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Use of PCR testing for foot and mouth disease under emergency conditions.
Uso de la prueba de reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) para el
diagnóstico emergencial del virus de la fiebre aftosa.
*Malirat, V & Bergmann, I., Centro Panamericano de Fiebre Aftosa, OPS/OMS.
Caixa Postal 589. CEP:20010-974. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Summary: Identification of animals infected with foot-and-mouth disease virus
(FMDV), either clinically or subclinically infected, during a sanitary emergency
should be particularly sensitive in those areas with advanced eradication programs. In
this regard, development and validation of rapid and precise methods for detection
and viral characterization becomes essential within the Hemispheric Program for the
Eradication of Foot-and-Mouth Disease (PHEFA) The Polymerase Chain Reaction
method (PCR) was evaluated for its potential use for identification of the agent during
emergencies, as well as for its fast `typing`.
Four primer pairs were selected. One of them directed to a more conserved region of
the viral genome, which corresponds to the polymerase 3D coding region, in order to
identify the virus, regardless of the serotype. The other three pairs, flanked the region
that codes for the VP1protein, thus corresponding to type-specific regions defined for
each one of the three serotypes registered in South America (O, A and C). This
selection would permit the discrimination of the serotype involved. During the
validation process, the RNAs obtained from more than 100 viral strains representing
outbreaks registered between 1945 and 2002, encompassing the 3 serotypes and
epidemiologically relevant for the region, were evaluated. Whenever possible,
comparisons were done among amplifications obtained directly from epithelium
samples, from esophageal-pharyngeal fluids, or after passages in cell cultures. The
results obtained showed the effectiveness of the RT-PCR method not only to detect
with high sensitivity and in few hours, FMD viral sequences, but also for the
identification of the viral type involved, aiding in the diagnosis of foot-and-mouth
disease, particularly for field situations where a rapid response is requested, like those
in which effective eradication programs are in progress.
Introducción: La fiebre aftosa, enfermedad de origen viral y altamente contagiosa,
ha provocado considerables pérdidas en la historia de la producción pecuaria mundial.
Por este motivo, y desde que se conoce la naturaleza de su agente etiológico, los
esfuerzos para su control y erradicación han demandado la atención de los servicios
veterinarios a nivel mundial. Una de las actividades primordiales para el éxito de los
programas de control y erradicación de la fiebre aftosa es, sin duda, la identificación,
inequívoca y rápida del virus, y su diferenciación de otros agentes causales de
enfermedades vesiculares y confundibles con la fiebre aftosa. Ante el progreso de los
programas de erradicación implantados en el Continente a partir de 1988, cuando se
inicia el Plan Hemisférico de Erradicación de la Fiebre Aftosa (PHEFA), la
identificación de animales infectados con el virus de la fiebre aftosa en forma
inequívoca durante la atención de una emergencia sanitaria debe ser particularmente
sensible y rápida. En este sentido, el desarrollo y validación de métodos rápidos y
precisos de detección y caracterización viral se ha tornado esencial dentro del marco
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del PHEFA. El gran desarrollo que en los últimos años han alcanzado las técnicas de
biología molecular, ha permitido disponer de herramientas rápidas y sensibles, como
la reacción de cadena de la polimerasa (PCR), con enorme potencial para su uso en la
identificación del agente ante emergencias, inclusive permitiendo su rápida
tipificación, en algunos casos. En PANAFTOSA han sido implementados métodos
moleculares para la rápida detección y caracterización molecular del virus de la fiebre
aftosa (VFA). Fueron seleccionados iniciadores necesarios para la amplificación tanto
tipo específica como tipo inespecífica del VFA. El presente trabajo resume los
resultados preliminares obtenidos para la validación de esta metodología para el uso
rápido en la detección y tipificación molecular del VFA.
Materiales y Métodos: El RNA de aproximadamente 80 variantes de los tipos O , A
y C de América del Sur fue sometido a amplificación mediante la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) tipo específica y tipo inespecífica utilizando las metodologías
descriptas en Clavijo y cols, 2003 y en Malirat & Bergmann, 2002.
Resultados y Discusión: Fueron diseñados y/o seleccionados de la bibliografía,
cuatro pares de iniciadores. Un par, dirigido a un gen conservado (polimerasa 3D), el
cual permitió la identificación viral, independientemente del serotipo involucrado.
