante tipo EDTA potásico. Las edades de todos los pacientes y controles
estuvieron comprendidas entre 15 y 35 años. Ambos sexos se representaron en forma
proporcional. A cada paciente y control se le realizó un cuestionario para obtener
datos relacionados con nombre, edad, fecha de nacimiento, antecedentes familiares de
psicosis; en el caso de los pacientes: síntomas psiquiátricos presentes, tiempo de
evolución de la enfermedad, edad, sexo, raza, tratamiento recibido, así como
frecuencia y duración de las crisis. Las muestras de sangre se centrifugaron a 1.000
rev/min durante 10 minutos; obtenido el plasma –plasma rico en plaquetas–, se
centrifugó posteriormente a 3.000 rev/min durante 10 minutos. Posteriormente, se
estudiaron mediante las siguientes técnicas ultramicroscópicas:
fijación en
glutaraldehído al 3% en buffer fosfato (Millonig) 0,15M pH 7,4, durante una hora a 4
ºC y lavado con buffer, posteriormente. Sección de las muestras y lavado durante la
noche en buffer a 4 ºC. Posteriormente, fijación con tetróxido de osmio al 2% en
buffer fosfato durante una hora a 4 ºC y lavado dos veces con solución buffer por cinco
minutos cada vez a la misma temperatura. La deshidratación se hizo en alcohol al 50 y
70%, durante cinco minutos en cada fase, a la misma temperatura, y en alcohol
absoluto en tres ocasiones, 10 minutos en cada ocasión, a temperatura ambiente. La
inclusión se realizó en araldita.
RESULTADOS
En las plaquetas de pacientes esquizofrénicos cubanos y españoles se observaron
alteraciones morfológicas consistentes en:
a) Aumento del tamaño, en ocasiones hasta tres veces el tamaño observado en las
plaquetas de los controles.
b) Alteraciones en la forma, adquiriendo formas bizarras con aumento en la
prolongación de las filopodias y deformidad de las mismas con aumento del
diámetro transversal.
c) Vacuolización con formación de grandes vacuolas dentro y fuera de las
plaquetas Fig. 2.
d) Presencia de partículas esféricas y hexagonales dentro de las grandes vacuolas
así como restos de membranas.
e) Aumento de los microtúbulos con formación de haces de los mismos.
f) Aumento en la concentración de glucógeno ocupando gran parte de las
plaquetas y dentro de las grandes vacuolas Fig. 3 (a y b).
Estos resultados permitieron establecer una escala de evaluación citopatológica de
tipo diagnóstico con valores de 0 a 28 (Tabla). Las puntuaciones por encima de 11
correspondieron a puntuaciones patológicas. Un análisis computarizado a doble
ciego de solo dos de los parámetros a evaluar de la escala, permitió distinguir entre
controles y pacientes en un 100 por ciento de los casos y controles evaluados (3,4).
