Download Clase 16 AGBT 2016 Las plantas como biorreactores

Agrobiotecnología
Curso 2016
Las plantas como biorreactores
Dra. Alicia M. Zelada
Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
Sumario
Las plantas como biorreactores
- Sistemas de expresión
- Las plantas como sistema alternativo
- Ventajas
- Costos comparativos entre distintos sistemas
Elementos a considerar en una estrategia
de expresión
- Nivel de expresión
- Sistemas de expresión integrativos
y no integrativos
- Optimización de costos de purificación
Aplicaciones
Agrobiotecnología
Las plantas como
biorreactores
- Expresión de antígenos para la producción de vacunas
- Producción de anticuerpos
- Producción de proteínas de interés farmacológico
- Otras aplicaciones
Referencias
1
Las plantas como biorreactores
Agrobiotecnología
Las plantas como
biorreactores
PROCARIOTA
Sistemas de expresión de proteínas recombinantes
Bacterias: E. coli
Plataformas
establecidas
Levaduras: Saccharomyces - Metilotróficas
EUCARIOTAS
Células animales
Células de insectos
Plataformas
emergentes
Animales transgénicos
Plantas
2
Limitaciones de las plataformas de producción en
Bacterias, Levaduras y Células animales
El plegamiento de proteínas de origen eucariótico
sintetizadas en bacterias puede ser incorrecto
Los costos para aumentar la escala de producción
son altos en los tres casos
Requieren de personal técnico especializado
Pueden causar grandes pérdidas económicas por
contaminación en la línea de producción
Riesgo biológico: presencia de contaminantes en
el producto final ENDOTOXINAS / PRIONES VIRUS
Algunas ventajas de la utilización de las plantas como
biorreactores
Permiten una alta producción de biomasa
El aumento en la escala de la producción es
sencillo y requiere bajos costos de inversión
No requieren de personal técnico especializado
No implican riesgos de contaminación con
patógenos animales o toxinas microbianas
3
Algunas ventajas de la utilización de las plantas como
biorreactores
Los mecanismos de síntesis y secreción de
proteínas y las modificaciones posttraduccionales son las células eucariotas
Permiten el almacenamiento estable de la
proteína recombinante en semillas y tubérculos
Gozan de una mayor aceptación pública respecto de la
manipulación de animales.
Los costos de producción de proteínas recombinantes en
plantas son potencialmente menores que en otros sistemas
%
Tomado de: Daniell et. al. Trends in Plant Sci., 2001.
Estimación de los costos de producción en función
del nivel de expresión de IgA en distintos sistemas.
4
Elementos a considerar
en una estrategia de expresión
Agrobiotecnología
Las plantas como
biorreactores
Factores a
considerar en el
diseño de una
estrategia de
expresión en
plantas
• La producción competitiva de proteínas
recombinantes en plantas requiere el diseño
de estrategias de expresión que cumplan con
tres premisas fundamentales:
- Obtener altos niveles de expresión.
- Disminuir los costos de purificación.
- Conseguir un producto de características
idénticas al sintetizado en el sistema de
. origen.
5
La expresión de la proteína recombinante puede optimizarse
mediante diversas estrategias
Promotor
5’UTR ar
ss
GEN
KDEL
Terminador transcripcional
Regulación de los niveles de expresión ARNm
• Elección de secuencias promotoras de la transcripción adecuadas
(promotores tejido específicos, inducibles, constitutivos, etc.).
• Utilización de secuencias reguladoras y regiones no traducidas 5´ y 3´ apropiadas.
• Eliminación de secuencias desestabilizantes del ARN mensajero o
incorporación de secuencias que estabilicen el ARNm.
La expresión de la proteína recombinante puede optimizarse
mediante diversas estrategias
Promotor
5’UTR ar
ss
GEN
KDEL
Terminador transcripcional
Regulación de los niveles de expresión de la proteína
• Optimización del uso de codones (“vegetalización” de la secuencia).
• Utilización de secuencias señal para la localización en distintos
espacios subcelulares o extracelulares.
6
Sistemas de expresión en plantas
Sistemas de expresión en plantas
Integrativos y no integrativos
Plantas
transgénicas
nucleares
Plantas
transplantómicas
Integrativos
(cloroplastos)
Expresión estable heredable a
la progenie
No integrativos
Expresión transitoria
Vectores
virales
7
Sistemas de expresión integrativos
Plantas transgénicas nucleares
La estrategia
a elegir debe
considerar
las ventajas y
limitaciones de
cada sistema
de expresión
Sistemas de expresión integrativos
Plantas transgénicas nucleares
• Ventajas
- Expresión estable heredable por la progenie.
- Ausencia de limitaciones importantes en el tamaño
de la secuencia a introducir.
- Modificación postraduccional de proteínas propia de células
eucariotas (glicosilación-fosforilación).
• Limitaciones
- Niveles de expresión relativamente bajos.
- Niveles de expresión afectados por silenciamiento génico
postranscripcional.
8
El nivel de
expresión
depende
de la utilización
adecuada de
las regiones
reguladoras
La acertada elección y combinación de las secuencias
promotoras y reguladoras de la transcripción y de la
traducción puede determinar variaciones importantes
en los niveles de expresión de la proteína recombinante
Contrucciones utilizadas para transformar
plantas de Arabidopsis thaliana
Nivel de expresión
(% de la proteína
total soluble)
Parc
5’UTR ar
ss G4 myc
KDEL
3´arc
10%
Parc
W
ss G4 myc
KDEL
3´arc
5%
Pphas
5’UTR ar
ss G4 myc
KDEL
3´arc
36%
P35S
5’UTR ar
ss G4 myc
KDEL
3´arc
1%
Adaptado de: Geert De Jaeger, Nat. Biotech. 2002.