Los otros tres pares correspondían a regiones tipo-específicas definidas para cada uno
de los tres serotipos registrados en América del Sur (A, O, y C), que flanqueaban la
región que codifica para la proteína inmunogénica VP1, permitiendo la
discriminación del serotipo involucrado.
VFA
5’ Poli C
VPg
2A
L 1A 1B 1C
0
1
2
1D
2B
2C
3
4
KILOBASES
3A3B 3C
5
6
AAAAAAAA
3D
7
3’
8
PRIMERS
Tipo O
Tipo A
Tipo C
TIPIFICACIÓN
DETECCIÓN
EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR
Figura 1: Representación esquemática de la localización en el genoma del VFA de los iniciadores
seleccionados para las amplificaciones por PCR tipo-específico y tipo-inespecífico
Fueron ajustadas las condiciones de reacción necesarias a la amplificación
específica, utilizando los iniciadores seleccionados. Como se muestra en la figura 2,
los iniciadores seleccionados y las condiciones testadas permitieron la detección de
secuencias del VFA, sin discriminación del serotipo (entre los serotipos O, A y C,
estudiados), cuando se utilizaron los iniciadores dirigidos al gen 3D. Asimismo fue
posible registrar la amplificación tipo específica entre los serotipos O, A y C, cuando
se utilizaron los iniciadores adecuados a cada tipo. Una vez establecidas las
condiciones de amplificación tipo-específica y tipo-inespecífica, fueron testadas
diferentes variantes disponibles en el cepario de referencia de América del Sur,
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existente en PANAFTOSA, para la amplificación del RNA extraído de las mismas en
las diferentes condiciones. La tabla 1 resume los resultados obtenidos.
A24
C3 O1
A24
C3
O1
A24
A24
C3 O1
O1
C3
RNAs
1301 pb
911 pb
866 pb
521 pb
Iniciadores
A
C
3D
O
VP1
Figura 2: Amplificación con iniciadores tipo específicos (A, O y C) y tipo inespecíficos (3D) de
cepas prototipo del VFA
Tabla 1: Resultados de la amplificación con iniciadores tipo específicos (A, O y C) y tipo
inespecíficos (3D) de cepas del VFA circulantes en América del Sur
NÚMERO DE MUESTRAS AMPLIFICADAS POR PCR
TIPO-INESPECÍFICA (3 D)
• ADAPTADOS A
• DIRECTO de EPITELIO
CÉLULAS
A
63
(40 de la misma variante)
A
62
O
27
(10 de la misma variante)
20
O
C
17
TIPO-ESPECÍFICA (VP1)
• ADAPTADOS A
CÉLULAS
A
60
25
O
11
C
• DIRECTO de EPITELIO
62
20
LEF: Sólo fue posible amplificar a partir del 1er. pasaje
células (2 muestras)
A
O
(20 de la misma variante)
(15 de la misma variante y 9 de
otra misma variante)
de
En general, los resultados preliminares obtenidos con más de 80 cepas del
continente, muestran el potencial de la técnica de amplificación por PCR tanto para
ser usada en la detección (amplificación tipo-inespecífica) como en la tipificación
(amplificación tipo-específica) del VFA durante emergencias, constituyendo um
importante apoyo al diagnóstico de fiebre aftosa, particularmente para las situaciones
de campo en que se requiere una respuesta rápida como en las áreas en las que se
encuentra vigente el plan hemisférico de erradicación de la fiebre aftosa.
Referencias:
1- Malirat, V. y Bergmann, I.E. (2002). " Fiebre aftosa. Instrumentos moleculares para caracterización
viral: manual RT-PCR y secuenciamento cíclico para estudios de epidemiología molecular del virus de
la fiebre aftosa. Rio de Janeiro: Centro Panamericano de Fiebre Aftosa; 2002. 36 p
2 - Bergmann, I.E and Malirat, V. (1993)"Molecular approaches to laboratory diagnosis of persistent footand-mouth disease virus infection. A review". Bol. Cent. Panam. Fiebre Aftosa OPS/OMS 59: 166-177
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3 - Clavijo, A; Vieira-Pereira, PJ; Bergmann, IE (2003) “Use of the Reverse Transcription Polymerase
Chain Reaction (RT-PCR) for the rapid diagnosis of foot-and-mouth disease in South America”. Vet
Res Comm 27 (63-71)
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