DISCUSIÓN
A pesar del impacto humano, social y económico de la esquizofrenia y al hecho de
considerarse una enfermedad de etiología orgánica en la que las plaquetas pudieran
jugar un rol importante, son pocos los estudios de las mismas con técnicas de
microscopía electrónica. Solo aparecen tres publicaciones en este sentido en la
literatura médica. La primera de ellas (5) corresponde aparentemente a un examen
directo y reporta alteraciones en la forma con presencia de filopodias anormales. El
segundo trabajo (6) se relaciona con alteraciones en el tamaño y aumento de la
cantidad de gránulos densos. En nuestro trabajo, el tercero, (7)hacemos referencia,
además de las alteraciones en la forma y el tamaño, a cinco aspectos no relacionados
en estudios anteriores y a estudios inmuno-electromicroscópicos en los que se observa
una reacción positiva para antígeno del virus herpes simplex hominis tipo I en las
propias plaquetas, así como en sus extensiones o filopodias. ¿Qué significación pueden
tener los resultados obtenidos en el estudio transcultural? ¿Qué significación pueden
tener estos resultados en cuanto a la fisiopatología de la enfermedad? La posibilidad
de que la esquizofrenia no dependa de una lesión primaria del sistema nervioso, debe
tenerse en cuenta. Múltiples patologías neurológicas o neuropsiquiátricas se
relacionan con afectación de sistemas fuera del sistema nervioso central. Por citar un
ejemplo, los comas, muchos de ellos dependientes de alteraciones metabólicas
producidas por déficit o exceso de sustancias químicas, por factores tóxicos de distinta
naturaleza o aun por infecciones localizadas fuera de este sistema. Por lo tanto
abordar la esquizofrenia como una patología primaria del sistema nervioso, carece a
nuestro entender de evidencias suficientes para así considerarla. La atrofia del
cerebro con dilatación del sistema ventricular reportada en la esquizofrenia pudiera
estar relacionada con mecanismos de autoinmunidad como la esclerosis múltiple o la
panencefalitis esclerosante subaguda, solo por citar dos entidades donde este
mecanismo es responsable en gran medida del daño neuronal. Con relación a la
esquizofrenia otro tipo de mecanismo actuando desde la periferia pudiera condicionar
alteraciones a nivel del sistema nervioso central. Las alteraciones estructurales de las
plaquetas pudieran ser responsables de alteraciones funcionales que actuaran sobre el
sistema nervioso central. Hay trabajos que ponen en evidencia alteraciones en las
mismas que pudieran influir en la fisiopatología de esta enfermedad neuropsiquiátrica
como es la presencia de autoanticuerpos plaquetarios que reaccionan en forma
cruzada con antígenos cerebrales(8-10). Entre las varias hipótesis que se tienen en
cuenta para la etiopatogenia de la esquizofrenia el anormal funcionamiento del
sistema serotonergico ha ganado marcado interés recientemente. Un aumento de la
serotonina plaquetaria ha sido reportado en la esquizofrenia (11-30). Este
neurotransmisor junto con la dopamina juegan un rol importante en la conducta
psicosocial del ser humano. Su disbalance en la esquizofrenia parece ser responsable
en gran medida de la fisiopatología de la enfermedad así como de su sintomatología
clínica (31-34). La terapia biológica en la actualidad va dirigida precisamente a
corregir este disbalance tratando de reducir el exceso de dopamina así como el de
serotonina
en
neuronas
del
sistema-limbico.
En distintos trabajos se reporta un incremento del máximo numero de ligandos
B(max) para los receptores plaquetarios de serotonina tanto en pacientes libres de
tratamiento como en los que reciben tratamiento con neurolépticos con tendencia a la
normalización bajo el efecto del mismo (29,30). Un aumento de la agregación
plaquetaria también observado por nosotros puede estar relacionado con este
incremento de la serotonina (35-37).
Los estudios morfométricos han demostrado atrofia de determinadas áreas del
sistema nervioso en pacientes esquizofrénicos especialmente del núcleo amigdalino y el
hipocampo. Factores neurotróficos actuando desde la periferia pudieran ser
responsables de la atrofia de estas áreas del sistema límbico. El factor neurotrófico
derivado del cerebro (BDNF) por ejemplo se ha relacionado con la supervivencia,
crecimiento y mantenimiento del cerebro y de los nervios periféricos (38). Se reporta
la presencia de este factor en las plaquetas y su liberación esta condicionada por
estímulos agonistas. La concentración de BDNF es baja en el plasma pobre en
plaquetas y estímulos específicos son capaces de liberarlo rápidamente de las mismas.
Existen niveles de concentración de BDNF aproximadamente de 200 veces superiores
en el suero en relación con el plasma. Experimentos usando diferentes
centrifugaciones sugieren que el origen de este incremento se debe a una liberación de
este factor de las plaquetas(39). Las plaquetas parecen ser responsables por lo tanto
de su captación, almacenamiento y liberación. Por otra parte hay una significativa
correlación entre el BDNF y la serotonina. La degranulación de las plaquetas da
lugar a la liberación de BDNF (40) por lo que debe considerarse que alteraciones de
tipo estructural pueden relacionarse con el grado de liberación de estas proteínas en el
plasma. Niveles anormalmente bajos de BDNF son evidentes no solo en el cerebro de
pacientes esquizofrénicos sino también en la sangre periférica de estos pacientes y una
reducción en el suero sugiere un déficit potencial de la liberación de este factor por las
plaquetas(42-46).
