Download virosis mortal de los reproductores

NB: Esta enfermedad ya no aparece en la lista
del capítulo 1.2.3 del Código de animales acuáticos.
Este capítulo no ha sido actualizado desde 2003.
CAPÍTULO 2.3.8.
VIROSIS MORTAL DE LOS REPRODUCTORES
RESUMEN
La virosis mortal de los genitores (VMR), debida al virus de la mortalidad de los reproductores (SMV)
fue reconocida por primera vez en hembras de Penaeus monodon en una estación de investigación en el
norte de Queensland, Australia.
El SMV es uno de los muchos virus asociados con el síndrome de la mortalidad a mitad del ciclo de
producción (SMMCP) que causó una mortalidad importante entre los juveniles y los subadultos de los P.
monodon cultivados en Australia desde 1994 hasta 1996. En Filipinas, se halló que el langostino
jumbo P. monodon infectado con luminous vibriosis también estaba infectado con SMV (1). La
infección y la enfermedad causadas por el SMV se han descrito solamente en P. monodon adultos
silvestres cultivados o cautivos y en Cherax quadricarinatus cultivada (4).
El virus de la VMR se ha clasificado provisionalmente como un parvovirus (2). El análisis de especimenes
enfermos de la especie P. monodon mediante microscopía electrónica de transmisión ha revelado la presencia
de partículas víricas con un diámetro aproximado de 20 nm, tienen una forma hexagonal que sugiere una
simetría icosaédrica. Se han observado acumulaciones de estas partículas de 2 nm de diámetro en formaciones
masivas en el citoplasma de las células intestinales infectadas y los viriones parece que surgen a través de los poros
de la membrana nuclear (2). La caracterización parcial del virus se consiguió mediante el tratamiento de
extractos de tejido de camarón infectado con ADNasa y ARNasa. Estas pruebas indicaron posteriormente
que el SMV es un virus de ADN, probablemente un paravovirus (2).
No existen en la actualidad métodos prácticos para la vigilancia de virosis mortal de los genitores (VMR)
en los langostinos peneidos. El diagnóstico confirmativo de laVMR se puede realizar mediante microscopia
electrónica de transmisión con tejidos intestinales.
TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
No existen ni síntomas clínicos ni lesiones histopatológicas que ayuden al diagnóstico asociadas con la
enfermedad de la mortandad esporádica de los reproductores. El diagnóstico de laVMG se basa en la
microscopía. Se están desarrollando métodos moleculares en los que se utilizan sondas de genes
etiquetadas como no radiactivas para el diagnóstico de la infección por SMV.
En el cuadro 1 aparecen relacionados los diferentes métodos para la vigilancia, detección y diagnóstico de
las infecciones causadas por el SMV. Las designaciones utilizadas en el cuadro indican; − = en la
actualidad el método no está disponible y no es adecuado; += el método es menos apropiado; ++= el
método es moderadamente adecuado; +++= el método es muy adecuado; y R&D = el método se está
desarrollando, pero aún no está disponible a través de fuentes comerciales. Estos métodos son en cierto
modo subjetivos ya que la conveniencia de su utilización está ligada a su fiabilidad, sensibilidad y utilidad.
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Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo 2.3.8. — Virosis mortal de los genitores
Cuadro 1. Vigilancia, detección y métodos de diagnóstico de la VMR
Método
Larvas
Detección
PostJuveniles
larvas
Adultos
Presuntivo
Confirmativo
Síntomas generales
−
−
−
−
−
−
CC/MO directas
−
−
−
−
−
−
MO de campo oscuro
−
−
−
−
−
−
Histopatología
−
−
−
−
−
−
Bioensayo
−
−
−
−
−
−
MET
−
+
+
+
+++
+++
Escaneo con ME
−
−
−
−
−
−
Anticuerpo fluorescente
−
−
−
−
−
−
ELISA con PAb/MAb
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−
Sondas de ADN – in situ
R&D
R&D
R&D
R&D
R&D
R&D
PCR/RT-PCR
R&D
R&D
R&D
R&D
R&D
R&D
Sondas de ADN – dot-blot
PLs = post-larvas; CC = campo claro; MO = microscopía óptica; MET = microscopía electrónica de transmisión; ME =
microscopía electrónica; ELISA = enzimoinmunoensayo; PAb/MAb = anticuerpos poli/monoclonales; RT-PCR = reacción en
cadena de la polimerasa de trascripción inversa.
