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CAPÍTULO 2.3.1.
SÍNDROME DE TAURA
1. DEFINICIÓN DE LA ENFERMEDAD
A efectos de este capítulo, se considera que el síndrome de Taura (ST) es una infección por el virus del
síndrome de Taura (TSV).
2. INFORMACIÓN PARA EL DISEÑO DE PROGRAMAS DE VIGILANCIA
a)
Factores del agente
• Agente etiológico: el TSV según describen Bonami et al. (3) y Mari et al. (40, 41).
• En el informe más reciente del Comité Internacional sobre Taxonomía de Virus (el ICTV; 14)
el TSV se consideró dentro de la Familia Dicistroviridae como una especie no asignada.
• Las partículas del TSV son icosaedros sin envoltura, de 32 nm, y con una densidad de
flotación de 1.338 g/ml. El genoma del TSV está formado por un ARN lineal monocatenario
de polaridad positiva con 10.205 nucleótidos, excluyendo la cola de poli-A en el extremo 3´, y
contiene dos grandes fases de lectura abierta (ORFs). La ORF 1 comprende las secuencias de
las proteínas no estructurales, como la helicasa, la proteasa y la ARN polimerasa dependiente
de ARN. La ORF 2 comprende las secuencias para las proteínas estructurales del TSV,
incluyendo las principales proteínas de la cápsida VP1, VP2 y VP3 (de 55, 40, y 24 kDa,
respectivamente). El virus se replica en el citoplasma de las células del hospedador (3, 40, 41,
51).
• Cepas del agente:
• Variantes genotípicas del TSV: se han identificado al menos tres grupos genotípicos del
TSV según la secuencia de la VP1 (= CP2), que es la proteína estructural mayor y
probablemente la dominante del virus. En base a la secuencia de VP1 (= CP2) estos grupos
genotípicos son: 1) grupo de América; 2) grupo del sudeste asiático; y 3) grupo de Belize (8,
43, 54).
• Variantes antigénicas del TSV: utilizando el anticuerpo monoclonal MAb 1A1, producido
contra un aislado de referencia del grupo de América (TSV USA-HI94 – GenBank
AF277675) (41, 48) se han demostrado al menos dos variantes: el Tipo A, que son aquellos
que reaccionan con el MAb 1A1 (en enzimoinmunoensayo [ELISA] en transferencias tipo
Western y en hibridación in-situ [IHC] con tejidos infectados), y los Tipos que no
reaccionan. Los que no reaccionan con el MAB 1A1 se subdividen en el Tipo B (TSV 98
Sinaloa, México) y el Tipo C (TSV 02 Belize) según las especies hospedadoras y su
virulencia. Todos los aislados del TSV de América y la mayoría, si no todos, los del
genotipo del sudeste asiático reaccionan con MAB 1A1. Por contra, ninguno del genotipo
Belize reacciona con MAb1A1 (12, 13), como tampoco lo hace el aislado de TSV de la
epizootia del 2005 en instalaciones de producción de gambas de Venezuela.
• Otras causas descritas de ST: en Ecuador el síndrome de Taura se relacionó inicialmente con
una contaminación por pesticidas en las instalaciones de producción de gambas, una
controversia que fue mantenida a nivel legal durante ~8 años después de que se demostrara
científicamente que la enfermedad tiene una etiología vírica (3, 20, 29). Por tanto, algunos
trabajos en la literatura proponen una etiología tóxica para el ST (21–23).
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Capítulo 2.3.1. — Síndrome de Taura
b)
Factores del hospedador
• Especies susceptibles: las principales especies hospedadoras para el TSV son el langostino
blanco (o camarón blanco) Litopenaeus vannamei y el langostino americano L. stylirostris.
Aunque todas las principales especies hospedadoras del TSV pertenecen a los peneidos del
género Litopenaeus, hay otras especies de peneidos que pueden ser infectadas por el TSV
mediante exposición directa, pese a que no desarrollan síntomas. Los hospedadores naturales y
experimentales que han sido documentados para el TSV incluyen: L. setiferus, L. schmitti,
Penaeus monodon, Metapenaeus ensis, Fenneropenaeus chinensis, Marsupenaeus japonicus,
Farfantepenaeus aztecus y Fa. duorarum (4, 5, 7, 8, 26, 27, 46, 53).
• En epizootias de ST dentro de factorías que afectan a las existencias no seleccionadas de
L. vannamei, que es la especie hospedadora principal para el TSV, las mortalidades
acumuladas típicas varían del 40 al >90% en poblaciones cultivadas de las formas postlarvarias (PL), las fases juveniles, y las de subadulto. Los supervivientes de infecciones por
TSV pueden mantener el virus toda la vida (7, 19, 26–28, 33, 34, 37).
• Se han encontrado líneas seleccionadas resistentes al TSV de L. stylirostris (genotipo 1,
MAb 1A1 tipo A) y éstas han llegado a convertirse en las existencias cultivadas dominantes
en el oeste de México después de que el TSV alcanzó a México en 1994. Sin embargo, en
1998–1999, emergió una nueva “cepa” de TSV (Tipo B; 13, 15, 28, 29, 62) y causó una
epizootia masiva en L. stylirostris. La aparición de esta nueva “cepa” de TSV fue seguida
poco después, a finales de 1999, por la introducción del virus del síndrome del moteado
blanco (WSSV) en plantas productoras de langostinos del oeste de México, al que
L. stylirostris no ofrecía resistencia, terminando de modo efectivo con el interés por el
cultivo de L. stylirostris.
• Fases vitales susceptibles de las especies hospedadoras: el TSV se ha documentado en todas las
fases de la vida de L. vannamei (es decir, PLs, juveniles y adultos) excepto en los huevos,
zigotos y larvas (26).