El glucógeno y las vías enzimáticas que intervienen en su formación se han
relacionado con funciones tan importantes como son la plasticidad y el
neurodesarrollo. Una disminución en los niveles de la kinasa glucógeno sintetasa–
3beta (GSK-3) ha sido reportada en la corteza prefrontal en la esquizofrenia con una
disminución de su actividad en la corteza frontal 45% menor que en controles
normales (47-52). Una disminución de la GSK-3 se ha observado en los linfocitos de
pacientes esquizofrénicos (53). Este hecho contrasta con la elevación en la
concentración de glucógeno en las plaquetas de los pacientes observada por nosotros.
Una sustracción de la disponibilidad de glucógeno circulante en la sangre de pacientes
esquizofrénicos por las plaquetas puede ser responsable de la reducción del mismo en
otros elementos de la sangre y en el sistema nervioso central e influir en mecanismos
tan importantes como son la plasticidad y el neurodesarrollo.
La posibilidad que autoanticuerpos antiplaquetarios puedan ser responsables de las
alteraciones morfológicas encontradas en las plaquetas de pacientes esquizofrénicos
debe ser tenida en cuenta. Se ha reportado la presencia de anticuerpos
antiplaquetarios (9,10) en estos pacientes.
La alteración en las membranas de las plaquetas es un fenómeno reportado en la
literatura utilizando diversas técnicas distintas a las utilizadas por nosotros.
Diferentes estudios han mostrado un incremento en el metabolismo de los fosfolípidos
de membrana tanto en el cerebro como en células de la sangre de pacientes
esquizofrénicos (54-60). En los estudios de fosfolípidos de las membranas plaquetarias
se observa una destrucción de los mismos especialmente durante el periodo crítico de
la enfermedad, observación que coincide con las observaciones obtenidos por nosotros
con técnicas de microscopia electrónica (7).
La observación de partículas esféricas y de forma hexagonal especialmente dentro de
las vacuolas y su conexión con las membranas celulares semejan las alteraciones
encontradas por nosotros en los estudios post-mortem de muestras de cerebro de
pacientes esquizofrénicos jóvenes, algunos de ellos en etapa crítica de la enfermedad
(61). Hemos observado en membranas y partículas una reacción positiva cuando
usamos anticuerpos para el herpes simplex hominis tipo I (Fig 4). Estudios recientes
demostraron una relación de este virus con la esquizofrenia al observarse un aumento
del título de anticuerpos contra este virus en la sangre de pacientes esquizofrénicos
con trastornos cognitivos (62). Una interacción virus y plaquetas pueden jugar un rol
importante en la fisiopatología de la enfermedad y debe ser motivo de estudios
posteriores ya que las alteraciones morfológicas pueden dar lugar a alteraciones
funcionales que actuaran sobre el sistema nervioso central (63)(Fig 5).
De los resultados expuestos en el presente trabajo la posibilidad de utilizar las
alteraciones morfológicas observadas en las plaquetas de pacientes esquizofrénicos
como una marcador periférico de la enfermedad debe tenerse en cuenta así como la de
ampliar los estudios inmuno-electromicroscópicos con el objetivo de esclarecer la
posible relación entre el virus herpes simplex hominis tipo I, las plaquetas y la
esquizofrenia.
Agradecimientos: agradecemos a los médicos residentes, especialistas y personal
paramédico del Servicio de Psiquiatría del Hospital Civil de Málaga su cooperación
así como a los Centros de Salud de esa ciudad. Nuestro agradecimiento a la Fundación
Hospital “Carlos Haya” por parte del financiamiento de esta investigación. A
Confederaciones Obreras a través del Sr. Manuel García de CCOO de Málaga, por la
donación de parte de los reactivos utilizados en esta investigación.
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