Agrobiotecnología
Las plantas como
biorreactores
Los costos
de purificación
pueden
reducirse
explotando
características
propias
de las plantas
Parc: promotor de arcelina de Phaseolus vulgaris.
Pphas: promotor de -faseolina de Phaseolus vulgaris.
W: secuencia enhancer traduccional de Tobacco mosaic virus.
ss: secuencia señal de envío a retículo endoplásmico.
KDEL: secuencia de retención en retículo endoplásmico
G4 myc: secuencia que codifica un anticuerpo de simple cadena
• Rizosecreción en cultivos hidropónicos y
secreción en células en cultivo.
• Acumulación en las semillas u otros órganos
de almacenamiento para la co-extracción con
productos convencionales como almidón o
aceites.
• Proteínas de fusión que facilitan su purificaciòn:
oleosinas-liquenasa termoestable
Agrobiotecnología
Las plantas como
•Producción directa en las partes comestibles
de la planta.
biorreactores
9
La rizosecreción
permite reducir
los costos de
purificación
• El gen de interés se fusiona a una secuencia señal de
. transporte al retículo endoplasmático para direccionar
. el producto correspondiente a la vía de secreción.
Sitio de procesado de la señal
secuencia señal
secuencia de interés
Inicio de la traducción
• La proteína recombinante se obtiene por purificación
a partir de la solución hidropónica que circula en torno
a la rizósfera.
Agrobiotecnología
Las plantas como
biorreactores
Tomado de: Finer, J. Nat. Biotech., 1999.
Rizosecresión
de la xilanasa
de Clostridium
thermocellum
en tabaco
transgénico
• La expresión de la xilanasa de Clostridium
thermocellum se utilizó como un
modelo de producción por rizosecreción.
Construcción utilizada para la
transformación de plantas de tabaco
p35SCaMV
secuencia señal
Planta no transformada
xilanasa
Planta transgénica
Halo de
degradación
del sustrato
generado
por la
xilanasa
rizosecretada
Agrobiotecnología
Las plantas como
biorreactores
Tomado de: Borisjuk et al. Nat. Biotech., 1999.
Las plantas de tabaco se cultivaron en medio conteniendo
Remazol Brilliant Blue-xilano como sustrato para la xilanasa.
10
Aumento del rendimiento de rizosecreción por infección
con Agrobacterium rhizogenes
Las fusiones
a oleosinas
permiten
reducir los
costos de
purificación
• La proteína de interés se fusiona a una oleosina,
proteína que normalmente forma parte de los
cuerpos grasos de las semillas.
Oleosina
Gen de interés
Sitio de reconocimiento
para una proteasa
Cuerpos grasos
Agrobiotecnología
Las plantas como
biorreactores
Cuerpos proteicos
Adaptado de: www.sembiosys.com
11
La purificación
a partir de los
cuerpos
grasos es
un proceso
sencillo
Purificación de la proteína recombinante
a partir de los cuerpos grasos
Agrobiotecnología
Las plantas como
biorreactores
La producción de hirudina fusionada a oleosinas en plantas
de Brassica napus permite purificar la proteína activa
HIRUDINA: péptido presente en la saliva de la sanguijuela= actividad anticoagulante
Trypsin like serine protease
Tomado de: Parmenter, et al., Plant Mol. Biol., 1995.
12
Producción de proteínas fusionada a oleosinas en plantas de cártamo
(Carthamus tinctorius)- Tecnología patentada por Sembiosys
Porqué cártamo?
CARTAMO: Oleaginosa altamente productiva cuya semilla puede ser almacenada por largos
periodos
CARTAMO es poco cultivada por lo cual es fácilmente separada de otras producciones de
cártamo
CARTAMO se autopoliniza y no tiene malezas emparentadas
Proteínas en desarrollo
INSULINA
Diabetes
Ensayos clínicos Fase I y
II-2008
APOLIPROTEÍNA A
Enfermedades
cardiovasculares
Ensayos preclínicos en
modelos animales
OLEOSOMAS
Estética
Comercialización
Producción de insulina humana fusionada a oleosinas en
plantas de cártamo (Carthamus tinctorius)
Izquierda: Separación en PAGE-SDS de extractos proteicos totales de
plantas transformadas con la fusión oleosina/insulina y de la fracción de
oleosinas de las mismas plantas. Wt: control no transformados; 4405-4, 15 y 19: distintas fracciones de purificación de muestras de plantas
transformadas. La flecha señala la posición del estándar de insulina.
Abajo: Cambios temporales en los niveles de glucosa en ratones
tratados con placebo salino (cuadrados abiertos), extracto de
plantas no transformadas (círculos llenos), insulina humana
estándar (triángulos y círculos abiertos) e insulina derivada de
plantas que producen fusiones oleosina/insulina (cuadrados llenos).
Arriba: Análisis comparativo por de insulina humana (hIN)
y de insulina fusionada a oleosina (OB-hIN) obtenidas por
separación en cromatografía líquida de alto rendimiento.
13
Humanización
de las
glicoproteínas
recombinantes
• Los patrones de N-glicosilación en plantas difieren
de los presentes en mamíferos.
• Esto puede alterar la inmugenicidad, resistencia a la
degradación proteolítica y actividad biológica de la
proteína expresada, particularmente en anticuerpos.