• Órganos infectados: en observaciones comprobadas mediante ISH con sondas específicas de
ADN, el TSV infecta y se replica principalmente en el epitelio cuticular (o hipodermis) del
exoesqueleto general, en la parte anterior y posterior del tracto digestivo, en las branquias y los
apéndices, y a menudo en los tejidos conectivos, tejidos hematopoyéticos, órgano linfoide y
glándula antenal. Típicamente, no muestran signos histológicos de infección por el TSV, y
normalmente son negativos para el TSV por ISH, los órganos entéricos (el hepatopáncreas
derivado del endodermo, el intestino medio y los epitelios de la mucosa de los ciegos del
intestino medio) junto con la musculatura lisa, cardíaca y estriada, y el cordón nervioso ventral,
con sus ramas y ganglios (4, 17–19, 23, 26, 30–32, 53).
• Infección persistente y portadores asintomáticos: algunos miembros de las poblaciones de
L. vannamei o L. stylirostris que sobreviven a infecciones y/o epizootias por el TSV llevan el
virus toda la vida y, aunque no está documentado, pasan el virus a su progenie por transmisión
vertical (18, 19).
• Vectores y fuentes de contaminación:
• Aves marinas: se ha demostrado que el TSV permanece infeccioso hasta 48 horas (tras la
ingestión de cadáveres de gambas infectadas por el TSV) en las heces depositadas por
gaviotas silvestres o cautivas (Larus atricilla) y por pollos (Gallus domesticus, empleados
como sustitutos de laboratorio para todas las aves comedoras de langostinos). Estos
hallazgos revelan que las aves son un importante vector mecánico en la transmisión del
virus dentro de cultivos afectados o de regiones de cultivos afectados (16, 57).
• Insectos acuáticos: también se ha visto que el llamado barquero de agua (Trichocorixa
reticulata [Corixidae], un insecto acuático que se alimenta de langostinos muertos en
estanques de langostinos cultivados), sirve de vector mecánico del TSV (5, 25–27).
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• Productos comerciales congelados infectados por TSV: en muestras del mercado de
EE.UU., originadas en Latinoamérica y en el sudeste asiático, se ha encontrado el TSV en
productos comercializados de langostinos blancos (L. vannamei). Una inadecuada
eliminación de los desechos (líquidos y sólidos, es decir, de cáscaras peladas, cabezas,
tractos intestinales etc.) que se originan en el procesamiento de productos con valor
añadido, procedentes de langostinos infectados por el TSV en localidades costeras, puede
suponer una fuente de TSV que a su vez puede contaminar las existencias silvestres y
cultivadas que estén próximas al punto de descarga de los desechos (27, 45).
• Zoonosis potenciales: se describió que el TSV infecta líneas celulares humanas y de mono, lo
que permitió sugerir que este virus posee un potencial zoonótico, y que los langostinos
peneidos pueden servir como reservorios para el TSV y para otros miembros de la
“superfamilia de los picornavirus” que infectan a humanos (2). Debido al diseño experimental
y a los resultados inesperados descritos por Audelo-del-Valle et al. (2), otros dos laboratorios
repitieron el mismo estudio y ambos encontraron que el TSV ni infecta ni se replica en líneas
celulares humanas o de primates que tienen una conocida susceptibilidad a los picornavirus
humanos (39, 47), invalidando por tanto de forma efectiva la suposición de que el TSV tiene
potencial zoonótico.
c)
Patrón de la enfermedad
• El ST se conoce sobre todo como una enfermedad de las formas de cría o en fase de engorde
de L. vannamei que ocurre a los ~14–40 días de introducir las PLs en los estanques o viveros
de engorde, por lo que, los langostinos con ST son típicamente formas juveniles pequeñas que
van de ~0,05 g hasta <5 g. También pueden ser afectados los langostinos de mayor tamaño,
especialmente si no se exponen al virus hasta que son formas más grandes o adultos (5, 6, 26,
27, 34).
• Mecanismos de transmisión: la transmisión del TSV puede seguir una ruta horizontal o
vertical. Se ha demostrado la transmisión horizontal por canibalismo o por agua contaminada
(5, 20, 26, 27, 58). Se sospecha la existencia de transmisión vertical desde reproductores
adultos infectados a su progenie, pero se ha confirmado experimentalmente.
• Prevalencia: en regiones en las que en producciones cultivadas el virus es enzoótico, se ha
encontrado que la prevalencia del TSV varía en diferentes análisis del 0 al 100% (5, 23, 24).
• Distribución geográfica: el ST tiene una amplia distribución en las regiones de cultivo de
langostinos en América y en el sudeste asiático (4, 5, 8, 18, 26, 27, 35, 43, 54, 56, 61).
• América: después de su reconocimiento en 1992 como una enfermedad diferente de
L. vannamei en cultivos de Ecuador (6, 22), el TS se extendió rápidamente por muchas de
las regiones de cultivo de langostinos de ambas Américas por el envío de PLs y
reproductores infectados (5, 7, 18, 26, 27). En el hemisferio oeste, el ST y el TSV se han
descrito virtualmente en todas las regiones donde se cultivan langostinos en las Américas y
en Hawaii (1, 5, 51). El TSV es enzoótico en las producciones cultivadas de langostinos
peneidos de la costa americana del Pacífico, de Perú a México, y se ha encontrado
ocasionalmente en algunas existencias silvestres de L. vannamei de la misma región (30, 32).
El TSV también se ha descrito en producciones cultivadas de peneidos de la costa
americana atlántica, costa del Caribe y Golfo de México, pero en estas regiones no se ha
descrito en ejemplares silvestres (18, 26, 27, 29).
• Asia: el TSV se introdujo en Taipei, China, en 1999 con gamba blanca del Pacífico
infectada, L. vannamei, procedente de fuentes de América central y del sur (56, 61). Desde
esa introducción original, el virus se ha extendido en paralelo con los movimientos de
reproductores y de PLs a la República Popular de China, Tailandia, Malasia, e Indonesia,
donde ha originado grandes epizootias con elevadas tasas de mortalidad (8, 43, 54).
d)
Control y prevención
• Vacunación: no se dispone de vacunas eficaces contra el TSV.
