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Use of PCR testing for foot and mouth disease under emergency conditions. Uso de la prueba de reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) para el diagnóstico emergencial del virus de la fiebre aftosa. *Malirat, V & Bergmann, I., Centro Panamericano de Fiebre Aftosa, OPS/OMS. Caixa Postal 589. CEP:20010-974. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. Summary: Identification of animals infected with foot-and-mouth disease virus (FMDV), either clinically or subclinically infected, during a sanitary emergency should be particularly sensitive in those areas with advanced eradication programs. In this regard, development and validation of rapid and precise methods for detection and viral characterization becomes essential within the Hemispheric Program for the Eradication of Foot-and-Mouth Disease (PHEFA) The Polymerase Chain Reaction method (PCR) was evaluated for its potential use for identification of the agent during emergencies, as well as for its fast `typing`. Four primer pairs were selected. One of them directed to a more conserved region of the viral genome, which corresponds to the polymerase 3D coding region, in order to identify the virus, regardless of the serotype. The other three pairs, flanked the region that codes for the VP1protein, thus corresponding to type-specific regions defined for each one of the three serotypes registered in South America (O, A and C). This selection would permit the discrimination of the serotype involved. During the validation process, the RNAs obtained from more than 100 viral strains representing outbreaks registered between 1945 and 2002, encompassing the 3 serotypes and epidemiologically relevant for the region, were evaluated. Whenever possible, comparisons were done among amplifications obtained directly from epithelium samples, from esophageal-pharyngeal fluids, or after passages in cell cultures. The results obtained showed the effectiveness of the RT-PCR method not only to detect with high sensitivity and in few hours, FMD viral sequences, but also for the identification of the viral type involved, aiding in the diagnosis of foot-and-mouth disease, particularly for field situations where a rapid response is requested, like those in which effective eradication programs are in progress. Introducción: La fiebre aftosa, enfermedad de origen viral y altamente contagiosa, ha provocado considerables pérdidas en la historia de la producción pecuaria mundial. Por este motivo, y desde que se conoce la naturaleza de su agente etiológico, los esfuerzos para su control y erradicación han demandado la atención de los servicios veterinarios a nivel mundial. Una de las actividades primordiales para el éxito de los programas de control y erradicación de la fiebre aftosa es, sin duda, la identificación, inequívoca y rápida del virus, y su diferenciación de otros agentes causales de enfermedades vesiculares y confundibles con la fiebre aftosa. Ante el progreso de los programas de erradicación implantados en el Continente a partir de 1988, cuando se inicia el Plan Hemisférico de Erradicación de la Fiebre Aftosa (PHEFA), la identificación de animales infectados con el virus de la fiebre aftosa en forma inequívoca durante la atención de una emergencia sanitaria debe ser particularmente sensible y rápida. En este sentido, el desarrollo y validación de métodos rápidos y precisos de detección y caracterización viral se ha tornado esencial dentro del marco Proceedings of the 10th International Symposium on Veterinary Epidemiology and Economics, 2003 Available at www.sciquest.org.nz del PHEFA. El gran desarrollo que en los últimos años han alcanzado las técnicas de biología molecular, ha permitido disponer de herramientas rápidas y sensibles, como la reacción de cadena de la polimerasa (PCR), con enorme potencial para su uso en la identificación del agente ante emergencias, inclusive permitiendo su rápida tipificación, en algunos casos. En PANAFTOSA han sido implementados métodos moleculares para la rápida detección y caracterización molecular del virus de la fiebre aftosa (VFA). Fueron seleccionados iniciadores necesarios para la amplificación tanto tipo específica como tipo inespecífica del VFA. El presente trabajo resume los resultados preliminares obtenidos para la validación de esta metodología para el uso rápido en la detección y tipificación molecular del VFA. Materiales y Métodos: El RNA de aproximadamente 80 variantes de los