Asn
a -1,3
NAcGlc
Man
NAcGlc
Asn
Fuc
NAcGlc
NAcGlc
Man
Man
Xyl
Las plantas como
biorreactores
a-1,6
Fuc
Glicanos complejos
en mamíferos
Man
Man
Man
NAcGlc
NAcGlc
NAcGlc
Gal
Gal
Gal
AcNeu
AcNeu
AcNeu
Glicanos complejos
en plantas
Agrobiotecnología
NAcGlc
NAcGlc
• Se están ensayando diversas estrategias para humanizar
las glicoproteínas recombinantes expresadas en plantas:
- Expresión de la (1,4)-galactosiltransferasa humana en plantas
transgénicas.
- Retención de la proteína en el retículo endoplásmatico.
- Inactivación de la a(1,3)-fucosiltransferasa y la (1,2)-xilosiltransferasa
de plantas.
La especie a
utilizar debe
seleccionarse
de acuerdo
con las
necesidades
de producción
de la proteína
a sintetizar
Agrobiotecnología
Las plantas como
biorreactores
Tabaco
Sistema de transformación bien establecido.
Producción de abundante biomasa.
Papa
Disponibilidad de promotores específicos para la expresión en tubérculos.
Procesamiento industrial de los tubérculos bien establecido.
Contenido proteico en tubérculos relativamente bajo.
Tomate
Consumo de los frutos crudos.
Disponibilidad de promotores específicos para la expresión en frutos.
Cultivo en invernaderos a escala industrial bien establecido.
Contenido proteico en frutos relativamente bajo.
Cereales
Tecnología de producción ampliamente establecida.
Almacenamiento estable de la proteína recombinante en las semillas.
Procesamiento industrial de las semillas bien establecido.
Alfalfa
Alto contenido proteico en hojas.
Producción de biomasa abundante.
Lemna
Alta eficiencia de proliferación clonal.
Alta tasa de duplicación de la biomasa.
Rizosecresión muy eficiente.
14
Sistemas de expresión integrativos
Sistema de expresión en Lemna
Planta acuática comestible (Lemnaceae)
• Rápido y flexible
• Alta productividad debido alta tasa de crecimiento y altos niveles de
expresión (35-40% peso seco)
• Bajos costos
• Bioseguridad se realiza en confinamiento y no hay riesgo de
contaminación con patógenos humanos
Sistemas de expresión integrativos
Sistema de expresión en Lemna
• Lemna Gene TM Tecnología de produción basada en Lemna
• Proteínas recombinantes para industria veterinaria y
farmaceutica
• Vacunas recombinantes humanas y animales
•Anticuerpos monoclonales
•Aditivos como enzimas y probióticos
IFN-alpha2b
BLX-301, anti-CD20 non-Hodgkin's B-cell linfoma humanizado
BLX-155, a trombolítico
Los productos puede ser producidos:
Puro: el ingrediente activo puede ser purificado
Seco: las plantas pueden ser deshidratadas y presentadas
como cápsulas, tabletas o polvo
Fresco: puede ser utilizadas directamente para alimentación
15
Sistemas de expresión integrativos
Plantas transplantómicas
La estrategia
a elegir debe
considerar
las ventajas y
limitaciones de
cada sistema
de expresión
Sistemas de expresión integrativos
Plantas transplastómicas (cloroplastos)
• Ventajas
- Niveles de expresión potencialmente altos.
- Expresión estable heredable por la progenie.
- Ausencia de limitaciones importantes en el tamaño
de la secuencia a introducir.
- No hay efectos de posición (transformación por
recombinación homóloga).
- Ausencia de silenciamiento génico.
- Introducción de policistrones.
- Transferencia horizontal del transgén escasa o nula.
- Formación de puentes disulfuro y menor complejidad de
proteasas
• Limitaciones
- No existen mecanismos de glicosilación.
16
Sistemas de expresión integrativos
Plantas transplastómicas (cloroplastos)
Proteínas terapeuticas y antibióticos producidas en cloroplastos 2008-2011
Sistemas de expresión integrativos
Plantas transplastómicas (cloroplastos)
Antígenos producidos en cloroplastos 2008-2011
17
Sistemas de expresión integrativos
Plantas transplastómicas (cloroplastos)
Limitación: altos costos de purificación de las proteínas a partir de
extractos de plantas
Sistemas de expresión no integrativos
Vectores virales
18
Sistemas de expresión no integrativos
Vectores virales
Ventajas
- Niveles de expresión potencialmente altos
- No se integran al genoma- No tienen efecto de posicionamiento
- Corto tiempo de desarrollo y producción
- Permite el direccionamiento de proteínas a compartimiento
subcelulares o al espacio apoplástico.
- Permite la modificación postraduccional de proteínas
Limitaciones
- Limitaciones en el tamaño de la secuencia introducida
- Inestabilidad genética de la secuencia introducida.