Procedimientos de muestreo: véase el capítulo I.3.
1. MÉTODOS ESTÁNDAR DE DETECCIÓN PARA DEL SMV
1.1. Método histológico
Los cambios histopatológicos asociados con la VMR no son específicos, por ejemplo, la VMR no
puede ser diagnosticada por histopatología. Los cambios histopatológicos no específicos pueden
ocurrir en el hepatopáncreas, en el intestino medio y en el intestino ciego. P. monodon juveniles
infectados experimentalmente con extractos de tejido procedentes de langostinos
clínicamente enfermos por la VMR muestran infiltración hemocítica, necrosis y descamación
de las células en la luz del intestino medio y del hepatopáncreas (2). Sin embargo, no se siempre se
observa esto (figura 2 de la ref. 3).
1.2. Métodos moleculares
Se ha desarrollado una sonda llamada ADN no radioactiva y una prueba de PCR (en forma de kit)
(3, 4). Actualmente se está negociando la disponibilidad comercial de estos kits.
2. MÉTODOS DE DIGNÓSTICO PRESUNTIVO DEL SMV
2.1. Síntomas clínicos
No existen síntomas clínicos específicos para la VMR. Los langostinos juveniles que proceden de
estanques de crecimiento y están afectados por infecciones víricas clínicas pueden mostrar signos
tales como decoloración, letargo, suciedad y anorexia.
2.2. Métodos moleculares
Véase la sección 1.2.
2.3. Método del bioensayo
Este bioensayo confirmará la presencia del virus patógeno, pero no identifica el virus específico.
La presencia de cualquier virus patógeno puede ser detectada utilizando un bioensayo
relativamente simple en el cual un P. monodon juvenil saludable (libre del patógeno específico
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Capítulo 2.3.8. — Virosis mortal de los genitores
[SPF], si está disponible), es expuesto a langostinos sospechosos bien sea mediante la
alimentación con tejidos de langostinos sospechosos o inyectándole con extractos de tejidos
celulares libres preparados a partir de langostinos sospechosos. Fraser & Owens (2) describen
que la VMR podría ser transmitida por vía oral mediante la alimentación con canales infectadas o
por inyección de extractos de células libres preparadas a partir de canales infectadas. Con la
inyección intramuscular de extractos de células libres, la mortalidad comienza a los 14 días
después de la inoculación y alcanza el 100% a los 30 después de la inoculación. El desarrollo de la
enfermedad en los langostinos indicadores del bioensayo seguido de la exposición en sí misma,
requiere más tiempo. Las primeras muertes ocurren a los 30 después de la inoculación y alcanzan
una mortalidad del 76% a los 50 días después de la inoculación (2).
Para realizar este bioensayo, se utiliza el siguiente protocolo general:
i)
Se prepara una mezcla, en una proporción de 1:2 o 1:3 (p:v), de cabezas de langostino
sospechoso de SMV o de langostinos enteros con tampón TN (para la composición de este
tampón, véase el capítulo 2.3.6 sobre el virus de la necrosis hipodérmica y hematopoyética
infecciosa) o con solución salina estéril al 2% preparada con agua destilada.
ii)
Se homogeneiza la mezcla con un triturador o un homogeneizador de tejidos. Se debe
procurar que no se caliente la mezcla por exceso de trituración u homogeneización. Los
tejidos y el homogeneizado resultante se deben guardar frescos durante todo el protocolo
manteniéndolos en hielo.
iii) Se clarifica el homogeneizado por centrifugación a 3.000 g durante 10 minutos. Se decanta el
sobrenadante y se guarda. Se desecha el precipitado.
iv) Se centrifuga el líquido sobrenadante a 27.000 g (15.000 rpm) durante 20−30 minutos a 4°C.
Se decanta el líquido sobrenadante y se guarda. Se desecha el precipitado.
v)
Se diluye el líquido sobrenadante obtenido en el paso (iv) de 1/10 a 1/100 con solución
salina al 2% estéril. Esta solución ya se puede usar como inóculo para inyectar a los
langostinos indicadores (o esterilizarse por filtración tal como se describe en el paso (vi)).
vi) Se filtra el sobrenadante diluido obtenido en el paso (v) utilizando una jeringa estéril (el
tamaño depende del volumen final del sobrenadante diluido) y un filtro de jeringa estéril de
0,45 µm. Es posible que haya que utilizar muchos filtros, ya que se obstruyen con facilidad.