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• Quimioterapia: no hay trabajos científicamente confirmados.
• Inmunoestimulación: no hay trabajos científicamente confirmados.
• Producción de resistentes: se han desarrollado productos cultivados de L. vannamei y
L. stylirostris que son resistentes al TSV. Algunas líneas cultivadas y resistentes al TSV de
L. vannamei (que también están libres de TSV) son de uso común en las industrias del cultivo
de langostinos en las Américas y en el sudeste asiático (9, 42, 58). Después de la aparición del
ST en América central, se ha descrito una mejorada resistencia al ST en PLs silvestres de
L. vannamei, que son usadas en las instalaciones de producción de langostinos de la región (24).
• Repoblación con especies resistentes: en regiones donde el TSV es enzoótico, el uso de líneas
cultivadas de L. vannamei resistentes al TSV ha tenido mucho éxito en evitar pérdidas debidas
al ST (29, 42, 60). Tras la introducción del TSV en México en 1994, se emplearon con éxito
líneas cultivadas de L. stylirostris resistentes al TSV para poblar instalaciones mejicanas que
antes habían crecido L. vannamei susceptible al TSV (9, 27, 62). Sin embargo, en estas
existencias de L. stylirostris apareció una nueva “cepa” de TSV en 1998–1999, y este “TSV de
tipo B” originó epizootias graves en las existencias de L. stylirostris previamente resistentes al
TSV (13, 51).
• Agentes bloqueadores: se describió que la resistencia a la infección por TSV se debía a la
expresión en los zigotos de L. vannamei del RNS antisentido de la proteína de la cápsida del
TSV. Las formas transgénicas juveniles desarrolladas de zigotos protegidos de este modo
mostraron una mejor resistencia a inoculaciones de TSV por vía oral o por inyección
intramuscular (IM) (38). Se han producido resultados similares introduciendo secuencias al
azar de ARN de doble cadena en formas juveniles de L. vannamei (50).
• Prácticas generales de manejo: para evitar las infecciones por el TSV y la enfermedad del ST,
se han aplicado con éxito algunas prácticas en la producción. Éstas incluyen un pre-análisis de
reproductores silvestres o cultivados y/o de sus huevos o de larvas nauplias tras el desove
mediante la aplicación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la eliminación de
aquellas formas que den positiva la prueba para el virus (15), seguido de una repoblación
completa de la región de los cultivos con ejemplares libres del TSV (11), y el desarrollo de
existencias de langostinos de L. vannamei y L. stylirostris libres del patógeno específico (SPF)
(27, 29, 36, 42, 49, 59, 60). La adopción de esta última tecnología ha sido la más práctica entre
las utilizadas para la prevención y el control del ST. Por desgracia, en la industria existe la falsa
idea de que las formas SPF son de carácter genético en vez de representar una situación
sanitaria. El desarrollo de L. vannamei SPF, no solo libres del TSV, sino también de todos los
patógenos más importantes conocidos para las langostinos peneidos, ha culminado con su
introducción en Asia y su amenaza para P. monodon en 2004–2005, como la especie de
langostino de cultivo dominante en Asia, así como en las Américas donde se desarrollaron las
formas SPF (29, 52).
3. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO
a)
Métodos de diagnóstico de campo
• Síntomas generales: la enfermedad del ST tiene tres fases distintas, la aguda, la de transición y
la crónica, que son totalmente distinguibles (18, 19, 26, 27, 32). Los síntomas mas evidentes
presentadas por los langostinos en la fase aguda y, especialmente, en la fase de transición son
únicos y pueden proporcionar un diagnóstico provisional de la enfermedad (5, 19, 26, 28).
• Fase aguda: los signos evidentes manifestados por ejemplares moribundos de L. vannamei
con fase aguda de ST incluyen la expansión de los cromatóforos rojos dando al langostino
afectado una coloración rojiza-pálida general, presentando la cola en forma de abanico y los
pleópodos distintivamente rojos; de aquí que el nombre de “cola roja” fuera uno de los
nombres dados a la enfermedad por los productores cuando apareció por vez primera en
Ecuador (32). En dichos langostinos, una inspección detallada, mediante una lupa de mano
de 10x, del epitelio cuticular en los apéndices finos (como los bordes de los urópodos o de
los pleópodos) revela síntomas de necrosis epitelial focalizada. Los langostinos con estos
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signos evidentes de ST agudo poseen típicamente las cáscaras blandas, un intestino vacío y
están con frecuencia en las últimas fases D del ciclo de muda. Los langostinos con afección
aguda normalmente mueren durante la ecdisis o muda. Si son mayores de ~1 g, los
langostinos moribundos pueden ser visibles para las aves marinas en los bordes de los
viveros y en la superficie. Por ello, durante el punto máximo de las epizootias graves, se
pueden observar centenares de aves marinas (gaviotas, golondrinas de mar, garzas,
cormoranes, etc.) alimentándose de los langostinos moribundos que se acumulan en la
superficie y en los bordes del vivero afectado (5–7, 16, 26, 27, 32, 57).
• Fase de transición (recuperación): aunque durante epizootias de ST solo está presente unos
cuantos días, los síntomas presentados por los langostinos en la fase de transición pueden
dar un diagnóstico provisional de infección por el TSV. Durante la fase de transición (que
puede ocurrir mientras muchos langostinos de la población afectada están todavía en la fase
aguda y las mortalidades diarias son elevadas), en los viveros afectados hay langostinos que
muestran lesiones cuticulares melanizadas, de aspecto irregular y con disposición multifocal
aleatoria. Estas manchas melanizadas son acumulaciones de hemocitos que indican sitios de
lesiones de ST en resolución en el epitelio cuticular. Tales langostinos pueden o no tener las
cutículas blandas y los cromatóforos rojos en expansión, y además pueden alimentarse y
comportarse normalmente (5, 19, 26).