- Silenciamiento génico
Sistemas de expresión no integrativos
Vectores virales
PVX
1. Infección inicial
2. Movilización viral célula a célula
3. Movilización sistémica
TMV
19
Potexvirus. Potato virus X
Vectores virales derivados de virus a ARN. Promotor T7
Expresión transitoria
20
Vectores virales derivados de virus a ARN. Promotor para
expresión en plantas
Genoma viral
ARN
Obtención del ADNc del
genoma viral completo
ADNc del
genoma viral
ADNc
Amplicón viral
35SCaMV
Clonado del ADNc en un
vector binario para expresión
en plantas. Introducción de
un sitio de clonado múltiple
ADNc
t-nos
SCM
Clonado del gen de interés
Amplicón viral
recombinante
35SCaMV
Gen X
t-nos
Bombardeo del ADN infectivo
Agroinfiltración
Agrospray
Expresión transitoria
Los vectores y
los amplicones
virales
amplifican la
expresión de
los genes
foráneos
Esquema
de la expresión
de un gen foráneo
a partir de un
vector y de un
amplicón viral
de un virus
a ARN en
comparación
con la expresión
de un gen foráneo
por expresión
nuclear.
21
Se pueden utilizar diferentes estrategias para expresar
genes foráneos en vectores virales
Virus representativo
Reemplazo génico
Inserción génica
Presentación de epitopes
A
*
B
Complementación
A: Fusión traduccional de una pequeña secuencia dentro del gen de la proteína de la cápside.
B: Translectura traduccional de un codón de terminación ámbar (*) en el extremo 3´
Genes virales
Reemplazo génico
Genes foráneos
Bromovirus
Caulimovirus
Complementación
Furovirus
Alfamovirus
Geminivirus
Caulimovirus
Inserción génica
Hordeivirus
Dianthovirus
Caulimovirus
Potexvirus
Geminivirus
Geminivirus
Presentación de epitopes
Tobamovirus
Potexvirus
Potexvirus
Comovirus
Tobravirus
Tobamovirus
Potyvirus
Tobamovirus
Tombusvirus
Tombusvirus
Tobamovirus
Tombusvirus
Vectores virales de 1era y 2da generación
Vectores de 1era generación o ‘’Virus completo”
Infecta sistémicamente
Agroinfiltración o Agrospray
Bioseguridad baja
22
Agroinfiltración por jeringa
Rápida: la proteína recombinante puede
obtenerse en aproximadamente una
semana.
Simple: sólo se requiere equipamiento
básico.
Flexible: puede utilizarse para producir
proteínas de membrana, enzimas o virus
quiméricos.
Laborioso: no compatible con una
producción a gran escala
Vectores virales de 1era y 2da generación
Vectores de 2da generación o “Virus desarmado”
No infectan sistémicamente
Método de inoculación: Magnifection
Permite expresar transgenes de mayor tamaño
Mayor estabilidad de los transgenes
Bioseguridad alta
23
Magnifection. Agroinfiltración por vacío.
Rápida
6-10 días.
Eficiente:
1-5 g proteína/kg hoja
Escalable
Complejo Se requiere
equipamiento específico y
standard
Flexible: puede utilizarse
para producir proteínas de
membrana, enzimas o
virus quiméricos.
Companias de base biotecnológica para la producción de
proteínas en plantas
Icon Genetics. Alemania.
Vector TMV 2da generación
Magnifection
24
Companias de base biotecnológica para la producción de
proteínas en plantas
Large Scale Biology Corp. EEUU. 2006
Vector TMV 1era generación
Inoculación mecánica
KBP 2008 Nuevas tecnologías
Companias de base biotecnológica para la producción de
proteínas en plantas
KBP, Kentucky 2012
25
NUCLEAR
CLOROPLASTOS
VECTORES
VIRALES
Bajos niveles de
expresión (0,01-0,1 %
TPS)
Altos niveles de expresión
(1-10%)
Altos niveles de
expresión (1-10%)
Largo
6-24 meses
Mediano
3-12 meses
Corto
1-2 semanas
Si
No
No
Estabilidad de las
secuencias
Alta
Alta
Baja
Plantas en que se
puede expresar
Limitado a la
disponibilidad de
protocolos de
transformación
Muy limitado a la
disponibilidad de protocolos
de transformación
Limitado al rango
de hospedante
Si, PTGS
No
Si, VIGS
Si
No
Si
Media
Alta
Baja
Niveles de
expresión
Tiempo de
evaluación de
construcciones
Efecto
posicionamiento
génico
Silenciamiento
post-transcripcional
Modificaciones
posttransduccionales
Bioseguridad
Expresión de antígenos para la
producción de vacunas
Agrobiotecnología
Las plantas como
biorreactores
26
Las plantas
constituyen
un sistema
alternativo
para la
producción
de vacunas a
subunidad
Vacunas a subunidades:
• Seguras
• Poco inmunogénicas
• Inyección
Ventajas de las vacunas en plantas:
Agrobiotecnología
• Bajo costo de producción.
• Eliminación de la cadena de frío durante el transporte.
• Expresión de múltiples antígenos y adjuvantes en un
mismo sistema.
• Posibilidad de inmunización oral por producción de
antígenos en plantas comestibles
Las plantas como
biorreactores
Vacunas orales en plantas
VENTAJAS
•Menores requerimientos de asistencia
médica para su administración.
• Menor riesgo de transmisión de
enfermedades asociadas a la indebida
reutilización de jeringas y agujas.
• Inducción de respuesta inmune a
nivel sistémico y de mucosas.
DESVENTAJAS
•Supervivencia del antígeno en el
tracto digestivo
•Inducción de una respuesta inmune
•Promoción de una protección
adecuada
• Ausencia de efectos de tolerancia
• Ausencia de inmunogenicidad del
vehículo vegetal
Aunque originariamente se pensó en emplear el tejido vegetal sin
procesar, actualmente se considera utilizar el tejido liofilizado. Esto
permitiría controlar mejor la dosis ingerida y evitar efectos de tolerancia
27
Vacunas basadas en vectores virales
•
Partículas virales quiméricas son potentes inmunógenos
(humoral y celular)
•
Los agregados de proteínas virales son buenos adjuvantes
•
La expresión de epitopes como fusiones a las proteínas de
cápside permite una abundante producción.