tipos O , A y C de América del Sur fue sometido a amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) tipo específica y tipo inespecífica utilizando las metodologías descriptas en Clavijo y cols, 2003 y en Malirat & Bergmann, 2002. Resultados y Discusión: Fueron diseñados y/o seleccionados de la bibliografía, cuatro pares de iniciadores. Un par, dirigido a un gen conservado (polimerasa 3D), el cual permitió la identificación viral, independientemente del serotipo involucrado. Los otros tres pares correspondían a regiones tipo-específicas definidas para cada uno de los tres serotipos registrados en América del Sur (A, O, y C), que flanqueaban la región que codifica para la proteína inmunogénica VP1, permitiendo la discriminación del serotipo involucrado. VFA 5’ Poli C VPg 2A L 1A 1B 1C 0 1 2 1D 2B 2C 3 4 KILOBASES 3A3B 3C 5 6 AAAAAAAA 3D 7 3’ 8 PRIMERS Tipo O Tipo A Tipo C TIPIFICACIÓN DETECCIÓN EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR Figura 1: Representación esquemática de la localización en el genoma del VFA de los iniciadores seleccionados para las amplificaciones por PCR tipo-específico y tipo-inespecífico Fueron ajustadas las condiciones de reacción necesarias a la amplificación específica, utilizando los iniciadores seleccionados. Como se muestra en la figura 2, los iniciadores seleccionados y las condiciones testadas permitieron la detección de secuencias del VFA, sin discriminación del serotipo (entre los serotipos O, A y C, estudiados), cuando se utilizaron los iniciadores dirigidos al gen 3D. Asimismo fue posible registrar la amplificación tipo específica entre los serotipos O, A y C, cuando se utilizaron los iniciadores adecuados a cada tipo. Una vez establecidas las condiciones de amplificación tipo-específica y tipo-inespecífica, fueron testadas diferentes variantes disponibles en el cepario de referencia de América del Sur, Proceedings of the 10th International Symposium on Veterinary Epidemiology and Economics, 2003 Available at www.sciquest.org.nz existente en PANAFTOSA, para la amplificación del RNA extraído de las mismas en las diferentes condiciones. La tabla 1 resume los resultados obtenidos. A24 C3 O1 A24 C3 O1 A24 A24 C3 O1 O1 C3 RNAs 1301 pb 911 pb 866 pb 521 pb Iniciadores A C 3D O VP1 Figura 2: Amplificación con iniciadores tipo específicos (A, O y C) y tipo inespecíficos (3D) de cepas prototipo del VFA Tabla 1: Resultados de la amplificación con iniciadores tipo específicos (A, O y C) y tipo inespecíficos (3D) de cepas del VFA circulantes en América del Sur NÚMERO DE MUESTRAS AMPLIFICADAS POR PCR TIPO-INESPECÍFICA (3 D) • ADAPTADOS A • DIRECTO de EPITELIO CÉLULAS A 63 (40 de la misma variante) A 62 O 27 (10 de la misma variante) 20 O C 17 TIPO-ESPECÍFICA (VP1) • ADAPTADOS A CÉLULAS A 60 25 O 11 C • DIRECTO de EPITELIO 62 20 LEF: Sólo fue posible amplificar a partir del 1er. pasaje células (2 muestras) A O (20 de la misma variante) (15 de la misma variante y 9 de otra misma variante) de En general, los resultados preliminares obtenidos con más de 80 cepas del continente, muestran el potencial de la técnica de amplificación por PCR tanto para ser usada en la detección (amplificación tipo-inespecífica) como en la tipificación (amplificación tipo-específica) del VFA durante emergencias, constituyendo um importante apoyo al diagnóstico de fiebre aftosa, particularmente para las situaciones de campo en que se requiere una respuesta rápida como en las áreas en las que se encuentra vigente el plan hemisférico de erradicación de la fiebre aftosa. Referencias: 1- Malirat, V. y Bergmann, I.E. (2002). " Fiebre aftosa. Instrumentos moleculares para caracterización viral: manual RT-PCR y secuenciamento cíclico para estudios de epidemiología molecular del virus de la fiebre aftosa. Rio de Janeiro: Centro Panamericano de Fiebre Aftosa; 2002. 36 p 2 - Bergmann, I.E and Malirat, V. (1993)"Molecular approaches to laboratory diagnosis of persistent footand-mouth disease virus infection. A review". Bol. Cent. Panam. Fiebre Aftosa OPS/OMS 59: 166-177 Proceedings of the 10th International Symposium on Veterinary Epidemiology and Economics, 2003 Available at www.sciquest.org.nz 3 - Clavijo, A; Vieira-Pereira, PJ; Bergmann, IE (2003) “Use of the Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) for the rapid diagnosis of foot-and-mouth disease in South America”. Vet Res Comm 27 (63-71) Proceedings of the 10th International Symposium on Veterinary Epidemiology and Economics, 2003 Available at www.sciquest.org.nz