El filtrado se debe depositar en un tubo o vaso de ensayo estéril. Se puede guardar la
solución después de congelarla (a -20ºC para su almacenamiento durante un periodo corto
[de varias semanas], y a -80ªC para su almacenamiento durante períodos largos [durante
meses o años]) o se puede usar de inmediato para inyectar a los langostinos indicadores.
vii) Los langostinos indicadores deben proceder de existencias de P. monodon sano (a ser posible
SPF).
viii) Se inyecta 0,01 de solución por cada gramo de peso corporal utilizando una jeringa de
tuberculina de 1 ml. A los langostinos indicadores se les debe poner una inyección
intramuscular en el tercer segmento de la cola. Si los langostinos de prueba comienzan a
morir a los pocos minutos de recibir la inyección, se debe a que el inóculo contiene una
cantidad excesiva de material proteico, por lo que deberá diluirse más antes de seguir
inyectándoselo a más langostinos indicadores. La muerte repentina que ocurre después de la
inyección se conoce como el “shock proteico”, y se debe a la coagulación sistémica de la
hemolinfa del langostino como consecuencia del inóculo.
ix) Se pueden diluir (a 1/10 o 1/20 en tampón TN) muestras de extracto acelular, se pueden
esterilizar por filtración (si está justificado), e inyectar en los langostinos indicadores sin más
preparación.
x)
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Si el virus patógeno está presente en el inóculo, los langostinos indicadores comenzarán a
morir.
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xi) La presencia de SMV en los langostinos indicadores debe confirmarse mediante microscopía
electrónica de transmisión (y por hibridación in situ mediante una sonda génica, si hay alguna
disponible).
3. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO CONFIRMATIVO DELA VMG
La confirmación de la infección por SMV en langostinos puede conseguirse por medio del siguiente
método:
3.1. Microscopía electrónica de transmisión
El método es esencialmente el de Fraser y Owens (2). Se sedan los langostinos moribundos en
agua fría y luego se extraen los órganos pertinentes y se colocan en placas de Petri que contengan
2,5% de glutaraldehído en tampón de cacodilato 0,1 M, pH 7,1. Los tejidos se cortan en cubos de
1mm, se fijan durante 30 minutos a temperatura ambiente (24ºC) y luego se lavan dos veces en
tampón de cacodilato 0,1 M durante 10 minutos. Las muestras se almacenan en tampón de
cacodilato a 4ºC. Antes de la inclusión, las muestras se fijan de nuevo en tetraóxido de osmio al
1% en tampón de cacodilato 0,1 M durante una hora a 24ºC. y luego se lavan dos veces durante
10 minutos con el mismo tampón. Las muestras fijadas de nuevo se deshidratan y se incluyen en
resina de Spurr. Las secciones se tiñen con acetato de uranilo al 2% en etanol al 50% acidificado
con ácido clorhídrico durante 7 minutos, se lavan 4 veces con agua destilada y se hace un bloque
en seco. Luego las secciones se tiñen con acetato de plomo durante 2 minutos y se repite el
lavado. Los agregados de partículas similares a los virus se encuentran asociados con la membrana
nuclear en el citoplasma de las células intestinales. Los viriones tienen aproximadamente entre 20–
25 nm de diámetro (3), y tienen una forma hexagonal que sugiere una simetría icosaédrica. Los
viriones de SMV no se encuentran en otros tejidos que no sean los del intestino.
3.2. Métodos moleculares
Véase la sección 1.2.
REFERENCIAS
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ALBALADEJO J.D., TAPAY L.M., MIGO V.P., ALFAFARA C.G., SOMGA J.R., MAYO S.L., MIRANDA
R.C., NATIVIDAD K., MAGBANUA F.O., ITAMI T., MATSUMURA M., NADALA E.C.B., JR. & LOH P.C.
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T.W., ed. National Center for Genetic Engineering and Biotechnology, Bangkok, Thailand, 251−254.
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Dis. Aquat. Org., 27, 141−148.
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OWENS L., HAQSHENAS G., MCELNEA C., & COELEN R. (1998). Putative spawner-isolated mortality
virus associated with mid-crop mortality syndrome in farmed Penaeus monodon from northern
Australia. Dis. Aquat. Org., 34, 177−185.
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OWENS L. & MCELNEA C. (2000). Natural infection of the redclaw crayfish cherax quadricarinatus
with presumptive spawner-isolated mortality virus. Dis. Aquat. Org., 40, 219−223.
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