•
El proceso de purificación de las partículas virales quiméricas es
un proceso simple y de alto rendimiento.
•
Los viriones purificados pueden ser establemente almacenados.
Vacunas en
fase clínica:
hepatitis B
Importancia epidemiólogica de la hepatitis B
• Es una viremia persistente con 300 millones
de portadores en el mundo.
• La vacuna actual se produce en levaduras que expresan
el antígeno de superficie HBsAg. Es efectiva, pero
costosa, por lo que se distribuye poco en los países
subdesarrollados.
• Se ha reportado la expresión de HBsAg en plantas de
tabaco, papa, lechuga y se encuentra en estudio su
expresión en tomates y bananas.
Expresión de HBsAg
en tubérculos de papa.
El antígeno recombinante forma
estructuras vesiculares similares
a las observadas en el suero de
pacientes infectados con HBV.
Agrobiotecnología
Las plantas como
biorreactores
Tomado de: Kong et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2001.
28
Expresión
de HBsAg
en plantas
transgénicas
de Solanum
tuberosum
Se compararon los niveles de expresión de HBsAg
del virus humano de hepatitis B en tubérculos de papa
utilizando distintas construcciones genéticas.
Tomado de: Richter et al., Nat. Biotech., 2000.
Agrobiotecnología
Las plantas como
biorreactores
TEV:secuencia enhancer traduccional de Tobacco etch virus.
W: secuencia enhancer traduccional de Tobacco mosaic virus.
vspaS: péptido señal de la proteína VSP de soja.
vspaL: señal de transporte vacuolar de la proteina VSP de soja.
NOS 3’: terminador de nopalina sintetasa.
VSP 3’: terminador de la proteína VSP de soja.
Pin2 3’: terminador del inhibidor de proteinasa II de papa.
SEKDEL : señal de retención en RE.
La inmunización oral con tubérculos HB114-16 es comparable a
la obtenida con la vacuna producida en levaduras
Imnunización oral con rHBsAg
purificado de levaduras
Se suministraron 2 dosis de 150 mg de
rHBsAg cada una, en las semanas 0 y 1, y
una dosis de 0,5 mg en la sexta semana
(dosis subinmunogénica).
CT: adyuvante, toxina del cólera
Se señala el título del antisuero obtenido.
Línea anaranjada: control de ratones no
inmunizados
Inmunización oral con HBsAg
Imnunización oral con HBsAg expresado en tubérculos previamente
expresado en tubérculos de papa inmunizados con rHBsAg purificado
de levaduras
Se suministraron tres dosis orales de 5 g de tubérculos de papa transgénica (HB114-16),
conteniendo un promedio de 42 mg de HBsAg cada una, antes o después de una
inmunización con 0,5 mg de antígeno purificado de levaduras (rHBsAg). Se señalan los títulos
de los antisueros obtenidos en cada caso. Línea anaranjada: controles de ratones
alimentados con papas no transgénicas.
Tomado de: Kong, Q. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2001.
29
La respuesta
inmune
disminuye con
la eliminación
del adyuvante o
la cocción de
los tubérculos
La eliminación del
adjuvante (CT: toxina
colérica) en los
esquemas de
inmunización lleva a
una fuerte disminución
de la respuesta inmune
La cocción previa de
los tubérculos
disminuye pero no
elimina la respuesta
inmune.
Agrobiotecnología
Las plantas como
biorreactores
Tomado de: Kong, Q. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2001.
Inmunización
oral de
humanos
con lechuga
transgénica
que produce
HBsAg
En 2 de los 3 voluntarios inmunizados con hojas de
lechuga transgénica se detectó un título de anticuerpos
anti-HBsAg protectivo luego de la segunda dosis
Esquema de
inmunización:
Primera dosis:
200 g de hojas
Segunda dosis
(a las 8 semanas):
150 g de hojas
Concentración del
HBsAg en tejido de
lechuga: 1 a 5 ng/g
tejido fresco
Agrobiotecnología
Las plantas como
biorreactores
Tomado de: Kapusta et al., FASEB J., 1999.