• Fase crónica: después de una muda adecuada, los langostinos en fase de transición pasan a
la fase crónica del ST, en la cual los langostinos persistentemente infectados no muestran
síntomas obvios de enfermedad (5, 19, 26, 27, 32). Sin embargo, los ejemplares de
L. vannamei que están infectados crónicamente con el TSV pueden ser menos resistentes a
estreses ambientales normales que los langostinos no afectados (por ejemplo, a bruscos
descensos de salinidad) (36).
b)
Métodos clínicos
• Lesiones macroscópicas: ver la sección 3.a anterior.
• Microscopía directa: para demostrar las lesiones focales de la fase aguda del ST en las células
epiteliales de la cutícula (y hacer un diagnóstico presuntivo de la fase aguda del ST), se pueden
usar montajes húmedos simples, sin teñir, de trozos cortados de las branquias, las puntas de
los apéndices, etc., y examinarlos por microscopía de fases o por microscopía óptica con
aumentos reducidos. Las preparaciones que presenten lesiones de la fase aguda del ST
contienen numerosas estructuras esféricas (ver más adelante, Métodos histopatológicos), que
son núcleos picnóticos y cariorréticos restos citoplásmicos de células necróticas.
• Métodos histopatológicos:
• Fase aguda del ST: el diagnóstico de la fase aguda de la enfermedad del ST depende de la
demostración histológica (en preparaciones teñidas con hematoxilina y eosina [H&E]), de
áreas multifocales de necrosis en el epitelio cuticular de la superficie general del cuerpo, los
apéndices, las branquias, y la parte caudal y anterior del tubo digestivo (el esófago, y
cámaras anteriores y posteriores del estómago). Las células del tejido conectivo subcuticular
y las fibras basales del músculo estriado adyacentes al epitelio cuticular afectado están
ocasionalmente afectadas. En algunos casos graves de la fase aguda del ST, el epitelio del
túbulo de la glándula antenal también está destruido. En las lesiones cuticulares
multifocales, destacan numerosos focos de células afectadas que muestran una aumentada
eosinofilia en el citoplasma y núcleos picnóticos y cariorréticos. A menudo, en estas
lesiones de la fase aguda del ST son muy abundantes los restos citoplasmáticos de las
células necróticas y se presentan por lo general como cuerpos esféricos (1–20 µm de
diámetro) cuya tinción varía de eosinófila a débilmente basófila. Estas estructuras, junto
con los núcleos picnóticos y cariorréticos, dan a las lesiones de la fase aguda del ST una
apariencia característica de “pimienta” o de “perdigones”, que se considera patognomónica
para la enfermedad del ST cuando no hay necrosis concurrente de las células parenquimales
de los túbulos del órgano linfoide. La ausencia de necrosis del órgano linfoide en la fase
aguda de las infecciones por el TSV distingue la enfermedad del ST de la fase aguda de la
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enfermedad de la cabeza amarilla, donde ocurren pautas similares de necrosis a las
inducidas por el TSV en el epitelio cuticular y en las branquias (26).
En los tejidos infectados por el TSV, los núcleos picnóticos y cariorréticos dan una
reacción de Feulgen positiva (para el ADN), que los distingue de las inclusiones
citoplásmicas, menos basófilas y eosinófilos, que no contienen ADN. La ausencia de
infiltración hemocítica y de otros signos de una respuesta inflamatoria importante del
hospedador distingue la fase aguda del ST de la fase de transición de la enfermedad (4, 5–7,
12, 13, 18–20, 26, 32).
• Fase de transición del ST (recuperación): en la fase de transición del ST, las típicas lesiones
cuticulares de la fase aguda disminuyen en cantidad y gravedad y son reemplazadas por una
abundante infiltración y acumulación de hemocitos en los lugares de necrosis. Las masas de
hemocitos pueden melanizarse dando lugar a manchas negras irregulares que caracterizan la
fase de transición de la enfermedad. En cortes con H&E, tales lesiones pueden mostrar
erosión de la cutícula, colonización de la superficie e invasión de la cutícula afectada y de
los hemocitos superficiales expuestos por Vibrio spp. (19, 26). Los cortes de los órganos
linfoides (LO) durante la fase de transición del ST pueden aparecer normales con tinción
de H&E. Sin embargo, cuando estos cortes de los LO se prueban para TSV mediante ISH
con una sonda específica de cADN (o mediante IHC con MAb 1A1 para el TSV de tipo A,
genotipo 1), se observan grandes cantidades de TSV acumuladas en las células
parenquimales de los túbulos de los LO más periféricas (19, 53).
• Fase crónica del ST: los langostinos en la fase crónica del ST no manifiestan síntomas
generales, e histológicamente el único signo de infección es la presencia de numerosos
esferoides prominentes en los órganos linfoides (LOS), que pueden permanecer asociados
al cuerpo principal de los LO pareados, o que pueden independizarse y convertirse en
cuerpos LOS ectópicos, alojados en áreas estrechadas del hemocele (es decir, el corazón,
branquias, en los tejidos conectivos subcuticulares, etc.). Dichos LOS son acumulaciones
esféricas de células de LO y de hemocitos y se pueden distinguir de los tejidos normales de
LO por su naturaleza esférica y la falta del vaso central que es típico de los túbulos de los
órganos linfoides normales. Algunas células en los LOS dan reacción positiva para el virus,
mientras que ningún otro tejido diana reacciona, cuando se ensayan para TSV por ISH con
una sonda de cADN (o con MAb 1A1 usando IHC) (19, 26, 27).
c)
Métodos de detección e identificación del agente
• Métodos de detección directa
i) Métodos de microscopía directa: ninguno es aplicable.
ii) Aislamiento e identificación del agente
• Método del bioensayo: se puede verificar la confirmación de la infección por el TSV
mediante bioensayo de los animales sospechosos con las formas juveniles de
L. vannamei SPF que sirven como indicador para el virus (7, 16, 19, 20, 26, 34, 46). Se
pueden emplear protocolos orales o por inyección. El método oral es relativamente
simple de realizar y se lleva a cabo en pequeños estanques alimentando a formas
juveniles de L. vannamei SPF con cáscaras troceadas de los langostinos sospechosos
(58). Es necesario el uso de un tanque control negativo de langostinos indicadores, que
solo reciben alimento normal. Cuando se usa el protocolo oral de alimentación para el
bioensayo del TSV, la conversión de los langostinos indicadores a ST-positivas (por
signos evidentes e histopatológicos) ocurre típicamente a los 3–4 días de la exposición
inicial, y se dan importantes niveles de mortalidad a los 3–8 días de la exposición inicial.