Para conferir protección en humanos deben
registrarse en sangre niveles de anticuerpos
anti-HBsAg de al menos 10 mUI/ml
30
Comovirus. Cowpea mosaic virus
Potexvirus. Potato virus X
31
PVX. Producción de vacunas contra la tuberculosis
Presentación de epitopes de Human Rhinovirus (HRV) en Cowpea mosaic
virus
32
Vacuna terapeutica: Producción de anticuerpos scFV para el
tratamiento del linfoma non-Hodgkins-TMV vector
TABLE I Antigens expressed from Tobacco mosaic virus based vectors
Pathogen or Disease
Antigens
References
Human immunodeficiency virus-1
Human immunodeficiency virus-1
Dengue virus
Mycobacterium bovis
VP1 protein
Hypervariable region I
Glicoprotein D
Ga733-2 antigen
Tat protein
p24 protein
Domain III of E protein
ESAT6-Ag85 antigens
Wigdorovitz et la. 1999
Nemchinov et al. 2000
Perez Filgueira et al. 2003
Verch et al. 2004
Karasev et al. 2005
Perez Filgueira et al. 2004
Saejung et al. 2007
Dorokhov et al. 2007
Replacement vectors
Human papilloma virus
Yersinia pestis
Bacillus anthracis
Influenza
E7 protein
F1 and V proteins
PA and LF domains
Hemoagglutinin
Massa et al. 2007
Mett et al. 2007
Chichester et al. 2007, 2009
Shoji et al. 2008, 2009
Modular vectors
Yersinia pestis
Smallpox virus
F1 and V proteins
pBS antigen domain
Santi et al. 2006
Golovkin et al. 2007
Glicoprotein 41
HA epitope
Several epitopes
F protein epitopes
L2 protein
p15-Trp2 epitopes
ESAT6-Ag85 antigens
F protein epitopes
Durrani et al. 1998
Sugiyama et al. 1995
Turpen et al. 1995
Staczek et al. 2000
Smith et al. 2006
Mc Cormick et al. 2006a, 2006b
Dorokhov et al. 2007
Gilleland et al. 2000
Vectores
basados en
TMV
Agrobiotecnología
Vectores basados
en virus vegetales
Insertion vectors
Foot and mouth disease virus
Hepatitis C virus
Bovine herpes virus
Colorectal cancer
Peptide display vectors
Human immunodeficiency virus-1
Influenza virus
Plasmodium falciparum
Pseudomonas aeruginosa
Canine oral papilloma virus
Melanoma
Mycobacterium bovis
Pseudomonas aeruginosa
33
TABLE I Antigens expressed from Tobacco mosaic virus based vectors
Vectores
basados en
Pathogen or Disease
PVX
Insertion vectors
Human papilloma virus
Avian Influenza A virus
Toxoplasma gondii
Toxoplasma gondii
Hepatitis B virus
Transmissible gastroenteritis virus
Antigens or Antibodies
References
E7 protein
M2 protein ectodomain
SAG1 protein
Gra4 peptide
nucleocapsid protein
derivate antibody
Franconi et al. 2002
Nemchinov and Natilla 2007
Clemente et al. 2005
Ferraro et al. 2008
Mechtcheriakova et al. 2006
Monger et al. 2006
capside epitopes
Several epitopes
E7 protein
E2 glicoprotein peptides
ESAT6 antigen
E7 and L2 epitopes
F protein epitope
VP6 protein
Marusic et al. 2001
Turpen et al. 1995
Franconi et al. 2002
Marconi et al. 2006
Zelada et al. 2006
Cerovská et al. 2008
Natilla et al. 2006
O' Brien et al. 2000
Peptide display vectors
Agrobiotecnología
Vectores basados
Human immunodeficiency virus-1
Plasmodium falciparum
Human papilloma virus
Classical Swine Fever virus
Mycobacterium tuberculosis
Human papilloma virus-16
Newcastle disease virus
Murine rotavirus
en virus vegetales
Ejemplos de antígenos expresados en plantas transgénicas
34
Producción de anticuerpos
Agrobiotecnología
Las plantas como
biorreactores
La producción
de anticuerpos
en plantas
transgénicas
permite
ensamblar
moléculas de
Ig complejas
Los genes que codifican los cuatro polipéptidos de las
inmunoglobulinas secretorias se acumulan en una misma
planta por cruzamientos sucesivos entre plantas
transgénicas individuales y sus descendientes recombinantes
PLANTIBODIES
Agrobiotecnología
Las plantas como
biorreactores
35
Expresión
del
anticuerpo
monoclonal
anti-AgI/II en
plantas de
tabaco
La bacteria Streptococcus mutans es uno de los principales
agentes causales de la caries dental. El antígeno de superficie
AgI/II participaría en la interacción hidrofóbica entre S. mutans
y un complejo de glicoproteínas de alto peso molecular
presente en la superficie dental.
Estrategia:
Expresar el anticuerpo monoclonal murino anti-AgI/II en
Nicotiana tabacum con el fin de obtener grandes cantidades
del mismo.
Agrobiotecnología
Las plantas como
biorreactores
Adaptado de: Ma et al., Science, 1995.
El anticuerpo
anti Agl/II
actuaría
alterando la
dinámica de
repoblación
de la superficie
dental
Luego del tratamiento con un agente antiséptico, la presencia
del anticuerpo anti AgI/II evitaría la recolonización de los
nichos en la superficie dental por Streptococcus mutans.
Agrobiotecnología
Las plantas como
biorreactores
Adaptado de: www.planetbiotechnology.com
CaroRxTM
Planet Biotechnology
36
La inmunización pasiva local de humanos con anti-AgI/II
producido en plantas otorga protección contra S. mutants
Recolonización de Streptococcus mutants en la cavidad oral de voluntarios humanos
previamente tratados con gluconato de clorohexidina (CHX) para eliminar la flora oral
Tomado de: Ma. et al., Nat. Med. 1998 y www.planrtbiotechnology.com
• Protocolo de inmunización:
Aplicación directa en los dientes del anticuerpo secretorio producido en plantas de
tabaco (SIgA/G, línea roja) durante 3 semanas con 2 tratamientos por semana. Se
realizaron controles con solución salina (línea verde claro), con un anticuerpo bovino no
relacionado producido en plantas (línea azul) y con el anticuerpos murino (Guy’s 13,
línea verde oscuro). n: número de voluntarios
RinoRxTM Fusión ICAM-q a IgA
Tratamiento preventivo de la gripe
causada por Rhinovirus
DoroRxTM
IgA monoclonal contra dorocina
Tratamiento de efectos secundarios (alopecía) de la
quimioterapia con doxorubicina
37
Expresión de proteínas heterooligoméricas por coexpresión de
vectores no competitivos
Expresión de anticuerpo moconoclonal A5
por coexpresión TMV y PVX
Expresión de HC y LC del A5 mAB
Purificación de mAb por A-Sefarosa
PAGE
TMV-LC
No desnaturalizante
+
PVX-HC
SDS-PAGE
TMV-HC
+
PVX-LC
Westen blot
Producción de proteínas de interés
farmacológico y medicinal
Agrobiotecnología
Las plantas como
biorreactores
38
Producción
de factor de
crecimiento
epidérmico
humano en
plantas
de tabaco
Construcciones usadas para transformar Nicotiana tabacum:
Versiones
citoplasmáticas
P 35S CaMV
hEGF
tNOS
P 35S (L) CaMV W
hEGF
tNOS p35(L)EGF
hEGF
tNOS p35(L)APEGF
Versión
P 35S (L) CaMV W
apoplástica
ss
p35EGF
Cuantificación por ELISA de los niveles
de hEGF expresado en plantas transgénicas
104
103
102
10
Agrobiotecnología
1
Las plantas como
biorreactores
Tomado de: Wirth et al. Mol.Breed., 2004.
El hEGF producido en tabaco es biológicamente activo
Ensayo de expansión de células del
cumulus de ovocitos bovinos
Control
hEGF st10ng
Planta no tranformada
Extracto 35S (L) AP EGF
(10ng por ELISA)
Extracto planta infectada
PVX control
Extracto planta infectada con
PVXAPEGF
Ensayo de unión a radioreceptor
Tomado de: Wirth et al. Mol.Breed., 2004.
39
Producción de Galactosidasa A humana- Enfermedad de Fabry
TMV vector-Geneware system
Enfermedad de Fabry = deficiencia de la
enzima alfa-galactosidasa A
1: 60000 hombres-ligada a cromosoma X
Producción de Galactosidasa A humana- TMV vector-Geneware system
Rápida optimización de la expresión del
gen que codifica la GalA
40
Producción de Galactosidasa A humana- TMV vector-Geneware system
Control de calidad del la enzima GalA
producida
•Pureza por SDS-PAGE
•Determinacion del amino-terminal y la
secuencia completa por Maldi-tof
•Esterilidad
•Endotoxina
•ADN residual
•Impurezas residuales de la planta
•Concentración proteica
•Actividad específica
Producción de Galactosidasa A humana- TMV vector-Geneware system
Modelo de enfermedad = ratón knockout GalA
Acumula lípido GB3 en varios órganos
Medición de la eficacia de la enzima
GalA producida
• Medición de la acumulación de GB3 en
ratones wt y en ratones knockout GalA
• Clearance plasmático
• Organo blanco
41
42
43
Proteínas
terapeuticas
producidas en
plantas en el
mercado o fase
clínica
Otras aplicaciones:
producción de enzimas de interés
industrial, suplementos alimenticios y
biopolímeros
Agrobiotecnología
Las plantas como
biorreactores
44
La avidina de
pollo fue la
primera
proteína
recombinante
comercializada
obtenida
en plantas
Construcción usada para transformar plantas de maíz:
Pr Ubiquitina Intron Ubi a-amilasa ss
avidina
Pin II 3’
El uso de codones de la secuencia señal de la a-amilasa de cebada y de la
secuencia codificante de la avidina de pollo se optimizó para su expresión en
plantas de maíz.
• El nivel de expresión de la avidina extraída de
semillas de maíz fue 2,3% de la proteína total
extraída (230 mg/Kg de semillas)
Grano de maíz transgénico
incubado con un anticuerpo antiavidina. La interacción se
evidencia por una reacción
colorimétrica.
Notar la alta concentración de
avidina en el embrión (E).
En: endosperma
Agrobiotecnología
Las plantas como
biorreactores
Tomado de: Hood et al, Mol. Breed. 1997.
Características
de la avidina
producida
en maíz
Efecto de la temperatura de almacenamiento sobre la
estabilidad de la avidina expresada en semillas de maíz
Características físicas de la avidina
recombinante producida en maíz
Agrobiotecnología
Las plantas como
biorreactores
Tomado de : Hood et al, Mol. Breed. 1997.
45
Producción
de brazzeína
en plantas
de maíz
Las proteínas
edulcorantes tienen gran
demanda para productos
dietéticos y para enfermos
de diabetes.
La brazzeina es una
proteína producida por la
planta africana
Pentadiplandra brazzeana
que posee un poder
edulcorante 1.200 veces
más alto que el azúcar.
Su producción en la
planta nativa es
impráctica debido a los
altos volúmenes de
producción requeridos.
Las plantas como
biorreactores
Producción
de brazzeína
en plantas
de maíz
Tomado de: Lamphear et al.,
Plant Biotechnology Journal 2005.
Constitutive w/ intron: promotor de tipo poliubiquitina
Embryo-preferred: promotor de globulina 1 de maíz
Endosperm-preferred: promotor de a-zeína de 22kD
BAASS: secuencia señal de la a-amilasa de cebada
Pin II: Terminador del inhibidor de proteasas II de Solanum tuberosum
TEV y MDMV: enhancers traduccionales de Tobacco etch virus y Maize
dwarf mosaic virus
Se obtuvieron niveles de
acumulación en semilla de
hasta 4% de la PST.