El control negativo de los langostinos debe permanecer negativo (durante al menos 10–
15 días) en cuanto a síntomas evidentes o histológicos de la enfermedad del ST, y en lo
que respecta a mortalidades anormales (19, 26, 58).
Con el protocolo de bioensayo por inyección, se puede probar una variedad de tipos de
muestras para el TSV. Si se recogen durante una epizootia de TSV, se pueden usar los
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langostinos completos. Las cabezas se usan solo si el langostino manifiesta grandes
lesiones de fase de transición (manchas multifocales melanizadas sobre la cutícula) o no
presenta signos clínicos de infección (fase crónica) pues el virus, si está presente, se
concentrará entonces en el órgano linfoide (19, 26). Para realizar una prueba no letal
con reproductores, se pueden tomar muestras de la hemolinfa y usarlas mediante
inyección IM para exponer al langostino indicador (26).
Para realizar el bioensayo para el TSV por inyección IM:
i)
Se preparan cabezas de langostinos sospechosos o langostinos completos en
tampón TN (para la composición de este tampón, véase el capítulo 3.2.6, Necrosis
hematopoyética e hipodérmica infecciosa), a una relación 1:2 o 1:3, o en solución salina
estéril al 2% preparada con agua destilada.
ii)
Se homogeniza la mezcla en una trituradora o en batidora. Hay que evitar calentar
la muestra con una homogenización o trituración excesiva. Durante todo el
protocolo las muestras, y el homogenado resultante, deben mantenerse en frío,
conservándose en hielo.
iii) Se clarifica el homogenado por centrifugación a 3.000 g durante 10 minutos. Se
decanta y se conserva el sobrenadante líquido. Se desecha el precipitado.
iv) El sobrenadante líquido se centrifuga a 27.000 g durante 20−30 minutos a 4°C. Se
decanta y se conserva el sobrenadante líquido. Se desecha el precipitado.
v)
Se diluye el sobrenadante del paso iv de 1/10 a 1/100 con solución salina estéril al
2%. Esta solución puede usarse entonces como inóculo para inyectar a los
langostinos indicadores (o bien, se esteriliza por filtración como se describe en el
paso (vi)).
vi) Se filtra el sobrenadante diluido del paso v, usando una jeringa estéril (cuyo tamaño
depende del volumen final del sobrenadante diluido) y un filtro estéril para jeringa
con 0,45 µm de tamaño de poro. Puede que haya que usar varios filtros, pues se
taponan fácilmente. El filtrado debe recogerse en un tubo de ensayo o un vaso
estéril. La solución puede guardarse entonces congelada (se recomienda a –20°C
para guardar a corto plazo [semanas] y –80°C para guardar a largo plazo [de meses
a años]) o bien se emplea inmediatamente para inyectar al langostino indicador.
vii) El langostino indicador debe proceder de los existencias de P. vannamei SPF
susceptibles al TSV (como por ejemplo del ‘stock Kona’) (42), que están
comercialmente disponibles en varias firmas americanas, y no de líneas
seleccionadas de producción que se conoce que son resistentes al TSV.
viii) Se inyecta 0,01 ml por gramo de peso corporal, mediante jeringas de tuberculina de
1 ml. El langostino indicador debe inyectarse intramuscularmente en el tercer
segmento de la cola. Si el langostino indicador muere a los pocos minutos de la
inyección, el inóculo contiene excesiva cantidad de material proteico y debe
entonces diluirse más antes de inyectar a langostinos indicadores adicionales. La
muerte súbita que ocurre post-inyección se denomina “shock proteico” y es el
resultado de la coagulación sistémica de la hemolinfa del langostino en respuesta al
inóculo.
ix) Las muestras de hemolinfa pueden diluirse (1/10 o 1/20 en tampón TN),
esterilizarse por filtración (si es necesario), e inyectarse en el langostino indicador
sin más preparación.
x)
Si el TSV está presente en el inóculo, el langostino indicador debe empezar a morir
a las 24–48 horas post-inyección. Menores dosis de virus pueden tardar más en
establecer la infección letal, y los langostinos deben ser observados durante al
menos 10–15 días post-inyección.
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xi) La presencia (o ausencia) del TSV en el langostino indicador debe confirmarse por
análisis histológico de langostinos moribundos fijados con solución de Davidson (y
mediante ISH con sonda génica, si se dispone de ella).
Como variación de la técnica de bioensayo, se puede utilizar un sistema de “langostino
centinela”. Por ejemplo, pequeñas formas juveniles de L. vannamei SPF que son
sensibles al TSV se pueden mantener en los viveros en jaulas de red, o en el mismo
sistema de agua, con otros langostinos de estado desconocido respecto al TSV,
actuando así como bioensayo para la presencia de agentes infecciosos como el TSV.
• Métodos de detección de antígenos basados en anticuerpos: Se puede usar MAb para la
detección del TSV en pruebas de muestras de hemolinfa, de homogenados de tejidos o
de cortes de tejidos de langostino fijados con solución de Davidson (12, 13, 48). Puede
usarse el MAb 1A1 contra el TSV para distinguir algunas variantes o “cepas” del TSV
de otras cepas (12, 13) (véase la sección 2.a de este capítulo para más información sobre
los tipos de TSV determinados por su reacción frente al MAb 1A1).
Método de inmunoensayo de transferencia puntual:
i)
Para el método de inmunoensayo de transferencia puntual, se puntea sobre la
superficie de placas de ensayo MA-HA-N45 (Millipore, South San Francisco,
California [CA], USA) 1 µl del antígeno de prueba (virus purificado, hemolinfa de
gamba infectada o hemolinfa de langostino SPF).
ii)
Después de secar al aire, los pocillos se bloquean 1 hora a temperatura ambiente
con 200 µl de un tampón que contiene solución salina tamponada con fosfato y
0,05% de Tween 20 (PBST) mezclada con 10% de suero normal de cabra (Life
Technologies, Gibco BRL) y 2% de caseína Hammersten (Amersham Life
Sciences, Arlington Heights, Illinois, USA).
iii) Se lavan los pocillos tres veces con PBST y luego reaccionan con 100 µl del
anticuerpo primario (MAb o anticuerpos policlonales de ratón) durante 30 minutos
a temperatura ambiente.
iv) Para detección se usa como anticuerpo secundario IgG anti-ratón de cabra
marcada con fosfatasa alcalina, específico para la cadena γ (Zymed, South San
Francisco, CA), diluido 1/1000 en PBST mas 10% de suero normal de cabra
(30 minutos a temperatura ambiente).
v)
Después de lavar tres veces con PBST, una vez con PBS y una vez con agua
destilada, las reacciones se visualizan dejando desarrollar durante 15 minutos a
temperatura ambiente con nitroazul de tetrazolio y bromocloroindolil fosfato
(Roche Diagnostics, Corp.) en tampón Tris-NaCl (100 mM cada uno) que contiene
50 mM de MgCl2, pH 9,5.
vi) Las reacciones se detienen con agua destilada.
vii) Las reacciones se gradúan siguiendo una escala de 0 a +4, donde la reacción de
mayor intensidad es equivalente a la reacción generada usando el MAb contra el
control de referencia que consiste en TSV semipurificado. Una reacción negativa
es aquella en la que no es visible ninguna mancha coloreada en el pocillo.
Otros métodos basados en anticuerpos:
El MAb 1A1 contra el TSV se puede aplicar a otros formatos de pruebas basadas en
anticuerpos (por ejemplo, a pruebas de inmunofluorescencia indirecta [IFI] o de
inmunohistoquímica [IHC] con frotis de tejidos, cortes congelados, o tejidos fijados y
desparafinados). El MAb 1A1 puede aplicarse para uso en un formato de IHC
utilizando cortes de tejidos fijados con solución de Davidson (12, 13).
398
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo 2.3.1. — Síndrome de Taura
Se recomienda que los resultados inesperados basados en pruebas con MAb contra el
TSV sean interpretados en el contexto de los síntomas clínicos, con la historia del caso,
y junto con resultados de otras pruebas (por ejemplo, de la prueba de la PCR con
transcripción inversa ([RT]-PCR), hallazgos histológicos o ISH con una sonda específica
de ADN para el TSV – véanse las correspondientes secciones de este capítulo).
• Métodos moleculares: se han desarrollado pruebas de ISH y de TR-PCR para el TSV y
hay variedades de ambos métodos comercialmente disponibles. El método del
inmunoensayo de transferencia puntual para la detección del TSV no está disponible.
• Sondas de ADN para aplicaciones de ISH, con sondas de cADN no radiactivo. Las
sondas no radioactivas de cADN marcadas con DIG para el TSV se pueden obtener en
el laboratorio o adquirir de fuentes comerciales. El método de ISH proporciona mayor
sensibilidad diagnóstica que los métodos tradicionales para la detección y diagnóstico
del TSV que emplean métodos histológicos clásicos (18, 26, 28, 31, 40). El ensayo de
ISH de cortes histológicos rutinarios de lesiones de fase aguda y de transición en el
epitelio cuticular, en otros tejidos, y de los LOS en la fase de transición y en la fase
crónica mediante una sonda cADN específica marcada con DIG contra el TSV,
proporciona un diagnóstico definitivo de infección por TSV (18, 19, 26, 27). Las
lesiones patognomónicas positivas para el TSV muestran áreas destacadas de color azul
a azul-negro en el citoplasma de las células afectadas cuando reaccionan con las sondas
de cADN. Los fragmentos nucleares y los núcleos picnóticos que contribuyen a la
aparición patognomónica de los “perdigones” en las lesiones de ST no reaccionan con
la sonda (26, 27, 40). (Véase el capítulo 2.3.6, IHHN, para detalles del método de ISH.
Véase el capítulo I.3, sección 4.2 para una información detallada sobre el uso del fijador
AFA de Davidson).
En los tejidos fijados según Davidson pueden ocurrir negativos falsos de ISH si los
tejidos se dejan en el fijador por más de 24–48 horas. El bajo pH del fijador de
Davidson causa una hidrólisis ácida del ARN monocatenario del genoma del TSV,
originando resultados negativos que son falsos. Este artefacto puede evitarse usando
fijadores neutros, que incluyen el fijador ARN compatible desarrollado para langostinos,
o con el uso debido del fijador de Davidson (evitando tiempos de fijación superiores a
24 horas) (17, 26, 31).
•
RT-PCR: las muestras de tejido (hemolinfa, pleópodos, langostinos pequeños
completos, etc.) se pueden ensayar para el TSV usando RT-PCR. Los cebadores
llamados 9195 y 9992, amplifican una secuencia de 231 pares de bases (pb) del genoma
del TSV (44). El fragmento amplificado corresponde a una secuencia conservada que se
localiza en la región intergénica y en la ORF 2 del TSV. El cebador 9992F se localiza
cerca del extremo 3’ de la región intergénica y el 9195R se localiza en la ORF 2 dentro
de VP2 (= CP1) (41, 44).