Expresión promotor
embrión + secreción
es màs eficiente
Expresión embrión
+ citoplasma
ineficiente
Niveles de
expresión de
brazzaína en
semillas T1
para los
mejores
transformantes
obtenidos con
las
construcciones
1-8 detalladas
en la
transparencia
anterior
*
Brazzeína (%
(% PST)
PST)
Agrobiotecnología
Se transformaron plantas
de maíz con dos
variantes de la secuencia
de brazzeína y se la
expresó en las semillas a
nivel del embrión y del
endosperma.
*
*
*
Las plantas como
biorreactores
*
mg (
Agrobiotecnología
Brazzeína
(mg/g de peso seco)
Construcción genética
Maíz
entero
Grano entero
Grano
molido
endosperma
embrión
Germen
Contenido de
brazzeína en
fracciones
obtenidas por
molienda seca
de las semillas
de la línea 5
(promotor para
embrión).
pericarpio
Tomado de: Lamphear et al., Plant Biotechnology Journal 2005.
46
Producción
de brazzeína
en plantas
de maíz
Agrobiotecnología
Las plantas como
biorreactores
Esquema de los pasos de
purificación seguidos para el
aislamiento de brazzeína expresada
en maíz (maíz transformado con la
construcción 5).
Muestras tomadas en los distintos pasos de
purificación analizadas por PAGE-SDS. Las
proteínas fueron visualizadas por tinción con
Comassie Blue. Se embraron 5 mg en todos
los casos.
1: extracto crudo; 2: extracto calentado y
filtrado; 3: fracción pico de la cromatografía
de intercambio catiónico; 4: fracción pico de
la cromatografía de tamaño de exclusión.
Tomado de: Lamphear et al., Plant Biotechnology Journal 2005.
Síntesis de plásticos biodegradables en plantas
Envases de shampoo hechos de un copolímero de polihidroxibutirato
y polihidroxivalerato a 0, 3 y 9 meses de permanecer en compost.
47
Producción
de PHB en
plantas por
transferencia
de la vía
metabólica
bacteriana
• El polihidroxibutirato o PHB constituye una fuente
. renovable de material termoplástico biodegradable.
• En Alcaligenes eutrophus la síntesis a partir de acetil CoA
. ocurre en tres pasos catalizados por distintas enzimas.
Agrobiotecnología
Las plantas como
biorreactores
Las plantas
de A. thaliana
transformadas
con los genes
phbA, phbB y
phbC
acumulan
gránulos de
PHB en los
cloroplastos
• La vía completa de síntesis de PHB en Arabidopsis thaliana se
obtuvo por transformación con los genes phbA, phbB y phbC de
Ralstonia eutropha.
• Las tres enzimas se fusionaron a péptidos de tránsito a
cloroplastos para lograr su acumulación en estas organelas. Esto se
hizo porque los niveles de acetil-CoA son mucho más altos en los
plástidos que en el citoplasma.
p35S TPSS
phbB
NOS 3’
p35S TPSS
phbA
NOS 3’ p35S TPSS phbC NOS 3’
phbABC
Microscopia electrónica de una
célula del mesófilo de una hoja
madura de una línea de A.
thaliana que expresa las enzimas
responsables de la síntesis de
PHB. Se muestra un cloroplasto
conteniendo gránulos de PHB.
Agrobiotecnología
Las plantas como
biorreactores
Tomado de: Bohmert et al, Planta, 2000.
48
Producción a-amilasa en semilla de maíz para bioetanol
2011 Usda-Aphis a prueba Enogen-Syngenta













Enzimas industriales
Avidina: kit de diagnóstico
β-glucuronidasa: kit de diagnóstico
Trypsin: wound care
Celulasa: producción de etanol
Xilanasa: procesamiento de biomasa
Fitasa: procesamiento de alimentos
(1-3)(1-4)β-glucanasa: Brewing
Lignin peroxidasa: Paper manufacture
Biopolímeros
proteínas de la seda de araña
polipéptidos tipo elastina
colágeno
49
Companias que utilizan tecnologías para la producción de
proteínas en plantas
Tomado de: Biotecnologìa y mejoramiento vegetal II, Cap. 16 2010
Tomado de: Biotecnologìa y mejoramiento vegetal II, Cap. 16 2010
50
Aspectos de
bioseguridad
• Bioseguridad:
En el caso de producción de proteínas terapéuticas o con
actividad biológica, se deben establecer condiciones de
bioseguridad aún más estrictas que las adoptadas para
otros OGMs, ya que éstas no deben ingresar bajo ningún
punto de vista a la cadena alimentaria humana.
• Riesgos y desventajas para la producciòn
de medicamentos en plantas




Agrobiotecnología


Dispersión de los transgenes por polen, semilla o frutos
Riesgo de contaminación de la cadena alimentaria;
Impacto en especies no blanco: pájaros, mariposas,
insectos etc.
Reproducibilidad en proceso de purificaciòn
Uso inapropiado de los productos derivados de OGM
Temas regulatorios complejos
Las plantas como
biorreactores
Aspectos de
bioseguridad
• Algunas recomendaciones para la contenciòn
biològica:
- Utilizar sistemas cerrados para el crecimiento de plantas.
- Utilizar cultivos que no participen de las cadenas
alimentarias humana o animal.
- Utilizar cultivos de estructura floral cerrada
(autopolinización).
Agrobiotecnología
Las plantas como
biorreactores
- Tener en cuenta el aislamiento temporal
(época de polinización diferente en cultivos
relacionados) y espacial (barreras de cultivos
no transgénicos).
- Si la expresión es en hojas, cosechar las
plantas antes de la floración.
51