Método
Cebador
Producto
Secuencia
9992F
231 pb
5’-AAG-TAG-ACA-GCC-GCG-CTT-3’
55
69°C
5’-TCA-ATG-AGA-GCT-TGG-TCC-3’
50
63°C
9195R
Relación G:C Temperatura
El método de RT-PCR indicado a continuación para TSV sigue en general el descrito
por Nunan et al. (44).
i)
Preparación del ARN molde: el ARN se puede extraer de tejidos frescos,
congelados o conservados en etanol. La extracción del ARN debe realizarse
usando equipos comerciales disponibles de extracción de ARN, como el High Pure
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
399
Capítulo 2.3.1. — Síndrome de Taura
ARN Tissue Kit (Roche, Penzberg, Germany), y siguiendo los procedimientos del
fabricante para producir moldes ARN de calidad.
ii)
El ensayo por RT-PCR se hace en solución, usando como molde 10 µl de ARN
total extraído de la hemolinfa, tejidos congelados de langostino, o tejidos fijados
con etanol (concentración de ARN = 1–100 ng/ml).
iii) En cada ensayo de RT-PCR para TSV, se deben de incluir los siguientes controles:
a) una muestra de tejido que se sepa que es TSV-negativa; b) una muestra conocida
como TSV-positiva (tejido o virus purificado); y c) un control sin molde.
iv) Para todas las reacciones de amplificación descritas aquí se emplea el GeneAmp®
EZ rTth ARN PCR kit (Applied Bioscience, Forster City, CA).
v)
Las condiciones óptimas de la RT-PCR (concentraciones finales en un volumen
total de 50 µl) para detectar el TSV en muestras de tejido de langostino son:
cebadores (0,46 µM cada uno), dNTPs (300 µM cada uno), ADN polimerasa rTth
(2,5 U/50 µl), acetato de manganeso (2,5 mM), en 5 × tampón EZ (25 mM Bicine,
57,5 mM de acetato potásico, 40% [p/v] glicerol, pH 8,2).
vi) Si el termociclador no tiene una tapadera térmica, se pone aceite mineral ligero
(50 µl) sobre los 50 µl de mezcla de reacción para evitar la condensación o
evaporación durante los ciclos térmicos.
vii) Se combina el ARN molde con todos los reactivos y se deja avanzar la
transcripción inversa a 60ºC durante 30 minutos, seguido de 94°C durante
2 minutos.
Nota: Las condiciones de reacción descritas aquí fueron las óptimas en un
termociclador automático GeneAmp 980 (Applied Biosystems). Las condiciones
deben optimizarse para cada termociclador empleando controles positivos
conocidos.
viii) Al terminar la transcripción inversa, las muestras se amplifican 40 ciclos en las
siguientes condiciones: desnaturalización a 94°C durante 45 segundos, y luego
hibridación/extensión a 60°C durante 45 segundos. Al último ciclo le sigue un
paso de extensión final durante 7 minutos a 60°C, y el proceso termina en una fase
de estabilización a 4°C.
ix) Después de la terminación de la RT-PCR, las soluciones con el cADN amplificado
se extraen de debajo del aceite mineral y se colocan en tubos limpios de microfuga
de 0,5 ml.
x)
Una muestra de 10 µl del producto amplificado se puede añadir a un gel de agarosa
al 2,0%, teñido con bromuro de etidio (0,5 g/ml), y realizar una electroforesis en
0,5 × TBE (Tris, ácido bórico, ácido etiléndiamino tetraacético [EDTA]).
xi) Como marcador se utiliza una muestra de ADN con graduaciones de 1 kb
(Invitrogen, Carlsbad, CA).
xiii) En el capítulo 2.3.6 IHHN, pueden encontrarse detalles de la composición de los
reactivos y tampones.
• Método de PCR en tiempo real para TSV: Se han desarrollado métodos de RT-PCR en
tiempo real para la detección del TSV. Estos métodos tienen ventajas en cuanto a
rapidez, especificidad y sensibilidad. La sensibilidad de la RT-PCR en tiempo real es
~100 copias de la secuencia diana del genoma del TSV (10, 55).
El método de la RT-PCR en tiempo real usando TaqMan, que se describe a
continuación para el TSV, sigue el método empleado por Tang et al. (55).
400
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo 2.3.1. — Síndrome de Taura
i)
Los cebadores de PCR y la sonda TaqMan se seleccionaron de la región ORF1 que
codifica las proteínas no estructurales en la secuencia genómica del TSV (GenBank
AFAF277675). Los cebadores y la sonda TaqMan se designaron por el sistema
Primer Express (Applied Biosystems). Las secuencias de los cebadores aguas arriba
(TSV1004F) y aguas abajo (TSV1075R) son las siguientes: 5’-TTG-GGC-ACCAAA-CGA-CAT-T-3’ y 5’-GGG-AGC-TTA-AAC-TGG-ACA-CAC-TGT-3’),
respectivamente. La sonda TaqMan, TSV-P1 (5’-CAG-CAC-TGA-CGC-ACAATA-TTC-GAG-CAT-C-3’), que corresponde a la región entre los nucleótidos
1024 hasta el 1051, se sintetiza y se marca con los colorantes fluoresecentes 5carboxifluoresceína (FAM) en el extremo 5’, y con N,N,N’,N’-tetrametil-6carboxirodamina (TAMRA) en el extremo 3’ (Applied Biosystems, catálogo no.
450025).
ii)
Preparación del ARN molde: la extracción y purificación del ARN molde a partir
de la hemolinfa o del tejido de langostino, es la misma que se describe en la sección
para la RT-PCR tradicional.
iii) La mezcla de reacción para RT-PCR contiene: mezcla maestra para RT-PCR
TaqMan One-step (Applied Biosystems, parte no. 4309169), 0,3 µM de cada cebador,
0,1 µM de la sonda TaqMan, 5–50 ng de ARN, y agua en un volumen de reacción
de 25 µl. Para mejores resultados, la mezcla de reacción debe someterse a vórtex y
mezclarse bien.
iv) La amplificación se realiza con el GeneAmp 5700 Sequence Detection System (Applied
Biosystems; también puede usarse ABI PRISM 7000, 7300, o 7500). Los ciclos
consisten en transcripción inversa a 48°C durante 30 minutos y desnaturalización
inicial a 95°C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95°C
durante 15 segundos e hibridación/extensión a 60ºC durante 1 minuto.
v)
Al final de la reacción, se toman medidas de fluorescencia en tiempo real con un
sistema de cámara acoplada (CCD). Se establece un umbral por encima de la línea
base que comienza a detectar el aumento de la señal asociada al incremento
exponencial del producto de la PCR. Las muestras se consideran negativas si el
valor Ct (ciclo umbral) es de 40 ciclos. Las muestras con valores Ct menores que
40 ciclos se consideran negativas. Para confirmar los resultados de la RT-PCR en
tiempo real, se somete a electroforesis una alícuota del producto de la RT-PCR en
un gel de agarosa con 4% de bromuro de etidio y se fotografía. En las muestras
que son positivas para el TSV se puede visualizar un fragmento de ADN de 72-pb.
vi) Es necesario incluir en cada reacción un “control sin molde” al objeto de excluir la
presencia de contaminantes fluorescentes en la mezcla de reacción o en el bloque
de calentamiento del termociclador. También debe incluirse un control positivo,
que puede ser un ARN transcrito in vitro que contenga la secuencia diana, o ARN
extraído de tejido infectado por el TSV.
4. CLASIFICACIÓN DE LAS PRUEBAS SEGÚN LA FINALIDAD
Los métodos actualmente disponibles para la vigilancia, detección y diagnóstico del TSV se presentan
en el cuadro 1. Las designaciones que aparecen en el cuadro indican: A= el método es recomendado
por razones de disponibilidad, utilidad, especificidad y sensibilidad diagnóstica; B= el método es un
método estándar con buena sensibilidad y especificidad diagnóstica; C= el método tiene aplicación en
algunas situaciones, pero su coste, exactitud y otros factores limitan notablemente su aplicación; y D=
el método no se recomienda actualmente para este propósito. Estas designaciones son algo subjetivas
ya que la adecuación incluye aspectos de seguridad, sensibilidad, especificidad y utilidad. Aunque no
todas las pruebas asignadas a la categoría A o B han pasado por una estandarización y validación
formal (ver Capítulo 1.1.2), su naturaleza rutinaria y el hecho de que se han usado ampliamente sin
resultados dudosos las hace aceptables.
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
401
Capítulo 2.3.1. — Síndrome de Taura
Cuadro 1. Métodos de vigilancia, detección y diagnóstico del TSV
Método
Vigilancia
Presuntiva
Confirmativa
C
B
C
D
D
C
C
D
C
D
C
D
D
B
B
B
A
A
MET
D
D
D
D
C
C
Ensayos con anticuerpo
D
D
C
C
B
B
Sondas de ADN in situ
D
D
B
B
A
A
RT-PCR
A
A
A
A
A
A
Secuenciación
D
D
D
D
D
A
Larvas
PLs
Juveniles
Adultos
Síntomas generales
D
D
C
Bioensayo
D
D
MCC directa
D
Histopatología
PLs = postlarvas; MCC = microscopía de campo claro; MET = microscopía electrónica de transmisión;
RT-PCR = reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa
5. CRITERIOS DE DIAGNÓSTICO CONFIRMATIVO
a)
Definición de un caso sospechoso
Altas mortalidades repentinas en las formas PLs tardías, juveniles o subadultas de L. vannamei o
de L. stylirostris en regiones donde el TSV es enzoótico.
Presencia repentina de numerosas aves marinas “pescando” en uno o más criaderos de langostino
(gaviotas, cormoranes, garzas, golondrinas marinas, etc.)
Muestras de L. vannamei o L. stylirostris cultivadas procedentes de los viveros que sirven de
alimentación a abundantes aves marinas, que presentan síntomas evidentes en fase aguda o de
transición, tales como una coloración general rojiza, letargia, caparazones blandos, intestino vacío,
y presencia de numerosas manchas negras irregulares en la cutícula.
Demostración de focos de necrosis en el epitelio cuticular a bajo aumento al examinar los bordes
de apéndices tales como los urópodos, los pleópodos o las branquias (es decir, con una lupa de
mano de ×10 o por examen microscópico directo de preparaciones con montaje en húmedo).
b)
Definición de un caso confirmado
Cualquier combinación de al menos dos de los tres métodos siguientes (con resultados positivos):
Demostración histológica de un diagnóstico basado en lesiones de fase aguda por el TSV,
especialmente en el epitelio cuticular del tubo digestivo anterior (esófago, cámaras anteriores o
posteriores del estómago) y/o en las branquias, apéndices, o cutícula general. Tales lesiones,
producidas por el TSV, son patognomónicas para ese virus solo cuando ocurren sin una necrosis
aguda acompañante (con picnosis y cariorrexis nuclear) en las células parenquimatosas de los
túbulos del órgano linfoide.
ISH (con una sonda de ADN específica para el TSV) o IHC (con MAb 1A1) que den una señal
histológica positiva para lesiones de tipo TSV en fase de infección aguda, de transición o crónica.
No obstante, los resultados negativos de ISH con el MAb 1A1 deben interpretarse con
precaución, ya que no todas las cepas de TSV reaccionan con el MAb 1A1.
Resultados positivos de RT-PCR para TSV.
402
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo 2.3.1. — Síndrome de Taura
6. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO/DETECCIÓN PARA DECLARAR LA AUSENCIA DE INFECCIÓN
Dos años de historia con resultados negativos en las pruebas para TSV, empleando los métodos
descritos en la sección 5.b para muestras del tipo y tamaño adecuado (véase el capítulo I.3, sección 3).
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NB: Existe un laboratorio de referencia de la OIE para el síndrome de Taura (véase el cuadro al final de
este Manual de animales acuáticos o consúltese la página Web de la OIE para una lista más actualizada:
www.oie.int).
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Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006